第5章 目的基因的克隆與基因文庫的構建

1、基基 因因 工工 程程復旦大學 劉明秋1第五章第五章 目的基因的克隆與基因文庫的構建但是，但是，前提條件前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因，是從生物體基因組中分離克隆目的基因， 一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一類是構建感興趣的生物個體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立一類是構建感興趣的生物個體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克??；合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克??；另一類是利用另一類是利用PCR擴增技術甚至化學合成法體外直接合成目

2、的基因，然后將之克隆表達。擴增技術甚至化學合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達。 基因工程或基因工程或DNA重組技術重組技術三大用途三大用途: :1.1.或確定基因的表達調(diào)控機制和生物學功能；或確定基因的表達調(diào)控機制和生物學功能；2.2.或建立高效表達系統(tǒng)，構建具有經(jīng)濟價值的基因工程菌（細胞）；或建立高效表達系統(tǒng)，構建具有經(jīng)濟價值的基因工程菌（細胞）；3.3.或?qū)⒛康幕蛟隗w外進行必要的結構功能修飾，然后輸回細胞內(nèi)改或?qū)⒛康幕蛟隗w外進行必要的結構功能修飾，然后輸回細胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。2第五章第五章 目的基因的克隆與基因文

3、庫的構建鳥槍法鳥槍法cDNA法法PCR法法化學合成法化學合成法基因文庫的構建基因文庫的構建3一一 鳥槍法鳥槍法第五章第五章 目的基因的克隆與基因文庫的構建1.1 鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略1.2 鳥槍法操作的改進鳥槍法操作的改進1.3 鳥槍法克隆目的基因的局限性鳥槍法克隆目的基因的局限性41.1 鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 隨機克隆供體細胞的全基因組隨機克隆供體細胞的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進而獲得目的

4、基因。鳥槍法適重組子，進而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細菌目的基因的克隆分離用于原核細菌目的基因的克隆分離 51.1 鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略染色體染色體DNA的切斷的切斷 超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端 全酶切全酶切：片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控 部分酶切：片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整部分酶切：片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整 與載體連接與載體連接 如果轉化子采用菌落原位雜交

5、法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達型載體；如果轉化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達型載如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細胞；如果轉化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達受體細胞；如果轉化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達的受體細胞的受體細胞. .轉化轉化受體細胞受體細胞 篩選含有目的基因的目的重組子篩選含有目的基

6、因的目的重組子 菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的建立）菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的建立） 61.2 鳥槍法操作的改進鳥槍法操作的改進使用這一改進方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率. 使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA 71.2 鳥槍法操作的改進鳥槍法操作的改進例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于1.8 kb的的SalI片段中，將染色體片段中，將染色體DNA用用SalI切切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切

7、下開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當于相當于1.6 - 2.0 kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收塊，從此凝膠塊中回收DNA片段，然后片段，然后與載體進行拼接與載體進行拼接在連接前將在連接前將DNA片段進行分級分離片段進行分級分離 2.0 kb1.6 kb1.8 kb81.2 鳥槍法操作的改進鳥槍法操作的改進凍融法凍融法濾紙法濾紙法吸附法吸附法低融點凝膠法低融點凝膠法溶解法溶解法凝膠凝膠DNA片段片段 91.3 1.3 鳥槍法克隆目的基因的局限性鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得的最小長度的目

8、的基因不能獲得的最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結構不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結構10二二 cDNA法法第五章第五章 目的基因的克隆與基因文庫的構建 2.1 cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略2.2 cDNA法分離目的基因的基本程序法分離目的基因的基本程序 2.3 cDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性112.1 cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略mRNA2.1.1 c2.1.1 cDNA第一鏈的合成第一鏈的合成 ：（：（2種方法：種方法： oligo dT , ,隨機引物隨機引物）5ppp5G G AAAAAA

9、AAAAAAAAOH 35ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5cDNA第一鏈第一鏈引物引物退火退火逆轉錄酶逆轉錄酶dNTPs122.1.2 c2.1.2 cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成 煮沸煮沸NaOH 降解降解mRNA自身引導法：自身引導法：獲得的雙鏈獲得的雙鏈cDNA 5端會有幾對堿基缺失端會有幾對堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp

10、5TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTOH 3KlenowdNTPsS1132.1.2 c2.1.2 cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成 DNApol I dNTPsRNaesH置換合成法：置換合成法：避免了避免了cDNA雙鏈末端的缺損雙鏈末端的缺損5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAp 55 AAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55TTTTTTTTTTTTTTOH 3AAAAAAAAAAAAAA 55TTTTTTTTTTTTTT 33T

11、4-DNA ligase142.1.2 c2.1.2 cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成 dCTPTdT引導合成法：引導合成法：獲得的雙鏈獲得的雙鏈cDNA 能保留完整的能保留完整的5端序列端序列5ppp5G G AAAAAOH 3TTTTTp 53 HO5ppp5G G AAAAACCCCCCCOH 33 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGG3 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGGAAAAAOH 3NaOH退火退火KlenowdNTPs152.1 cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略法克

