第八章現(xiàn)代生物技術在抗生素工業(yè)中的應用

1、第八章 現(xiàn)代生物技術在抗生素工業(yè)中的應用周濃副教授重慶三峽學院生命科學與工程學院抗生素、氨基酸、核苷酸、維生素等抗生素、氨基酸、核苷酸、維生素等基因工程藥物、疫苗及抗體產(chǎn)品基因工程藥物、疫苗及抗體產(chǎn)品傳統(tǒng)生物制藥工業(yè)的特點傳統(tǒng)生物制藥工業(yè)的特點產(chǎn)量與發(fā)酵規(guī)模大產(chǎn)量與發(fā)酵規(guī)模大出口比重大出口比重大示范效應明顯示范效應明顯產(chǎn)業(yè)規(guī)模大 20072007年我國抗生素原料銷售收入年我國抗生素原料銷售收入350350多億元，多億元，我國抗生素原料藥產(chǎn)能、產(chǎn)量居世界首位我國抗生素原料藥產(chǎn)能、產(chǎn)量居世界首位 產(chǎn)能過萬噸產(chǎn)品：青霉素、頭孢菌素、紅霉產(chǎn)能過萬噸產(chǎn)品：青霉素、頭孢菌素、紅霉素素 中國已經(jīng)成為氨基酸生

2、產(chǎn)和消費大國中國已經(jīng)成為氨基酸生產(chǎn)和消費大國, , 年消年消費量約費量約 140 140 萬萬t t左右左右 維生素現(xiàn)已成為國際醫(yī)藥與保健品市場的主維生素現(xiàn)已成為國際醫(yī)藥與保健品市場的主要大宗產(chǎn)品之一，每年維生素市值已達要大宗產(chǎn)品之一，每年維生素市值已達2525億億美元，我國年產(chǎn)能力約美元，我國年產(chǎn)能力約2020萬萬t t 大容積發(fā)酵罐大容積發(fā)酵罐傳統(tǒng)育種方法與現(xiàn)代生物技術傳統(tǒng)育種方法與現(xiàn)代生物技術在制藥工業(yè)中的比較在制藥工業(yè)中的比較傳統(tǒng)的育種方法: 要用經(jīng)典的方法育種 盲目性高 不能組合不同菌株的優(yōu)良性狀現(xiàn)代生物技術: 基因重組改造菌種 提高產(chǎn)品產(chǎn)量 改造傳統(tǒng)的發(fā)酵生產(chǎn)工藝,節(jié)約能源和原料,

3、降低污染誘變育種 采用誘變因子促使微生物遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，從而導致其性能改善到菌種優(yōu)化方法 物理誘變因子物理誘變因子 紫外線、射線 化學誘變劑化學誘變劑 化學因子如堿基類似物、5氟尿嘧啶、烷化劑等現(xiàn)代生物技術：理性化育種現(xiàn)代生物技術：理性化育種 建立在微生物生理代謝理建立在微生物生理代謝理論和抗生素合成機理基礎論和抗生素合成機理基礎上，有目的調(diào)節(jié)產(chǎn)生菌生上，有目的調(diào)節(jié)產(chǎn)生菌生理代謝、調(diào)節(jié)生物合成途理代謝、調(diào)節(jié)生物合成途徑或改造其生物合成基因徑或改造其生物合成基因結構到育種。結構到育種。 鏈霉菌為主到次級代謝產(chǎn)鏈霉菌為主到次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌到基因克隆表達物產(chǎn)生菌到基因克隆表達宿主系統(tǒng)日益完善宿主

