菌種傳代與保藏

1、 菌種是從事微生物學(xué)及生命科學(xué)研究的基本菌種是從事微生物學(xué)及生命科學(xué)研究的基本材料，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，診斷制品的制備，菌苗的材料，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，診斷制品的制備，菌苗的生產(chǎn)、微生物致病性研究，藥物的抑菌試驗及藥生產(chǎn)、微生物致病性研究，藥物的抑菌試驗及藥品微生物檢驗等都有一套完整的菌種品微生物檢驗等都有一套完整的菌種. .微生物具微生物具有生命活力，有生命活力，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此菌種保藏是一項重要的基礎(chǔ)工作，是微生物因此菌種保藏是一項重要的基礎(chǔ)工作，是微生物學(xué)基礎(chǔ)工作的一項重要內(nèi)容，也是藥品微生物工學(xué)基礎(chǔ)工作的一項重要內(nèi)容，也是藥品微生物工作中的一項常

2、用技術(shù)。作中的一項常用技術(shù)。 一、菌種保藏的意義一、菌種保藏的意義 如藥品微生物學(xué)檢驗過程中，檢出的可疑如藥品微生物學(xué)檢驗過程中，檢出的可疑致病菌須妥善保藏，以達到進一步鑒定的目致病菌須妥善保藏，以達到進一步鑒定的目的，保證用藥安全。的，保證用藥安全。l國內(nèi)藥品微生物檢驗所用的菌種代號是國內(nèi)藥品微生物檢驗所用的菌種代號是lCMCC（F）或）或 CMCC（B）lCMCC 中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心lB 代表細菌，代表細菌， F 代表真菌。代表真菌。l大腸桿菌大腸桿菌 CMCC (B) 44102l乙型副傷寒沙門桿菌乙型副傷寒沙門桿菌 CMCC (B) 50094l銅綠假單胞菌銅綠假

3、單胞菌 CMCC (B)10104l金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 CMCC (B)26003l生孢梭菌生孢梭菌CMCC(B)64941l白色念珠菌白色念珠菌CMCC(F)98001(一一) 菌種保藏的原理菌種保藏的原理l根據(jù)微生物的菌種生理、生化特性，在人工創(chuàng)造根據(jù)微生物的菌種生理、生化特性，在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物細胞的代謝強度，使細的條件下盡量降低微生物細胞的代謝強度，使細胞基本處于休眠狀態(tài)，生長繁殖受到抑制但又不胞基本處于休眠狀態(tài)，生長繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、干燥、至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物的代缺

4、氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物的代謝作用。謝作用。l低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。 選擇保藏方法時，首先應(yīng)考慮方法能否長期地選擇保藏方法時，首先應(yīng)考慮方法能否長期地保持菌種原有的特性，同時也應(yīng)兼顧到方法的經(jīng)濟保持菌種原有的特性，同時也應(yīng)兼顧到方法的經(jīng)濟和簡便。在實際工作中，往往多種條件同時使用和簡便。在實際工作中，往往多種條件同時使用,以提高保藏效果。以提高保藏效果。（二）菌種保藏步驟（二）菌種保藏步驟 挑選特征典型的純菌菌落；挑選特征典型的純菌菌落；確定保藏的合適菌體形態(tài)；確定保藏的合適菌體形態(tài)； 選擇最適宜的保藏方法；選擇最適宜的

5、保藏方法；定期對保藏菌種進行檢查，觀察是否發(fā)生變化，定期對保藏菌種進行檢查，觀察是否發(fā)生變化，若有變化，須改變保藏方法。保藏期滿應(yīng)及時進若有變化，須改變保藏方法。保藏期滿應(yīng)及時進行移種。行移種。l（1）方法：將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接）方法：將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養(yǎng)基）上，種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養(yǎng)基）上，按規(guī)定的溫度和時間培養(yǎng)，待充分生長后，把按規(guī)定的溫度和時間培養(yǎng)，待充分生長后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙保好，為減緩培養(yǎng)培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙保好，為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長保藏時間，可將菌種保藏基的水分蒸發(fā)，延長保藏時間，可將菌種保藏管的

6、棉花塞換成橡膠塞。放在管的棉花塞換成橡膠塞。放在4左右的冰箱左右的冰箱中保藏。每隔中保藏。每隔 23個月移種一次，繼續(xù)進行保個月移種一次，繼續(xù)進行保藏。若用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，一般可藏。若用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，一般可保藏半年保藏半年 一年。有的甚至更長時間。一年。有的甚至更長時間。 l（2）適用范圍：細菌、酵母菌、霉菌保藏。）適用范圍：細菌、酵母菌、霉菌保藏。菌菌 種種培培 養(yǎng)養(yǎng) 基基保存溫保存溫度度傳傳 種種 時時 間間細細 菌菌一般多用于營養(yǎng)瓊脂一般多用于營養(yǎng)瓊脂或根據(jù)菌種規(guī)定選用或根據(jù)菌種規(guī)定選用培養(yǎng)基培養(yǎng)基46芽孢桿菌芽孢桿菌36個月，個月，其它細菌每個月其它細菌每個月酵母