12、隆目的基因的基本戰(zhàn)略2.1.3 雙鏈cDNA的克隆 雙鏈平頭的雙鏈平頭的cDNA通常可以使用下列三種方法克隆入載體中：通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中： 平頭末端直接與載體連接，平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收但插入的片段無法回收 平頭兩端分別接同聚物尾，平頭兩端分別接同聚物尾，最好是最好是AT同聚物尾，這樣重組同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段核酸酶處理回收插入片段加裝人工接頭引入酶切口，加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收以便插入片段回收 161718192.2 cDNA法分離目的基因的基本程序法分離目的基因的基

13、本程序2.2.1 完備分離程序 提取細胞總mRNA，合成總cDNA，將之全部克隆，然后借助于合適的篩選手段找到目的重組子 篩選時，若使用的是多拷貝載體，則采用菌落原位雜交法篩選；若使用的是表達型載體，則采用菌落免疫雜交法篩選 完備分離程序適用于mRNA分子數(shù)少的目的基因的克隆，如人胰島素基因、干擾素基因、凝血因子VIII基因等 202.2 cDNA法分離目的基因的基本程序法分離目的基因的基本程序2.2.2 特異分離程序 提取細胞總mRNA，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標mRNA，由此合成雙鏈cDNA，然后進行克隆 特異分離程序較適用于mRNA豐度極高的目的基因克隆如血紅蛋白基因等 21cDNA法

14、分離目的基因的基本程序法分離目的基因的基本程序2.2.3 差異分離程序 利用兩組細胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRNA所對應的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆新基因 例如：正常的大鼠FR3T3成纖維細胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達的，需在多瘤病毒感染之后方可轉錄。任務是要分離克隆這些新基因，進而研究其生物學功能 222.2.3 差異分離程序 多瘤病毒感染的FR3T3細胞正常的FR3T3細胞總mRNA總mRNAcDNA雙鏈雙鏈cDNA單鏈單鏈cDNA提取提取mRNA合成合成cDNA合成第二鏈合成第二鏈克隆克隆提取mRNA共價交聯(lián)上柱原位原位雜交病毒誘導表達的基因cDNA克隆232.3

15、 cDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA結構 細菌或原核生物的mRNA半衰期很短 mRNA在細胞中含量少，對酶和堿極為敏感,分 離純化困難僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因 243 PCR法第五章第五章 目的基因的克隆與基因文庫的構建目的基因的克隆與基因文庫的構建 n1985年美國年美國Cetus公司的公司的Mullis等人建立起了一套大量快速地等人建立起了一套大量快速地擴增特異擴增特異DNA片段的系統(tǒng)，即聚合酶鏈式反應片段的系統(tǒng)，即聚合酶鏈式反應(polymerase chainreaction,PCR)系統(tǒng)。系統(tǒng)。nMullis在在1993年獲得了

16、諾貝爾化學獎。在一項年獲得了諾貝爾化學獎。在一項實用性的發(fā)明實用性的發(fā)明做做出后僅僅出后僅僅8年就榮質(zhì)諾貝爾獎，這在科學史上是絕無僅有的，這年就榮質(zhì)諾貝爾獎，這在科學史上是絕無僅有的，這也從另一個側面說明了也從另一個側面說明了PCR技術的重大價值。技術的重大價值。nPCR技術自問世以來已在生物學、醫(yī)學、考古學、人類學等許技術自問世以來已在生物學、醫(yī)學、考古學、人類學等許多領域內(nèi)獲得了廣泛的應用，可以說多領域內(nèi)獲得了廣泛的應用，可以說PCR技術給整個分子生物技術給整個分子生物學領域帶來了一場變革。同樣學領域帶來了一場變革。同樣PCR技術技術也成為在也成為在DNA重組技術重組技術領域獲得領域獲得外

17、源基因外源基因的一個有效手段，的一個有效手段，PCR技術就是在體外通過技術就是在體外通過酶促反應成百萬倍地擴增一段目的基因。酶促反應成百萬倍地擴增一段目的基因。25它要求反應體系具有以下條件：它要求反應體系具有以下條件：要有與被分離的目的基因兩條鏈各一端序列相互補的要有與被分離的目的基因兩條鏈各一端序列相互補的DNADNA引物引物( (約約2020個堿基個堿基左右左右) )；具有熱穩(wěn)定性的酶如具有熱穩(wěn)定性的酶如Taq DNATaq DNA聚合酶；聚合酶；dNTP; dNTP; 作為模板的目的作為模板的目的DNADNA序列。序列。一般一般PCRPCR反應可擴增出反應可擴增出1005000 bp1