4、系統(tǒng)日益完善新觀點：系統(tǒng)代謝工程改造菌種Park JH, et al. Current Opinion in Biotechnology,2008,19:454-460System Metabolic Engineering大量引進國外高產(chǎn)菌株大量引進國外高產(chǎn)菌株 我國至今用于大規(guī)摸工業(yè)生產(chǎn)的生產(chǎn)菌株，如青霉素、紅霉素、頭C、各種氨基酸、阿維霉素、泰樂霉素、黃霉素以及高表達水平的基因工程產(chǎn)品等幾乎都是從國外高價引進。因此，從根本意義上來說，我國的傳統(tǒng)生物制藥工業(yè)和現(xiàn)代生物技術產(chǎn)業(yè)缺乏競爭力?，F(xiàn)代生物技術改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)現(xiàn)代生物技術改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)抗生素 提高產(chǎn)量和改善組分 產(chǎn)生新的雜合抗生素O

5、lano C et al. Metabolic Engineering 2008,10:281-292.紅霉素全基因組序列紅霉素全基因組序列現(xiàn)代生物技術改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)現(xiàn)代生物技術改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)氨基酸 獲得高產(chǎn)菌種纈氨酸組氨酸蘇氨酸異亮氨酸纈氨酸高產(chǎn)菌種代謝工程改造現(xiàn)代生物技術改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)現(xiàn)代生物技術改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)維生素: 獲得高產(chǎn)菌種 簡化生產(chǎn)工藝維生素Cl我國發(fā)明了維生素C兩步發(fā)酵法，使中國維生素C生產(chǎn)技術居世界先進水平 l維生素C產(chǎn)量5萬噸以上，占全球產(chǎn)量的40% 背 景 20世紀70年代,重組DNA技術興起應用于醫(yī)藥蛋白多肽方面,取得了突出的效果. 80年代,重組DNA技術應用

6、于結構比較復雜的次級代謝產(chǎn)物的生物合成.(鏈霉菌) 目前,抗生素生物合成酶基因的分離 ,質(zhì)粒的選擇,基因重組于轉移和宿主表達.(已克隆的抗生素合成基因有23種之多)基因工程在抗生素生產(chǎn)中的應用基因工程在抗生素生產(chǎn)中的應用第一節(jié) 重組DNA技術在抗生素生產(chǎn)中的應用 重組重組DNADNA技術技術是指將一種生物體（是指將一種生物體（供體供體）的基因與）的基因與載體載體在在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體受體）內(nèi)，）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產(chǎn)物或新性狀的使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產(chǎn)物或新性狀的DNADNA體外操作程序，也稱為

7、體外操作程序，也稱為分子克隆技術分子克隆技術。 因此，因此，供體供體、受體受體、載體載體是重組是重組DNADNA技術的三大基本元件。技術的三大基本元件?？股厣锖铣刹⒎菃我换虻闹苯赢a(chǎn)物，而是由初級抗生素生物合成并非單一基因的直接產(chǎn)物，而是由初級代謝產(chǎn)物經(jīng)過一系列酶催化產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，其形成代謝產(chǎn)物經(jīng)過一系列酶催化產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，其形成過程是一個復雜的、多因素調(diào)節(jié)的過程過程是一個復雜的、多因素調(diào)節(jié)的過程 傳統(tǒng)的提高微生物產(chǎn)生抗生素能力的方法主要是用誘傳統(tǒng)的提高微生物產(chǎn)生抗生素能力的方法主要是用誘變劑（如紫外線、化學誘變劑等）處理微生物，獲得生產(chǎn)變劑（如紫外線、化學誘變劑等）處理微生物

8、，獲得生產(chǎn)能力較高的突變株。能力較高的突變株。8080年代，人們開始將年代，人們開始將DNADNA重組技術應用重組技術應用于次級代謝產(chǎn)物的生物合成上；通過生物合成酶基因的分于次級代謝產(chǎn)物的生物合成上；通過生物合成酶基因的分離、質(zhì)粒的選擇、基因重組與轉移、宿主表達等方面。離、質(zhì)粒的選擇、基因重組與轉移、宿主表達等方面。 傳統(tǒng)發(fā)酵法的弊端：傳統(tǒng)發(fā)酵法的弊端：采用經(jīng)典方法育種，采用經(jīng)典方法育種，盲目性高，無法集合不同菌株的優(yōu)良性狀。盲目性高，無法集合不同菌株的優(yōu)良性狀?；蛑亟M技術的優(yōu)點：基因重組技術的優(yōu)點：可以定向改造菌種，可以定向改造菌種，且能集多個菌株的多種優(yōu)良性狀于同一菌且能集多個菌株的多種

