DNA分子遺傳標記在中藥中的應(yīng)用

1、u廣義的分子標記（廣義的分子標記（molecular marker）是指可遺傳的并可檢測的）是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。常用的是狹義序列或蛋白質(zhì)。常用的是狹義的分子標記概念，即的分子標記概念，即DNA分子標記。分子標記。DNA分子標記主要分為以下三類分子標記主要分為以下三類 一、限制性片段長度多態(tài)性（一、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）：）：是發(fā)展最早的分子標記技術(shù)，以分子是發(fā)展最早的分子標記技術(shù)，以分子雜交為核心技術(shù)。雜交為核心技術(shù)。二、二、DNA序列測定序列測定三、基于三、基于PCR的分子標記：根據(jù)引的分子標記：根據(jù)引物的選擇可分為隨機引物擴增物的選擇可分為隨機引物擴增和特定

2、序列位點擴增。和特定序列位點擴增。1. 隨機擴增多態(tài)性隨機擴增多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphic DNA,RAPD）。）。隨機引物擴增隨機引物擴增PCR（Arbitrary Primer-PCR,AP-PCR）2、DNA擴增產(chǎn)物指紋分析（擴增產(chǎn)物指紋分析（DNA amplification fingerprinting,DAF）:與與RAPD技術(shù)不同的是引物濃度更高，長度更技術(shù)不同的是引物濃度更高，長度更短（短（58個個bp），只有），只有2個溫度循環(huán)（在個溫度循環(huán)（在RAPD中是中是3個溫度循環(huán)），一般用聚丙烯酰個溫度循環(huán)），一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳。胺凝

3、膠電泳。3、特征擴增區(qū)段測序（、特征擴增區(qū)段測序（Sequence-characterized amplified regions，SCAR）：先做）：先做RAPD分析，然后克隆目標分析，然后克隆目標RAPD片段進行測序，根據(jù)片段進行測序，根據(jù)RAPD片段兩末端片段兩末端的序列設(shè)計特定引物（一般比的序列設(shè)計特定引物（一般比RAPD引物長，引物長，24bp），再進行），再進行PCR擴增，可把與原擴增，可把與原RAPD片段相對應(yīng)的單一位點鑒定出來，可重復(fù)性片段相對應(yīng)的單一位點鑒定出來，可重復(fù)性高。高。uRFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制

4、性內(nèi)切，限制性內(nèi)切酶切片段長度多態(tài)性酶切片段長度多態(tài)性)是是70年代發(fā)展起年代發(fā)展起來的來的DNA片段分析技術(shù)。該技術(shù)不僅片段分析技術(shù)。該技術(shù)不僅在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)的許多領(lǐng)域都有在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)的許多領(lǐng)域都有了成功的應(yīng)用，而且在中藥材品種基源了成功的應(yīng)用，而且在中藥材品種基源及其地理品系、栽培品系的質(zhì)量評價方及其地理品系、栽培品系的質(zhì)量評價方面也有許多應(yīng)用。面也有許多應(yīng)用。 u生物在進化過程中，由于種種原因引起生物在進化過程中，由于種種原因引起基因突變和基因突變和DNA分子結(jié)構(gòu)重排，造成分子結(jié)構(gòu)重排，造成了分子內(nèi)核苷酸排列順序的改變，當這了分子內(nèi)核苷酸排列順序的改變，當這種改變涉及到限制

5、性酶切位點時，酶切種改變涉及到限制性酶切位點時，酶切后產(chǎn)生的后產(chǎn)生的DNA片段長度將發(fā)生變化，片段長度將發(fā)生變化，限制性片段的長度在不同個體間呈多態(tài)限制性片段的長度在不同個體間呈多態(tài)性現(xiàn)象，即稱為限制性片段長度多態(tài)性現(xiàn)象，即稱為限制性片段長度多態(tài)(Restriction Fragment Length Polymorphism,簡稱簡稱RFLP) Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)Enzymes cut DNA at specific sequencesRestriction sites are often palindromes:

6、6-cutter GAATTC4-cutter TCGA CTTAAGAGCTu堿基對突變類型堿基對突變類型(基因點突變基因點突變),即限制即限制性內(nèi)切酶識別位點上發(fā)生了單個堿基替性內(nèi)切酶識別位點上發(fā)生了單個堿基替換換(轉(zhuǎn)換或顛換轉(zhuǎn)換或顛換)，使原有切點消失或產(chǎn)，使原有切點消失或產(chǎn)生新的切點。生新的切點。u結(jié)構(gòu)重排型，這是由結(jié)構(gòu)重排型，這是由DNA內(nèi)部發(fā)生較內(nèi)部發(fā)生較大的順序變化所引起的大的順序變化所引起的 。u靶靶DNA的準備的準備 u核酸探針的標記核酸探針的標記 u雜交顯示雜交顯示 u優(yōu)點：優(yōu)點： (1)普遍存在普遍存在 (2)穩(wěn)定性穩(wěn)定性 (3)共顯性共顯性 (4)探針與限制酶的組合數(shù)量