18、005000 bp的目的基因。的目的基因。3.1 PCR法定向擴增目的基因的基本原理使用PCR法克隆目的基因的前提條件是： 已知待擴增目的基因或DNA片段兩側的序列，根據(jù)該序列化學合成聚合反應必需的雙引物2655目的基因目的基因5變性變性加熱加熱55引物引物退火退火55底物底物聚合聚合5555加熱加熱變性變性5555555555555555555555555退火退火 引物引物底物底物聚合聚合加熱加熱變性變性引物引物退火退火底物底物聚合聚合12327 由Taq DNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物中，其3末端總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是A，因為Taq DNA聚合酶對dATP

19、具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時即可以采取TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase，末端脫氧核苷酸轉移酶)末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使用專門的T載體克隆 3.2 PCR克隆目的基因的基本程序克隆目的基因的基本程序55AATT55PCR擴增產(chǎn)物T 載體T7lacZ MCSoriApr283.3 PCR方法的改進o 在獲得目的基因時，除了要用到普通的PCR方法外，還要用到一些改進的PCR方法，現(xiàn)分別介紹如下： 293.3.1 錨定PCR(anchored PCR)o 錨定PCR特別適合于擴增那些只知道一端序列的目的DNA。o 例如，

20、對于一端序列已知、一端序列未知的DNA片段， 可以通過DNA末端轉移酶給未知序列的那一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分別用多聚dC和已知的序列作為引物進行PCR擴增(圖234)。303.3.23.3.2反向反向PCR(inverse PCR)PCR(inverse PCR)o 反向反向PCRPCR特別適用于擴增已知序特別適用于擴增已知序列的兩端的未知序列。列的兩端的未知序列。o 具體方法：選擇一個在已知序具體方法：選擇一個在已知序列中沒有，而在其兩側都存在列中沒有，而在其兩側都存在的限制性內(nèi)切酶位點，用相應的限制性內(nèi)切酶位點，用相應的限制性內(nèi)切酶酶解后，將酶的限制性內(nèi)切酶酶解后，將酶切的片段在

21、連接酶的作用下環(huán)切的片段在連接酶的作用下環(huán)化，使得已知序列位于環(huán)狀分化，使得已知序列位于環(huán)狀分子上。根據(jù)已知序列的兩端序子上。根據(jù)已知序列的兩端序列設計兩個引物，以環(huán)狀分子列設計兩個引物，以環(huán)狀分子為模板，就可以擴增出已知序為模板，就可以擴增出已知序列兩側的未知序列列兩側的未知序列( (圖圖235)235)。314 化學合成法第五章第五章 目的基因的克隆與基因文庫的構建4.1 化學合成法的基本戰(zhàn)略4.2 化學合成的單元操作4.3 DNA化學合成的用途324.1 化學合成法的基本戰(zhàn)略化學合成法的基本戰(zhàn)略4.1.1 全基因合成化學合成目的基因的前提條件是基因的DNA序列已知，有三種戰(zhàn)略：l 小片段

22、粘接法： 混合退火根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體 334.1 化學合成法的基本戰(zhàn)略化學合成法的基本戰(zhàn)略4.1.1 全基因合成l 補釘延長法： 混合退火根據(jù)目的基因兩條互補鏈全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段以及20-30堿基長的單鏈DNA中片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體 Klenow酶聚合344.1 化學合成法的基本戰(zhàn)略4.1.1 全基因合成l 大片段酶促法： 混合退火根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長的單鏈DNA片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體 Klenow酶聚合354.1

23、 化學合成法的基本戰(zhàn)略化學合成法的基本戰(zhàn)略4.1.1 全基因合成 上述三種方法各有利弊：化學合成上述三種方法各有利弊：化學合成DNA的的單片段愈短，收率單片段愈短，收率就愈高，但由于化學合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法就愈高，但由于化學合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時，雖然化學合成的份額相對較小，成本較低，但大合成目的基因時，雖然化學合成的份額相對較小，成本較低，但大片段化學合成的收率極低，例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為片段化學合成的收率極低，例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為95%則合成則合成50個堿基長的個堿基長的DNA單鏈大片段的總收率只有單鏈大片段的總收率

24、只有7.7%364.1 化學合成法的基本戰(zhàn)略化學合成法的基本戰(zhàn)略4.1.2 探針等寡聚核苷酸合成探針等寡聚核苷酸合成 在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此時需要從已知的氨基酸序列推測為其序列，而基因序列未知，此時需要從已知的氨基酸序列推測為其編碼的編碼的DNADNA序列，然后合成探針，篩選由鳥槍法或序列，然后合成探針，篩選由鳥槍法或cDNAcDNA法得到法得到的重組子，最終獲得含有目的基因的目的重組子的重組子，最終獲得含有目的基因的目的重組子 由于大多數(shù)氨基酸擁有簡并密碼子，故在探針序列的設計時由于大多