9、優(yōu)良性狀于同一菌株，達到簡化工藝、提高產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量株，達到簡化工藝、提高產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量的目的。的目的。一、克隆抗生素生物合成基因的方法 1.1.抗生素（鏈霉素）生物合成基因的結構特點抗生素（鏈霉素）生物合成基因的結構特點 鏈霉菌抗生素生物合成基因組的一個典型特性是鏈霉菌抗生素生物合成基因組的一個典型特性是G-CG-C堿堿基組成，基組成， （G+CG+C）% %高達高達70%70%以上；且三聯(lián)體密碼子中第以上；且三聯(lián)體密碼子中第3 3個堿基個堿基G G、C C比例極高比例極高 抗生素生物合成基因大多處于一個基因族中抗生素生物合成基因大多處于一個基因族中 抗生素生物合成基因除定位在染色體上外，有

10、的定位于抗生素生物合成基因除定位在染色體上外，有的定位于質(zhì)粒上質(zhì)粒上2.克隆抗生素生物合成基因的方法 1）阻斷變株法 2）突變克隆法 3）直接克隆法 4）克隆抗生素抗性基因法 5）寡核苷酸探針法 6）同源基因雜交法 7）在標準宿主系統(tǒng)中克隆檢測單基因產(chǎn)物1.阻斷變株法 阻斷變株法 通過一系列阻斷變株的互補結果來確定被克隆的DNA片斷的性質(zhì) 方法與步驟 野生型 突變型 篩選表型恢復型 分析基因 總DNA 基因庫Tetracenomycin C (tam C) Tetracenomycin C(丁省霉素) 是一個有淡青鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素分離tamC的突變株 并 分析阻斷性質(zhì)野生型總DNA BamH

11、1消化 連接到pIJ702分離tamC+克隆其基因2.突變克隆法ligation重組整合載體重組整合載體轉化藥物產(chǎn)生菌轉化藥物產(chǎn)生菌整合質(zhì)?；蚴删w整合質(zhì)?；蚴删wDNA片段片段發(fā)生整合，可能干發(fā)生整合，可能干擾某生物合成基因擾某生物合成基因說明這個生物合成基因說明這個生物合成基因發(fā)生了插入突變，這個發(fā)生了插入突變，這個基因就是這個生物合成基因就是這個生物合成相關相關3.直接克隆法 直接克隆法 直接克隆整套的生物合成基因（適合于基因簇相對較?。?0kb）的抗生素生物合成基因。 局限：大片段基因簇的穩(wěn)定性、原始株的重要的調(diào)控因素頭霉素C基因的克隆篩選對C.terrigena抗性的菌株克隆其基因分

12、別將轉化子涂平板部分酶切鏈霉菌總DNA選擇20-40kb的片段連接到pIJ943的Bgl位點 轉化變青鏈霉菌1326篩選轉化子（不產(chǎn)黑色素、硫鏈絲菌素抗性）檢測產(chǎn)物：TLC，HPLC等 。根據(jù)抗生素生物合成基因和抗性基因是連鎖的，表達上也是協(xié)同的，而且抗性基因比較?。?-2kb），容易檢測和克隆。ligation重組載體重組載體轉化抗性敏感得抗轉化抗性敏感得抗生素產(chǎn)生菌生素產(chǎn)生菌Vector藥物產(chǎn)生藥物產(chǎn)生菌菌DNA酶酶切片段切片段分析連鎖得生物合成基分析連鎖得生物合成基因因probe產(chǎn)生菌產(chǎn)生菌genome abankhybrid分離與之同源并帶分離與之同源并帶有生物合成基因的有生物合成基因