7、菌酵母菌一般用麥芽汁瓊脂或一般用麥芽汁瓊脂或麥芽汁酵母膏瓊脂麥芽汁酵母膏瓊脂46一般一般46個月個月絲狀真絲狀真菌菌一般用PDA瓊脂、蔡氏瓊脂或麥芽汁瓊脂等46每每 4 個 月 移 植 一 次個 月 移 植 一 次（每（每2個月移植一次個月移植一次）（3）特點：）特點： 優(yōu)點是優(yōu)點是簡便，易于推廣；一般不簡便，易于推廣；一般不需要另選擇保藏用培養(yǎng)基；對大多數(shù)微生需要另選擇保藏用培養(yǎng)基；對大多數(shù)微生物都適用。物都適用。 缺點是缺點是保藏期太短；傳代次數(shù)多保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。，易發(fā)生變異及污染。（4）注意事項：）注意事項：l保藏的菌種應(yīng)是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物，至保藏的菌種

8、應(yīng)是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物，至少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。 l保藏時，破傷風(fēng)桿菌可用庖肉培養(yǎng)基；生孢梭菌保藏時，破傷風(fēng)桿菌可用庖肉培養(yǎng)基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。用流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。l 必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動或生霉，如有異常應(yīng)及時處種管的棉塞是否松動或生霉，如有異常應(yīng)及時處理。理。l 每次移植后，應(yīng)與原菌種的編號、名稱逐一核對，每次移植后，應(yīng)與原菌種的編號、名稱逐一核對，確證培養(yǎng)基特征和純度無誤后再繼續(xù)保藏。確證培養(yǎng)基特征和純度無誤后再繼續(xù)保藏。l 保藏菌種的培養(yǎng)基應(yīng)無糖，其他菌類含糖

9、小于保藏菌種的培養(yǎng)基應(yīng)無糖，其他菌類含糖小于 2 %為宜，以免產(chǎn)酸過多，影響菌種存活。為宜，以免產(chǎn)酸過多，影響菌種存活。l 銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。不宜用本法保存。 （1）方法：）方法：l 將菌種接種于斜面或穿刺于將菌種接種于斜面或穿刺于0.3 0.5 %瓊脂半瓊脂半固體高層培養(yǎng)基中，培養(yǎng)好備用。固體高層培養(yǎng)基中，培養(yǎng)好備用。l取 化 學(xué) 純 的 液 體 石 蠟 裝 在 試 管 中 ， 每 管取 化 學(xué) 純 的 液 體 石 蠟 裝 在 試 管 中 ， 每 管1015ml，加棉塞，瓶口包上紙，加棉塞，瓶口包上紙，121高

10、壓滅高壓滅菌菌30min，取出置，取出置37溫箱或溫箱或 110 170 烤箱烤箱中中 1 2 h 或干燥器內(nèi)除去液體石蠟中的水分?；蚋稍锲鲀?nèi)除去液體石蠟中的水分。l 將上述液體石蠟加將上述液體石蠟加入培養(yǎng)好的菌種試管入培養(yǎng)好的菌種試管內(nèi)，液體石蠟液面以內(nèi)，液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基最上端高出培養(yǎng)基最上端 1 為宜，將試管直立，為宜，將試管直立，放入放入4冰箱中保藏。冰箱中保藏。l適用范圍：適用于保適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對細菌保和放線菌，對細菌保藏效果較差。藏效果較差。 菌菌 種種菌株數(shù)菌株數(shù)保存時間保存時間（年）（年）存活率存活率（%）細菌細菌霉菌霉菌

11、酵母菌酵母菌放線菌放線菌87586400380552420.983.688.991.3（3）特點：）特點： 本方法簡便易行，是實驗室常用的一種保藏方法，本方法簡便易行，是實驗室常用的一種保藏方法， 該法主要使菌種與空氣隔絕。該法主要使菌種與空氣隔絕。（4）注意事項：）注意事項： 保藏時，用新鮮培養(yǎng)物接種，應(yīng)檢查純度和特征保藏時，用新鮮培養(yǎng)物接種，應(yīng)檢查純度和特征 后，方可進行保后，方可進行保藏。藏。 保藏過程中，需經(jīng)常觀察斜面是否干燥，如干燥，保藏過程中，需經(jīng)常觀察斜面是否干燥，如干燥， 需重新移種。需重新移種。 使用菌種時，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一使用菌種時，先將菌種管傾斜使液體石蠟流