25、數(shù)氨基酸擁有簡并密碼子，故在探針序列的設計時必須考慮下列問題：必須考慮下列問題：生物體對簡并密碼子的偏愛性，合成系列探針生物體對簡并密碼子的偏愛性，合成系列探針探針應具有足夠的長度，通常在探針應具有足夠的長度，通常在17-2017-20個核苷酸之間個核苷酸之間探針內(nèi)部不應出現(xiàn)可能的互補區(qū)域探針內(nèi)部不應出現(xiàn)可能的互補區(qū)域374.1 化學合成法的基本戰(zhàn)略化學合成法的基本戰(zhàn)略4.1.2 探針等寡聚核苷酸合成某段連續(xù)的氨基酸序列 CysMet AspGluMetLys ArgAsnIle所有可能的DNA序列TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T C C

26、GA CGG CGT CGC設計的簡并探針序列TGTATGGACGAAATGATGTATGGATGAAATGATGCATGGACGAGATGATGCATGGATGAGATGA 此外還可以參考各種生物體的EST數(shù)據(jù)庫進行傾向性簡并序列設計expressed sequence tag384.2 化學合成的單元操作化學合成的單元操作 化學合成DNA的實質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個個接上去，每接一個單體就是一個循環(huán)反應，包括：基團保護、激活、縮合、分離、去保護五大操作單元。 從反應機理上來講，DNA化學合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸液三酯法；具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種形式。前

27、者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應中間物的分離程序簡便，DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸液三酯法原理設計的。（固定，每一步可以過量反應試劑，保證反應完全進行）394.2 化學合成的單元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeOHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMT： 二甲氧基三苯甲基二甲氧基三苯甲基激活激活縮合縮合氧化氧化脫取代基脫取代基玻璃珠玻璃珠連接臂連接臂40表2 2 化 學 合 成D N A的 產(chǎn) 率 與 偶 聯(lián) 效 率 的 關 系 偶 聯(lián) 效 率 D N A合 成 的 產(chǎn) 率 （ ） （ ） 20堿 基 40堿 基 60堿 基

28、 80堿 基 100堿 基 90 95 98 99 99.5 12 36 67 82 90 1.5 13 45 67 82 0.18 4.6 30 55 74 0.02 1.7 20 45 67 0.003 0.6 13 37 61 為了保證為了保證DNADNA化學合成的產(chǎn)量，要求每步的效率都在化學合成的產(chǎn)量，要求每步的效率都在9898以上以上( (表表2 22)2)，所以在反應過程中要對偶聯(lián)效率加以監(jiān)控。常用的方法是，所以在反應過程中要對偶聯(lián)效率加以監(jiān)控。常用的方法是利用分光光度計檢測在每步反應中脫下的三苯甲基的濃度，從而利用分光光度計檢測在每步反應中脫下的三苯甲基的濃度，從而推算出反應的效

29、率。推算出反應的效率。414.3 DNA化學合成的用途化學合成的用途4.3.1 合成天然基因合成天然基因4.3.2 4.3.2 修飾改造基因修飾改造基因 4.3.4 設計新型基因設計新型基因 制備探針、引物、接頭 如生長激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素基因等如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等 425 基因文庫的構建第五章 目的基因的克隆與基因文庫的構建5.1 基因文庫的基本概念5.2 基因文庫的構建程序5.3 基因組文庫重組克隆的排序435.1 基因文庫的基本概念基因文庫的基本概念5.1.1 基因庫與基因文庫基因庫（gene pool） 特定生物體全基因組的集合（天然

30、存在）特定生物體全基因組的集合（天然存在） 基因文庫（gene library or gene bank） 從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式基因組文庫（含有全部基因）（含有全部基因） 存在（人工構建）。根據(jù)構建方法的不同，基因文庫分為：存在（人工構建）。根據(jù)構建方法的不同，基因文庫分為： cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結構基因）（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結構基因） 445.1 基因文庫的基本概念5.1.2 基因文庫構建的基本戰(zhàn)略用鳥槍法構建基因組文庫，材料來自染色體材料來自染色體DNA用cDNA法構建cDNA文庫，材料來自

31、材料來自mRNA在高度分化的生物體中，不同組織和細胞在不同時段的在高度分化的生物體中，不同組織和細胞在不同時段的mRNA種種類不同類不同（即基因的表達譜不同），（即基因的表達譜不同），因此同種生物體的因此同種生物體的cDNA文庫文庫一般還有組織細胞的界定，如肝組織一般還有組織細胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織文庫或胚胎組織cDNA文庫等。很顯然，文庫等。很顯然， cDNA文庫的信息量遠小于基因組文庫文庫的信息量遠小于基因組文庫4546o 當目的基因在某一細胞類型中高表達時，這種利用當目的基因在某一細胞類型中高表達時，這種利用mRNA的克隆方法顯得特別有用。的克隆方法顯得特別有用。例如，