13、的DNA片段片段局限：有些抗生素不與合成基因連鎖，并且可能抗性不止一個，所以分析比較復雜。紅霉素生物合成基因的克隆 得到陽性克隆分析表明：片段為35kb，含有所有紅霉素生物合成基因和抗性基因Mbo1酶切產(chǎn)生菌總DNA與穿梭粘粒pKC462a連接分析片段轉導大腸桿菌SF8形成轉化子以含有紅霉素抗性基因質(zhì)粒pIJ43為探針進行菌落原位雜交5.寡核苷酸探針法 事實基礎 鏈霉菌基因?qū)γ艽a子的利用有明顯的不隨機性，即DNA中G+C的比例為70%以上，密碼子第三位有90%以上為G或C 原理 分離抗生素生物合成酶后，獲得這些酶的氨基酸序列，根據(jù)氨基酸序列推倒出較低程度簡并性的基因序列，人工合成寡核苷酸探針，

14、從基因文庫中就可克隆生物合成基因6.同源基因雜交法 原理 利用一種已克隆的抗生素生物合成基因片段為探針，探測相關抗生素同源基因，最后分離及克隆抗生素生物合成基因 由于基因保守序列的同源性，利用同源基因雜交法克隆化學結構類似的抗生素生物合成基因是比較快速準確的方法7.在標準宿主系統(tǒng)中克隆檢測單基因產(chǎn)物 鳥槍克隆法 把抗生素產(chǎn)生菌的DNA克隆到最常用的宿主變青鏈霉菌中，通過檢測宿主中的個別基因產(chǎn)物，篩選克隆，從而分離基因。 利用鳥槍克隆法，把抗生素產(chǎn)生菌利用鳥槍克隆法，把抗生素產(chǎn)生菌DNADNA克隆到最常用的宿克隆到最常用的宿主主變青鏈霉菌中，通過檢測宿主菌中個別基因產(chǎn)物，篩變青鏈霉菌中，通過檢測

15、宿主菌中個別基因產(chǎn)物，篩選克隆，從而分離到相應的基因。選克隆，從而分離到相應的基因。digestion質(zhì)粒質(zhì)粒genome ligationtransformHost -Test phenotypeShotgun抗生素基因簇的組成PABA合成酶基因pab的克隆受體菌BamH1連接供體菌：過量生產(chǎn)PABA的磺胺抗性的灰色鏈霉菌 總DNA 篩選磺胺抗性轉化子質(zhì)粒轉化分離基因克隆抗生素所用的方法二、幾種典型的抗生素生物合成基因的結構 紅霉素紅霉素:參與紅霉素生物合成的基因長度為參與紅霉素生物合成的基因長度為60kb60kb，整個基因由整個基因由2323個個ORF(open reading frame

16、) )組成。組成。中心部分約為中心部分約為35kb35kb，稱為，稱為eryAeryA，由，由3 3個個ORFORF（ eryA eryA ， eryA eryA ， eryA eryA ）組成，主要參與內(nèi)酯組成，主要參與內(nèi)酯環(huán)的合成。環(huán)的合成。eryFeryF編碼細胞色素編碼細胞色素P450P450單氧化酶，使單氧化酶，使6 6位原子羥基化；位原子羥基化；”eryB ”eryB ”與與”eryC ”eryC ”是兩組基是兩組基因，分別與紅霉素的形成和紅霉內(nèi)酯的因，分別與紅霉素的形成和紅霉內(nèi)酯的3-O-3-O-紅霉紅霉糖苷化有關，及與紅霉糖胺的形成或糖苷化有關，及與紅霉糖胺的形成或3-O-3-