12、至一 邊，再用接種針挑取培養(yǎng)物接種到新鮮斜面上培邊，再用接種針挑取培養(yǎng)物接種到新鮮斜面上培 養(yǎng)，待長出新培養(yǎng)物后，再移種一次到新斜面上養(yǎng)，待長出新培養(yǎng)物后，再移種一次到新斜面上 即可使用。即可使用。將沾有少量液體石蠟的接種針浸于將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免直接酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免直接在酒精燈下燒灼時，液體石蠟四濺，引起在酒精燈下燒灼時，液體石蠟四濺，引起污染。污染。 液體石蠟在菌種管中高出培養(yǎng)基的液體石蠟在菌種管中高出培養(yǎng)基的高度要嚴格控制，如太多，會影響菌種交高度要嚴格控制，如太多，會影響菌種交換氣體，使保藏效果不好；如太少，斜面換氣體，使保藏效果

13、不好；如太少，斜面容易干燥，將縮短保藏期。一般以高出斜容易干燥，將縮短保藏期。一般以高出斜面面1 為宜。為宜。 制備無菌液體石蠟時，每管裝量不制備無菌液體石蠟時，每管裝量不能太多，否則分裝到菌種培養(yǎng)基中易造成能太多，否則分裝到菌種培養(yǎng)基中易造成污染。污染。3、半固體瓊脂培養(yǎng)基（、半固體瓊脂培養(yǎng)基（0.5%） 4、40%甘油保存法甘油保存法： l程序：程序： 凍干菌復(fù)蘇凍干菌復(fù)蘇接種（斜面）接種（斜面） （菌種傳代）（菌種傳代）（營養(yǎng)肉湯）（營養(yǎng)肉湯） 制備菌懸液制備菌懸液 對照菌液對照菌液l檢定用標(biāo)準(zhǔn)菌種，由中國藥品生物檢定所提供，為冷檢定用標(biāo)準(zhǔn)菌種，由中國藥品生物檢定所提供，為冷凍干燥菌種。

14、凍干燥菌種。l菌種的復(fù)蘇與保存在專用無菌室或超凈工作臺內(nèi)進行。菌種的復(fù)蘇與保存在專用無菌室或超凈工作臺內(nèi)進行。 1 菌種的復(fù)蘇菌種的復(fù)蘇 把凍干菌種管、滅菌把凍干菌種管、滅菌1ml 滴管、雙碟、鑷子、營滴管、雙碟、鑷子、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面數(shù)支，移入接種室或凈養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面數(shù)支，移入接種室或凈化工作臺?；ぷ髋_。先用砂輪將凍干菌種安瓶頸部挫出刻痕先用砂輪將凍干菌種安瓶頸部挫出刻痕,再將凍再將凍干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75% 乙醇棉乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點燃酒精燈，將菌種擦凈，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點燃酒精燈，將菌種

15、管的封口一端在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌滴管吸取管的封口一端在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌滴管吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。冷而炸裂。 取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開，取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙碟內(nèi)，另取放入滅菌雙碟內(nèi)，另取1支滅菌滴管，在火焰旁支滅菌滴管，在火焰旁吸取營養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌吸取營養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌攪動促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，分別接種至攪動促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，分別接種至營養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯內(nèi)，并將滴管及菌種管營養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯

16、內(nèi)，并將滴管及菌種管投入消毒液內(nèi)，將已接種的營養(yǎng)肉湯及營養(yǎng)瓊脂投入消毒液內(nèi)，將已接種的營養(yǎng)肉湯及營養(yǎng)瓊脂斜面置斜面置3537培養(yǎng)培養(yǎng)2224 h。 取出培養(yǎng)物，仔細觀察菌苔形態(tài)、有無雜取出培養(yǎng)物，仔細觀察菌苔形態(tài)、有無雜菌、涂片、革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落后，轉(zhuǎn)菌、涂片、革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落后，轉(zhuǎn)種種3 代即可應(yīng)用。如發(fā)現(xiàn)菌型不典型，可進行平代即可應(yīng)用。如發(fā)現(xiàn)菌型不典型，可進行平板分離單菌落。板分離單菌落。 方法（方法（1）：）： 菌斜面菌斜面 菌斜面（保存）菌斜面（保存） 培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備，如斜面已無冷凝水者，不宜培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備，如斜面已無冷凝水者，不宜再使用。標(biāo)簽上著名菌名及接種日