32、麥醇溶蛋白是小麥中一種重要的營養(yǎng)蛋白，在發(fā)育例如，麥醇溶蛋白是小麥中一種重要的營養(yǎng)蛋白，在發(fā)育的小麥種子中，編碼的麥醇溶蛋白基因高水平表達。的小麥種子中，編碼的麥醇溶蛋白基因高水平表達。這些細胞中總這些細胞中總mRNA的的30是麥醇溶蛋白的是麥醇溶蛋白的mRNA。顯然，如果從小麥種子中克隆顯然，如果從小麥種子中克隆mRNA，將會得到大量特將會得到大量特異表達麥醇溶蛋白的克隆。異表達麥醇溶蛋白的克隆。47o得到的得到的cDNAcDNA克隆代表了最初制備時的克隆代表了最初制備時的mRNAmRNA。mRNA可通過可通過cDNA進行進行克隆克隆485.1 基因文庫的基本概念基因文庫的基本概念5.1.3

33、 基因文庫的完備性基因文庫的基因文庫的完備性完備性是指：在構建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與是指：在構建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關系可用下式表示：之間的關系可用下式表示：N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )其中：其中： P = P = 任一基因被克隆（或存在于基因文庫中）的概率任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕?f = f = 克隆片段的平均大小克隆片段的平均大小 / / 生物基因組的大小生物基因組的大小例如，人的單倍體例如，人的單倍體DNA總長為總長為2.9 x 109 bp，基因文庫中克隆片段的

34、平均基因文庫中克隆片段的平均大小為大小為15 kb，則構建一個完備性為則構建一個完備性為0.9的的基因文庫至少需要基因文庫至少需要45萬個克??；萬個克?。欢斖陚湫蕴岣叩蕉斖陚湫蕴岣叩?.9999時，基因文庫至少需要時，基因文庫至少需要180萬個克隆萬個克隆495.1 基因文庫的基本概念5.1.4 基因文庫的質(zhì)量標準除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因文庫應具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大 以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度 避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域 以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選505.2

35、基因文庫的構建程序基因文庫的構建程序5.2.1 基因組DNA的制備 為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性，為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性， 用于基因組用于基因組文庫構建的文庫構建的DNA在分離純化操作中應在分離純化操作中應盡量避免過度的斷裂。盡量避免過度的斷裂。制備的制備的DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高的比率就越低，重組率和完備性也就越高AAAA用常規(guī)方法制備的染色體用常規(guī)方法制備的染色體DNA的長度一般在的長度一般在100 kb左右左右如果先將細胞固定在低融

36、點凝如果先將細胞固定在低融點凝膠中，然后置入含有膠中，然后置入含有SDS、蛋蛋白酶白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得的緩沖液中浸泡，可獲得1000 kb大小的大小的DNA片段片段515.2 基因文庫的構建程序5.2.2 基因組DNA的切割 用于用于基因組基因組文庫構建的文庫構建的DNA片段的切割一般采用片段的切割一般采用超聲波處理和超聲波處理和限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶部分酶切部分酶切兩種方法，其目的是：兩種方法，其目的是： 第一，保證第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)片段之間存在部分重疊區(qū) 第二，保證第二，保證DNA片段大小均一片段大小均一超聲波處理超聲波處理后的后的DNA片段呈平頭

37、末端，需加裝人工接頭片段呈平頭末端，需加裝人工接頭 部分酶切法部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：如：Sau3AI或或MboI等，這樣等，這樣DNA酶解片段的大小可控酶解片段的大小可控 連接前，上述處理的連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體！片段隨機連為一體！52535.2 基因文庫的構建程序5.2.3 載體和受體的選擇 出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如

38、動植物和人類）需使用YAC或BAC載體l-DNA 由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文庫構建的載體.通常選質(zhì)粒 上述幾種載體的最大裝載量如下：質(zhì)粒考斯質(zhì)粒15 kb25 kb45 kbBAC300 kbYAC400 kb 用于基因文庫構建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌5455n柯斯質(zhì)粒上帶有多個單克隆位點柯斯質(zhì)粒上帶有多個單克隆位點(RE2)，兩個兩個cos位點，位點，DNA復制啟始位點和抗生素抗性基因復制啟始位點和抗生素抗性基因，在兩個，在兩個cos位點之間還有一個限制性內(nèi)切酶位位點之間還有一個限制性內(nèi)切酶位點點(RE1)。n克隆時，先用克隆時，先用REl將

39、柯斯質(zhì)粒切開，再用單克隆將柯斯質(zhì)粒切開，再用單克隆位點中的某個限制性內(nèi)切酶位點中的某個限制性內(nèi)切酶(RE2)酶解，然后將酶解，然后將用經(jīng)用經(jīng)RE2酶解的長約酶解的長約40kb大小的外源大小的外源DNA片段片段克隆進單克隆位點，形成一個長約克隆進單克隆位點，形成一個長約50kb的線性的線性DNA分子，分子，n這個這個DNA分子由于含有兩個相距約分子由于含有兩個相距約50kb的的cos位點，因此可以在體外包裝進入空的噬菌體頭位點，因此可以在體外包裝進入空的噬菌體頭部，沒有插入部，沒有插入DNA的空載體或插入片段大小不的空載體或插入片段大小不符合要求的重組分子則無法包裝。符合要求的重組分子則無法包裝