17、O-紅霉糖紅霉糖苷化有關；苷化有關； eryKeryK編碼編碼C-12C-12羥基化酶。羥基化酶。 AT-acyltransferase ACP-acyl carrier protein KS-ketosynthase KR-ketoreductase DH-dehydrtase ER-enoylreductase TE-thioesteras脫氧紅霉內(nèi)酯脫氧紅霉內(nèi)酯B B脫氧紅霉內(nèi)酯脫氧紅霉內(nèi)酯B的生物合成的生物合成ORF1ORF2ORF3 青霉素青霉素：pcbCpcbC基因編碼異青霉素基因編碼異青霉素N N合成酶，合成酶，通過通過“反向遺傳學反向遺傳學”方法克隆方法克隆IPNSIPNS的的

18、N N末端末端氨基酸序列，根據(jù)已知的氨基酸序列，以氨基酸序列，根據(jù)已知的氨基酸序列，以合成的寡核苷酸為探針，通過雜交來識別合成的寡核苷酸為探針，通過雜交來識別含有相關含有相關DNADNA序列的克隆體，經(jīng)序列的克隆體，經(jīng)DNADNA序列分序列分析發(fā)現(xiàn)了一個可讀框，并能在大腸桿菌中析發(fā)現(xiàn)了一個可讀框，并能在大腸桿菌中表達，這種重組大腸桿菌可產(chǎn)生表達，這種重組大腸桿菌可產(chǎn)生IPNSIPNS，故，故證實已克隆到了證實已克隆到了pcbCpcbC基因?；颉０戳虼０鍣C制進行。按硫代模板機制進行。ACVACV合酶合成合酶合成-氨基己二氨基己二酸酸- -半胱氨酸半胱氨酸-D-D-纈氨酸三肽。由纈氨酸三肽。由

19、IPNIPN合酶催化形合酶催化形成異青霉素成異青霉素N N。 +ACV合酶合酶異青霉素異青霉素NIPN合酶合酶-氨基己二酸氨基己二酸-半胱氨酸半胱氨酸-D-纈氨酸三肽纈氨酸三肽異青霉素的生物合成異青霉素的生物合成青霉素和頭孢菌素的生物合成青霉素和頭孢菌素的生物合成三、提高抗生素產(chǎn)量的方法 經(jīng)典方法 通過物理或化學手段進行誘變育種得到高產(chǎn)菌株 基因工程方法 定向改造基因 提高基因的表達水平 改造菌種生產(chǎn)能力提高抗生素產(chǎn)量在工業(yè)上改良微生物工業(yè)菌種，提高抗生素產(chǎn)量主要依賴物理化學手段進行誘變育種，但是利用基因工程手段有目的地定向改造基因，提高基因表達，以及改造菌種生產(chǎn)能力具有極大發(fā)展?jié)摿Α?原理：

20、在克隆菌株中，增加某一與產(chǎn)量有關的基因（限速階段的基因或正調(diào)節(jié)基因）劑量，使產(chǎn)量提高。方法1：將產(chǎn)生菌基因隨機克隆至原株直接篩選高產(chǎn)菌株 抗生素合成途徑中的某個階段可能是整個合成中的限速階段，識別位于合成途徑中的“限速瓶頸”，并設法倒入能提高這個階段酶系的基因拷貝數(shù)，就有可能增加最終抗生素的產(chǎn)量。故增加生物合成中增加生物合成中限速階段酶基因劑量有可能提高抗生素產(chǎn)量。限速階段酶基因劑量有可能提高抗生素產(chǎn)量。 抗生素合成途徑中的代謝支路的關鍵基因消除，提高紅霉素合成流量方法2：增加和敲除合成途徑的關鍵基因 增加生物合成限速酶系編碼基因的拷貝數(shù)Methylmalonyl-CoA (mmCoA) me

21、tabolite node in erythromycin biosynthesis開源：強化紅霉素合成甲基丙二酰CoA代謝節(jié)點 拷貝甲基丙二酰CoA變位酶（MCM）操縱子，紅霉素產(chǎn)量增加50%。Reeves AR, et al. Metabolic Engineering,2007,9: 293-303.節(jié)流：克拉維酸合成中3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因敲除Li RF et al. Metabolic Engineering, 2006,8: 240-252. 依據(jù) 在許多鏈霉菌中，調(diào)節(jié)基因嵌在控制抗生素產(chǎn)生的基因簇中 正調(diào)節(jié)基因?qū)Y構基因進行正向調(diào)節(jié) 負調(diào)節(jié)基因?qū)Y構基因進行負向調(diào)節(jié) 將額外