17、期。至冰箱取出再使用。標(biāo)簽上著名菌名及接種日期。至冰箱取出的菌種斜面，應(yīng)在室溫放置約的菌種斜面，應(yīng)在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺。后再移入接種室或超凈工作臺。 點燃酒精燈，用左手握住菌種斜面，將管口靠進點燃酒精燈，用左手握住菌種斜面，將管口靠進火焰旁，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅火焰旁，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅30秒，秒，隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過過3次。左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手用無名次。左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手用無名指、小指及掌部夾住棉塞，撥開棉塞，將接種環(huán)伸指

18、、小指及掌部夾住棉塞，撥開棉塞，將接種環(huán)伸人管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移人管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮去少量菌苔，隨即取出接種棒，并將至菌苔上，刮去少量菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰旁。菌種管口移至火焰旁。 堵上棉塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊堵上棉塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面脂斜面1支，照上述操作打開棉塞，將接種環(huán)支，照上述操作打開棉塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的低部，由底向上，將接伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的低部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折移動，使細菌劃在斜種環(huán)輕貼斜面的表面曲折移動，使細菌劃在斜面的表面上。面的表面上。 取出

19、接種棒，在火焰旁將培養(yǎng)基管棉塞堵取出接種棒，在火焰旁將培養(yǎng)基管棉塞堵上，然后將接種過細菌的接種棒在火焰上燒灼上，然后將接種過細菌的接種棒在火焰上燒灼滅菌。滅菌。 將已接種畢的細菌管置將已接種畢的細菌管置3537培養(yǎng)培養(yǎng)2224小時，霉菌管一般置小時，霉菌管一般置2025霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)養(yǎng)7日。取出后放人冰箱保存，一般日。取出后放人冰箱保存，一般 3個月轉(zhuǎn)種個月轉(zhuǎn)種一次。一次。 方法方法2：菌斜面：菌斜面 營養(yǎng)肉湯營養(yǎng)肉湯 分離平板分離平板 菌斜面菌斜面 如果菌落形態(tài)不典型可純化，按下列方法傳代如果菌落形態(tài)不典型可純化，按下列方法傳代（分離菌落）（分離菌落） ： 用接種環(huán)取上述菌管

20、（斜面）菌苔少許接種置用接種環(huán)取上述菌管（斜面）菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中營養(yǎng)肉湯中(5ml/支支,已滅菌已滅菌), 置置3537培養(yǎng)培養(yǎng)1824小小時后，再用接種環(huán)取培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃時后，再用接種環(huán)取培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液），接種于分離平板，置菌液），接種于分離平板，置3537培養(yǎng)培養(yǎng)1824小小時，用接種針選典型菌落劃線于營養(yǎng)瓊脂斜面，置時，用接種針選典型菌落劃線于營養(yǎng)瓊脂斜面，置3537培養(yǎng)培養(yǎng)1824小時。一般同時接種幾支管，其小時。一般同時接種幾支管，其中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培養(yǎng)中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培養(yǎng)基中，其它用做工作菌種?；?/p>

21、，其它用做工作菌種。常用分離平板：常用分離平板：l大腸埃希菌大腸埃希菌EMB瓊脂平板瓊脂平板l金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基基l沙門菌沙門菌SS瓊脂平瓊脂平板板l 取上述培養(yǎng)好的菌種斜面移入接種取上述培養(yǎng)好的菌種斜面移入接種室或凈化工作臺，放置室溫后室或凈化工作臺，放置室溫后, 用接種環(huán)用接種環(huán)取菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中取菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(5ml/支支,已已滅菌滅菌), 將已接種畢的細菌管置將已接種畢的細菌管置3537培培養(yǎng)養(yǎng)1824小時，取出備用。一般于冰箱中小時，取出備用。一般于冰箱中保存可用保存可用7天。天。l 取上述培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液取上述培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液）（濃菌液）1ml，加到，加到9ml 0.9%無菌氯無菌氯化鈉溶液混勻，為化鈉溶液混勻，為10-1，再取另一只吸管，再取另一只吸管吸取吸取10-1菌液菌液1 ml加到加到9ml 0.9%無菌氯化無菌氯化鈉溶液混勻，為鈉溶液混勻，為10-2 以此類推，稀以此類推，稀釋至含活菌數(shù)在釋至含活菌數(shù)在 50 100 個。用平板計個。用平板計數(shù)。數(shù)。l 此稀釋菌液用于試驗后加陽性對照，此稀釋菌液用于試驗后加陽性對照，可在可在1天內(nèi)使用。天內(nèi)使用。菌種菌