40、。n重組噬菌體的重組噬菌體的DNA可以通過侵染大腸桿菌而傳可以通過侵染大腸桿菌而傳遞。一旦進入大腸桿菌，由于進入頭部時兩個遞。一旦進入大腸桿菌，由于進入頭部時兩個cos位點都已切割掉了，它們通過堿基配對可以位點都已切割掉了，它們通過堿基配對可以將整個將整個DNA分子變成一個環(huán)狀的質(zhì)粒分子，復分子變成一個環(huán)狀的質(zhì)粒分子，復制起始位點的存在又可以保證其在宿主細胞中制起始位點的存在又可以保證其在宿主細胞中穩(wěn)定復制保存，轉化的細胞可以通過穩(wěn)定復制保存，轉化的細胞可以通過 抗生素進抗生素進行篩選。行篩選。n柯斯質(zhì)粒適用于作基因簇和大基因的克隆。柯斯質(zhì)粒適用于作基因簇和大基因的克隆。565.2 基因文庫的

41、構建程序基因文庫的構建程序5.2.4 從基因文庫中篩選目的基因從基因文庫中篩選目的基因 大型基因組大型基因組文庫文庫一般由數(shù)十萬甚至上百萬個重組克隆組成。除一般由數(shù)十萬甚至上百萬個重組克隆組成。除了一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結合蛋白了一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結合蛋白編碼基因等）可以采用特殊的編碼基因等）可以采用特殊的正選擇篩選正選擇篩選程序程序（如（如抗藥性篩選法抗藥性篩選法、酵母雙雜交技術酵母雙雜交技術等）直接篩選外，一般的基因組等）直接篩選外，一般的基因組文庫篩選均需多輪文庫篩選均需多輪操作步驟操作步驟57o 對細菌、酵母和真菌來講，一個完整的

42、基因組文對細菌、酵母和真菌來講，一個完整的基因組文庫所需的克隆數(shù)還是在可操作的范圍內(nèi)的。庫所需的克隆數(shù)還是在可操作的范圍內(nèi)的。 但植物和動物的一個完整的基因組文庫包含了太但植物和動物的一個完整的基因組文庫包含了太多的不同的克隆，如要從中鑒定出目的克隆，工多的不同的克隆，如要從中鑒定出目的克隆，工作量是相當龐大的。作量是相當龐大的。o 對于這些生物體來說，只針對某一特定細胞類型對于這些生物體來說，只針對某一特定細胞類型而非整個生物體的基因文庫，可能更為有用。而非整個生物體的基因文庫，可能更為有用。58基因文庫的篩選基因文庫的篩選o 構建了文庫以后，就需要鑒定出文庫中帶有目的構建了文庫以后，就需要

43、鑒定出文庫中帶有目的序列的克隆。有序列的克隆。有3種通用的鑒定方法，種通用的鑒定方法，o 一是用標記的一是用標記的DNA探針作探針作DNA雜交；雜交；o 二是用抗體對蛋白產(chǎn)物進行免疫雜交；二是用抗體對蛋白產(chǎn)物進行免疫雜交；o 三是對蛋白的活性進行鑒定。三是對蛋白的活性進行鑒定。595.2.4.1 DNA雜交篩選雜交篩選o DNA雜交成功與否取決于探針和目的序列之雜交成功與否取決于探針和目的序列之間的堿基對能否形成穩(wěn)定的堿基配對。間的堿基對能否形成穩(wěn)定的堿基配對。o 雙鏈雙鏈DNA分子可以通過熱處理或堿變性的方分子可以通過熱處理或堿變性的方法變性成單鏈的法變性成單鏈的DNA分子。分子。o 如果加

44、熱后迅速冷卻，那么破壞了氫鍵的如果加熱后迅速冷卻，那么破壞了氫鍵的DNA鏈就會保持單鏈的形式鏈就會保持單鏈的形式(變性變性)。o 如果加熱后溫度緩慢下降，那么如果加熱后溫度緩慢下降，那么DNA的雙螺的雙螺旋的構型就會在堿基配對作用下重新恢復旋的構型就會在堿基配對作用下重新恢復(復復性性 ) 。 加 熱 后 慢 慢 冷 卻 的 過 程 稱 為 退 火。 加 熱 后 慢 慢 冷 卻 的 過 程 稱 為 退 火(annealing)。o 退火后有的退火后有的DNA分子的兩條鏈分別來自于不分子的兩條鏈分別來自于不同的同的DNA分子，即形成了雜合分子，即形成了雜合DNA分子。分子。60DNA雜交篩選(2

45、)o 在DNA雜交實驗中，目的DNA先變性，然后把單鏈的目的DNA在高溫下結合到硝酸纖維素膜或尼龍膜上。單鏈DNA探針用放射性同位素或其他物質(zhì)進行標記，與膜一起保溫。o 如果DNA探針與樣品中的某一個核苷酸序列互補的話，那么通過堿基配對的作用就會形成雜合分子(圖2-21)，o 最后通過放射自顯影或其他方式檢測出來。o 通常，探針的長度在100 bp至 1 kb之間，但有時用小于100 bp 或大于 1 kb 的探針，也能得到較好的結果。o 雜交反應的條件非常重要，穩(wěn)定的結合往往需要在至少50個堿基的片段里80的堿基完全配對。61探針的同位素標記oDNA探針的標記方法有多種，隨機引物法即是其中的