22、的正調(diào)節(jié)基因引入野生型菌株中，使獲得將額外的正調(diào)節(jié)基因引入野生型菌株中，使獲得高產(chǎn)產(chǎn)物的最簡單的方法高產(chǎn)產(chǎn)物的最簡單的方法 增加正性調(diào)節(jié)基因或降低負性調(diào)節(jié)基因也是增加抗增加正性調(diào)節(jié)基因或降低負性調(diào)節(jié)基因也是增加抗生素產(chǎn)量的方法生素產(chǎn)量的方法方法3：通過調(diào)節(jié)基因的作用紅霉素合成調(diào)節(jié)基因bldD的發(fā)現(xiàn)Chng C, et al. PNAS,2008,105:11346-11351美伐他汀合成調(diào)節(jié)基因mlcR的強化表達 降血脂藥物Appl Microbiol Biotechnol (2009)83:697704 事實依據(jù) 1、抗生素的生產(chǎn)水平是由抗生素生物合成酶和對自身抗性的酶所共同決定的 2、抗性

23、基因經(jīng)常和生物合成基因連鎖，是激活生物合成基因基因轉錄的必需成分 3、抗性基因必需先轉錄，建立抗性后，生物合成基因的轉錄才能進行 所以可以通過提高菌種自身的抗性水平來改良菌種，提高抗生素產(chǎn)量。 方法4：增加抗性基因鏈霉素抗性篩選法在選育博來霉素A2組分高產(chǎn)菌株中的應用中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2007, 38(5): 344-346四、改善抗生素組分 例: 阿維菌素 選育只能生產(chǎn)B2a的菌株是十分有意義的基因工程在抗生素生產(chǎn)中的應用基因工程在抗生素生產(chǎn)中的應用多組分，生理活性上，相差大。應用基因工程方法，可以定向的改造抗生素產(chǎn)生菌，獲得只產(chǎn)生有效組分的菌種。紅霉素基因工程技術現(xiàn)狀次級代謝產(chǎn)物的復雜代謝

24、調(diào)控機制分子改造局限于模式生物，缺乏工業(yè)生產(chǎn)菌株的應用，國內(nèi)外沒有報道紅霉素生物合成途徑紅霉素生物合成途徑72647264個基因，多基因簇個基因，多基因簇 min0510152025Norm.0102030405060 VWD1 A, Wavelength=210 nm (HONG06082222.D) 1.855 2.210 2.497 2.800 3.101 3.303 3.446 3.680 3.928 4.170 4.639 5.195 5.810 6.383 6.831 7.337 8.101 8.646 12.405 14.693 16.617 26.305 PMP1, Solve

25、nt B PMP1, Solvent DA（76.8% ）B（3.9% ）C（4.4% ）原生產(chǎn)菌株HPLC組分圖紅霉素生物合成途徑的復雜性1 丙酸6 甲基丙二酸PKSery A6-脫氧紅霉內(nèi)酯（6-dEB）ery FC-羥化酶紅霉內(nèi)酯（EB）L-mycarose糖基轉移酶ery B3-L-mycarose紅霉內(nèi)酯MEBD-desosamine糖基轉移酶ery C紅霉素D（Er D）C-12羥化酶ery K紅霉素C（Er C）ery G紅霉素A（Er A）甲基化酶ery G紅霉素B（Er B）C-12羥化酶ery K紅霉素F（Er F）紅霉素E（Er E）甲基化酶圍繞紅霉素菌種改造的工作 研究