46、一種。隨機引物法用的是人工合成的隨機六聚核苷酸，把這些六聚核苷酸的混合物作為DNA合成的引物。根據(jù)概率來算，這些引物至少會有一些與探針DNA模板互補(圖222)。o當寡聚引物與變性的探針DNA混合后，加入4種脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)和大腸桿菌DNA聚合酶 I 的Klenow片段，Klenow片段保持了DNA聚合酶和3外切酶的活性，但它沒有5外切酶的活性，因而不會降解新合成的DNA鏈。o這些隨機引物在酶的作用下，合成新的DNA鏈。如果使用放射性同位素標記，就在其中的一種脫氧核糖核苷三磷酸的。磷酸位置上換上同位素32P(圖2-23)，這樣，新合成的DNA分子就被同位素標記上了。62非同位素

47、標記法非同位素標記法o 可以把生物素可以把生物素(biotin)等非同位素標記物連接到其中一種脫氧等非同位素標記物連接到其中一種脫氧核糖核苷三磷酸中，然后摻入到新合成的核糖核苷三磷酸中，然后摻入到新合成的DNA鏈中。要檢測這鏈中。要檢測這種標記需要利用一種中間化合物，即鏈霉抗生物素蛋白種標記需要利用一種中間化合物，即鏈霉抗生物素蛋白(streptavidtn)，它能與生物素結合，同時它自身帶有某種酶，它能與生物素結合，同時它自身帶有某種酶，可以催化形成有顏色的化合物，最后的結果通過肉眼就能分辨可以催化形成有顏色的化合物，最后的結果通過肉眼就能分辨出來。出來。GCTTGAGCAGTAACCTG生

48、色底物生色底物顏色產(chǎn)物顏色產(chǎn)物Biotin 生物素生物素烷烴連接臂烷烴連接臂Avidin 生物素結合蛋白生物素結合蛋白顯色酶顯色酶63用于篩選基因文庫的探針來源用于篩選基因文庫的探針來源o 一是從近緣生物體中克隆的一是從近緣生物體中克隆的DNA用作異源探針，用作異源探針，這種情況的雜交條件應該調(diào)整到要允許一定程度這種情況的雜交條件應該調(diào)整到要允許一定程度的探針與目標的探針與目標DNA之間的錯配，以補償這兩種的之間的錯配，以補償這兩種的序列之間自然存在的差異；序列之間自然存在的差異；o 二是根據(jù)從一個目的基因編碼的蛋白的已知氨基二是根據(jù)從一個目的基因編碼的蛋白的已知氨基酸序列推導出可能的核苷酸序

49、列。通過化學合成酸序列推導出可能的核苷酸序列。通過化學合成的方法來合成一個探針。的方法來合成一個探針。64基因文庫的篩選過程o 基因文庫通常先涂布到母基因文庫通常先涂布到母盤培養(yǎng)基上，然后再把這盤培養(yǎng)基上，然后再把這些菌落的樣品吸印到硝酸些菌落的樣品吸印到硝酸纖維素膜或尼龍膜上。然纖維素膜或尼龍膜上。然后裂解細胞，去掉蛋白質(zhì)，后裂解細胞，去掉蛋白質(zhì)，使使DNA變性，結合在膜上變性，結合在膜上; 這時加入標記的探針，如這時加入標記的探針，如果出現(xiàn)雜交信號，那么從果出現(xiàn)雜交信號，那么從母盤上就可以把包含雜交母盤上就可以把包含雜交信號的菌落分離、培養(yǎng)出信號的菌落分離、培養(yǎng)出來來(圖圖224)。65篩

50、選結果的分析篩選結果的分析o 由于大多數(shù)基因文庫都是通過由于大多數(shù)基因文庫都是通過部分酶解的方式構建部分酶解的方式構建的，因此雜的，因此雜交一般都會得到多個陽性克隆。要鑒定哪一個克隆包含了目的交一般都會得到多個陽性克隆。要鑒定哪一個克隆包含了目的基因的完整的序列，就要通過凝膠電泳和限制性內(nèi)切酶酶譜先基因的完整的序列，就要通過凝膠電泳和限制性內(nèi)切酶酶譜先初步分析出每一個插入片段的長度，同時也鑒定出完全相同的初步分析出每一個插入片段的長度，同時也鑒定出完全相同的克隆以及有重疊序列的克隆。通過序列的重疊，就可能得到一克隆以及有重疊序列的克隆。通過序列的重疊，就可能得到一個完整的基因，如果一個克隆中的