26、內(nèi)容：調(diào)節(jié)羥化酶（調(diào)節(jié)羥化酶（eryKeryK）和甲基化酶（）和甲基化酶（eryGeryG）表達，優(yōu)化紅霉素）表達，優(yōu)化紅霉素D D轉化轉化為紅霉素為紅霉素A A兩條代謝途徑的通量分布兩條代謝途徑的通量分布 幾種基因操作后獲得的不同突變株情況匯總Chen Y et al. Appl Environ. Microbiol. 2008,6: 1820-1828.基因工程菌發(fā)酵 基因工程菌紅霉素組分跟蹤基因工程菌紅霉素組分跟蹤 u50L50L發(fā)酵罐發(fā)酵批次數(shù)據(jù)發(fā)酵罐發(fā)酵批次數(shù)據(jù) 基因工程菌多參數(shù)相關分析基因工程菌多參數(shù)相關分析現(xiàn)生產(chǎn)菌種現(xiàn)生產(chǎn)菌種 6742 1626742 16212321232 五

27、、改進抗生素生產(chǎn)工藝氧：氧：將血紅蛋白基因克隆到將血紅蛋白基因克隆到放線菌中，促進有氧代謝、放線菌中，促進有氧代謝、菌體生長和抗生素合成。菌體生長和抗生素合成。傳統(tǒng)方法： 對發(fā)酵罐進行改造 （成本高 ，利用率?。┗蚬こ淘诳股厣a(chǎn)中的應用基因工程在抗生素生產(chǎn)中的應用基因工程方法：基因工程方法：引入血紅蛋白基因到產(chǎn)生菌中，在細胞中表達血紅蛋白，從提高細胞自身代謝功能解決溶氧供求矛盾透明顫菌血紅蛋白（Vitreoscilla hemolobin VHb)對氧的親和力提高，臨界氧下降DOOURCLCVHB透明顫菌血紅蛋白基因在產(chǎn)黃青霉中的克隆與表達l 產(chǎn)黃青霉生物量提高產(chǎn)黃青霉生物量提高9.76%

28、9.76%，青霉素產(chǎn)量提高了青霉素產(chǎn)量提高了9.68%9.68%中國抗生素雜志，中國抗生素雜志，20062006，7 7：400-402.400-402.六、產(chǎn)生雜合抗生素 組合生物合成：利用生物合成酶基因的底物寬容性及其相互作用進行生物合成酶基因的重組、組合、互補、替換等操作，以產(chǎn)生新結構化合物。與原有化合物相比，這些新化合物的結構改變可以發(fā)生在母核上，也可以發(fā)生在母核的修飾上。 用途用途 為功能化合物包括新藥的篩選提供人工“天然產(chǎn)物”庫 定向改造已有功能化合物提供了綠色途徑。 1.基因重組2.酶基因突變3.引入酶基因4.酶催化形成新產(chǎn)物組合生物合成操作策略紅霉素的組合生物合成紅霉素組合生物

29、合成：新化合物Basnet DB, et al. J.Biotechnol. 2008,135: 92-96.必特螺旋霉素簡介 利用組合生物合成技術將碳霉素產(chǎn)生菌的4”-異戊酰轉移酶基因（carE）克隆到螺旋霉素產(chǎn)生菌 Streptomyces spiramyceticus F21中而獲得的基因工程雜合抗生素 我國第一個基因工程抗生素，目前已作為一類新藥進入二期臨床 藥效學：表明必特螺旋霉素的抗菌活性及治療效果優(yōu)于乙酰螺旋霉素、麥迪霉素和紅霉素。必特螺旋霉素結構 R ： H COCH3COCH2CH3 R： COCH2CH(CH3)2 COCH2CH2CH3COCH2CH3 COCH2CH3C

30、OCH3靶酶受體第三節(jié) 細胞工程在傳統(tǒng)制藥工業(yè)中的應用抗生素類藥物總結一、定義 瓦克斯曼于1942年首先給抗生素下了一個明確的定義： 抗生素是一個低分子量的微生物代謝產(chǎn)物，在低濃度時（低于1mgmL）能抑制其他微生物生長。 81抗生素半合成抗生素次級代謝產(chǎn)物抗感染藥物抗菌藥物化學治療藥（化療藥）走出“化療就是腫瘤化療”的誤區(qū)如果說，原子彈是第二次如果說，原子彈是第二次世界大戰(zhàn)中殺傷力量最強世界大戰(zhàn)中殺傷力量最強的武器，那么，青霉素就的武器，那么，青霉素就是從這個戰(zhàn)場拯救生命最是從這個戰(zhàn)場拯救生命最多的藥物。難怪有人把原多的藥物。難怪有人把原子彈、雷達和青霉素并列子彈、雷達和青霉素并列為第二次世

31、界大戰(zhàn)期間的為第二次世界大戰(zhàn)期間的三大科學發(fā)明。三大科學發(fā)明。 1942年美國制藥公司對青霉年美國制藥公司對青霉素進行批量生產(chǎn)。素進行批量生產(chǎn)。1944年用于二戰(zhàn)盟軍年用于二戰(zhàn)盟軍青霉素終于在青霉素終于在1943年問世年問世86 S.A. Selman Abraham Waksman (18881973) 烏克蘭裔美國生物烏克蘭裔美國生物化學家化學家 土壤微生物學家土壤微生物學家 1952年獲得諾貝爾獎 瓦克斯曼瓦克斯曼拋棄了傳統(tǒng)的靠碰巧來分離抗生素的方法，開始通過篩選成千上萬的微生物來有意識、有目的地尋找抗生素。瓦克斯曼瓦克斯曼被稱為抗生素之父。被稱為抗生素之父。瓦克斯曼瓦克斯曼.S.A87

32、抗生素類藥物研制的歷史青霉素G19291958年batchelor分離6APA，半合成青霉素頭孢菌素C1961年鏈霉素（1944）氯霉素（1947）紅霉素（1952）萬古霉素（1956）金霉素 土霉素 四環(huán)素（1948） （1950 ）（1952）半合成四環(huán)素類半合成紅霉素類利福霉素（1958）卡那霉素（1958）慶大霉素（1963）利福平氨基糖苷類氨基糖苷類 內(nèi)內(nèi)酰胺類酰胺類氯霉素全合成（1949）881961年AbraHAM分離7ACA，半合成頭孢菌素多粘菌素多粘菌素B（1947）新霉素（新霉素（1948）林可霉素（林可霉素（1962）二、產(chǎn)生菌目前已知的天然抗生素不下萬種。主要來源于目前

33、已知的天然抗生素不下萬種。主要來源于: 放線菌來源：其中近半數(shù)為放線菌所產(chǎn)生，放線菌來源：其中近半數(shù)為放線菌所產(chǎn)生，其中主要是其中主要是鏈霉菌屬。鏈霉菌屬。如鏈霉素、金霉素、紅霉素、創(chuàng)新霉素、爭如鏈霉素、金霉素、紅霉素、創(chuàng)新霉素、爭光霉素和春雷霉素等；光霉素和春雷霉素等； 細菌來源：細菌所產(chǎn)生的有桿菌肽、短桿菌肽、多粘菌細菌來源：細菌所產(chǎn)生的有桿菌肽、短桿菌肽、多粘菌素等；素等； 真菌來源真菌來源（青霉菌和黑曲霉菌）（青霉菌和黑曲霉菌）：真菌所產(chǎn)生的有青霉：真菌所產(chǎn)生的有青霉素、灰質(zhì)霉素等。素、灰質(zhì)霉素等。89三、生物合成以生物合成途徑為基礎，抗生素可劃分為： 1. 一級代謝的同系物(氨基酸、核苷酸、輔酶等同系物)，這些小分子，生物合成的方式和結構上與一級代謝相似。 2. 由聚合作用產(chǎn)生的抗生素。902.由聚合作用產(chǎn)生的抗生素 （1） 多肽類抗生素及其衍生物，是由一些氨基酸聚合形成多肽鏈，再進一步進行改