51、插入大到可以包含一個完整個完整的基因，如果一個克隆中的插入大到可以包含一個完整的基因，那么就可以通過的基因，那么就可以通過DNA測序來認定，看它是否有起始測序來認定，看它是否有起始密碼子和終止密碼子。密碼子和終止密碼子。o 在一個文庫里人們有可能得不到某個基因的完整序列，這就需在一個文庫里人們有可能得不到某個基因的完整序列，這就需要用另一個不同的限制性內(nèi)切酶去構建另一個文庫，再用原先要用另一個不同的限制性內(nèi)切酶去構建另一個文庫，再用原先的探針進行篩選。還有就是構建一種插入片段比原來核基因的的探針進行篩選。還有就是構建一種插入片段比原來核基因的平均長度大的基因文庫，以增加獲得完整目的基因的可能性

52、。平均長度大的基因文庫，以增加獲得完整目的基因的可能性。665.2.4.2 通過免疫反應篩選o如果沒有如果沒有DNA探針，還可以用其他的方探針，還可以用其他的方法來篩選文庫。法來篩選文庫。o例如，如果一個目的例如，如果一個目的DNA序列可以轉錄序列可以轉錄和翻譯，那么只要出現(xiàn)這種蛋白，甚至只和翻譯，那么只要出現(xiàn)這種蛋白，甚至只需要蛋白的一部分，就可以用免疫的方法需要蛋白的一部分，就可以用免疫的方法來檢測。來檢測。o從技術上講，這個過程與從技術上講，這個過程與DNA雜交過程雜交過程有許多共同之處。先對文庫中所有的克隆有許多共同之處。先對文庫中所有的克隆都在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，然后轉到膜上，都在培養(yǎng)

53、基上進行培養(yǎng)，然后轉到膜上，對膜進行處理，使菌裂解，同時釋放出蛋對膜進行處理，使菌裂解，同時釋放出蛋白質(zhì)附著于膜上，這時加入針對某一目的白質(zhì)附著于膜上，這時加入針對某一目的基因編碼的蛋白的抗體基因編碼的蛋白的抗體(稱為一抗稱為一抗)，反，反應后多余的雜物經(jīng)洗脫除去；再加入針對應后多余的雜物經(jīng)洗脫除去；再加入針對一抗的第二種抗體一抗的第二種抗體(稱為二抗稱為二抗)，二抗上，二抗上通 常 都 連 有 一 種 酶 ， 如 堿 性 磷 酸 酶通 常 都 連 有 一 種 酶 ， 如 堿 性 磷 酸 酶(alkaline phosphatase)等，再次洗等，再次洗脫后就加入該酶的一種無色底物。如果二脫后

54、就加入該酶的一種無色底物。如果二抗與一抗結合，無色底物就會被連在二抗抗與一抗結合，無色底物就會被連在二抗上的酶水解，從而產(chǎn)生一種有顏色的產(chǎn)物上的酶水解，從而產(chǎn)生一種有顏色的產(chǎn)物(圖圖225)。n在培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌落在培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌落n 轉膜轉膜n菌落影印在膜上菌落影印在膜上n 裂解裂解n菌落的蛋白質(zhì)裸露出來菌落的蛋白質(zhì)裸露出來n 加一抗加一抗n一抗與裸露的蛋白質(zhì)結合一抗與裸露的蛋白質(zhì)結合n 洗去游離的一抗洗去游離的一抗n 加二抗加二抗n二抗與一抗結合二抗與一抗結合n 洗去游離的二抗洗去游離的二抗n 加顯色劑加顯色劑n 顯色顯色n找出陽性克隆找出陽性克隆 圖圖225 通過免疫反應進行基因文庫的篩選

55、通過免疫反應進行基因文庫的篩選67通過免疫反應篩選(2)o 根據(jù)發(fā)生顏色變化的克隆所在的位置，找出原始的培養(yǎng)板上與之相對應的克隆，這個克隆可能包含一個完整的基因，也可能包含基因的一部分，但即使是基因的一部分，它也能產(chǎn)生足以讓一抗識別的蛋白結構域區(qū)域。o 因此，還需要進一步鑒定陽性克隆中包含的基因是否完整。 685.2.4.3 通過酶活性篩選通過酶活性篩選o如果目的基因編碼一種酶，而這種酶又是宿主細胞所不能編碼的，那么就可以通過檢查酶活性存在與否來篩選目的基因。o例如，多種生物體中編碼淀粉酶、葡聚糖內(nèi)切酶(endoglucanase)和葡糖苷酶(-glucosidase)的基因就是通過這種方法分離出來的，即先把核基因文庫轉入一選擇性菌株，鋪在帶有一種特定底物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選那些可以利用這種底物的克隆。o如果要尋找的基因所編碼的蛋白對突變的宿主菌細胞的生長極為重要的話，那么將基因文庫導人這些突變的細胞以后，那些能在沒有所需底物的基本培養(yǎng)基上生長的細胞中必定就帶有一個具功能的目的基因。o運用這種遺傳互補的方法已經(jīng)成功地分離出了許多具有重要功能的基因，包括那些與