7、無限探針與限制酶的組合數(shù)量無限 u局限性：局限性： （1）用）用RFLP僅能檢測出影響到限制性內(nèi)切酶識別位點的突僅能檢測出影響到限制性內(nèi)切酶識別位點的突變變 （2）步驟多，工作量大，而且接觸的放射性污染也多）步驟多，工作量大，而且接觸的放射性污染也多 （3）RFLP分析技術(shù)要求分析技術(shù)要求DNA無顯著降解，因此只適用于新無顯著降解，因此只適用于新鮮的材料，難適用于干燥藥材的鑒別鮮的材料，難適用于干燥藥材的鑒別 （4）限制性內(nèi)切酶價格較貴）限制性內(nèi)切酶價格較貴 “Ladder”（一）近緣種的鑒別 如：海馬的PCR-RFLP分析 （二）藥用植物親緣關(guān)系的研究 如：羽扇豆屬植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及與生 物

8、堿分布的關(guān)系 uRAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態(tài)性，隨機擴增多態(tài)性DNA)技術(shù)是技術(shù)是1990年年由杜邦公司由杜邦公司W(wǎng)illiams和和Welsh兩個研究小組兩個研究小組同時發(fā)展起來的一項同時發(fā)展起來的一項DNA多態(tài)檢測技術(shù)。該多態(tài)檢測技術(shù)。該技術(shù)高效、靈敏、簡便、快速，一經(jīng)出現(xiàn)就技術(shù)高效、靈敏、簡便、快速，一經(jīng)出現(xiàn)就被普遍用于物種種屬分類、親緣關(guān)系分析、被普遍用于物種種屬分類、親緣關(guān)系分析、物種起源鑒定、目的基因篩選、農(nóng)作物育種物種起源鑒定、目的基因篩選、農(nóng)作物育種等研究領(lǐng)域。近年，等研究領(lǐng)域。近年，RAPD技術(shù)又進入了中技術(shù)又進入了

9、中藥材的鑒別研究領(lǐng)域，并得到廣泛應(yīng)用，已藥材的鑒別研究領(lǐng)域，并得到廣泛應(yīng)用，已成為目前用于中藥材鑒定報道最多的分子遺成為目前用于中藥材鑒定報道最多的分子遺傳標記技術(shù)。傳標記技術(shù)。uRAPD的核心技術(shù)是的核心技術(shù)是PCR反應(yīng)，但又不反應(yīng)，但又不同于經(jīng)典的同于經(jīng)典的PCR。它是以任意序列的寡。它是以任意序列的寡核苷酸為引物進行核苷酸為引物進行PCR擴增，擴增，Williams稱之為稱之為RAPD，引物通常為，引物通常為10個堿基；個堿基；Welsh稱之為稱之為AP-PCR(Arbitrary Primer PCR)，引物，引物為為2030個堿基。對于任一引物，如個堿基。對于任一引物，如在一定范圍內(nèi)

10、模板在一定范圍內(nèi)模板DNA上有與之互補上有與之互補的反向重復(fù)序列時，就可擴增出此范圍的反向重復(fù)序列時，就可擴增出此范圍的的DNA片段。片段。u模板模板DNA的制備的制備 uPCR擴增，通常擴增，通常RAPD擴增條件為：擴增條件為：93預(yù)預(yù)變性變性200s，開始如下循環(huán)：，開始如下循環(huán)：94變性變性lmin，36退火退火1min，72延伸延伸2min；經(jīng)過；經(jīng)過40個循環(huán)后，個循環(huán)后，72延伸延伸5min，循環(huán)結(jié)束后反，循環(huán)結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物置于應(yīng)產(chǎn)物置于4保存。保存。 u擴增產(chǎn)物擴增產(chǎn)物20l反應(yīng)產(chǎn)物走凝膠電泳，經(jīng)溴化反應(yīng)產(chǎn)物走凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色檢測擴增的情況乙錠染色檢測擴增的情況 uRAP

11、D圖譜的數(shù)據(jù)處理圖譜的數(shù)據(jù)處理 u優(yōu)越性：優(yōu)越性： (1)無需預(yù)知被研究的生物基因組核苷酸順序，也無需專無需預(yù)知被研究的生物基因組核苷酸順序，也無需專門設(shè)計門設(shè)計RAPD擴增反應(yīng)的引物，引物隨機合成或是任意擴增反應(yīng)的引物，引物隨機合成或是任意選定的選定的,長度一般為長度一般為9-10個寡核苷酸；個寡核苷酸； (2)擴增沒有特異性；擴增沒有特異性； (3)退火溫度較低，一般為退火溫度較低，一般為36，這能保證短核苷酸引，這能保證短核苷酸引物與模板的穩(wěn)定配對，同時也允許了適當?shù)腻e誤配對，物與模板的穩(wěn)定配對，同時也允許了適當?shù)腻e誤配對，以擴大引物在基因組以擴大引物在基因組DNA中配對的隨機性。中配對

12、的隨機性。 (4)簡便易行，省力省時。簡便易行，省力省時。 （5）檢測靈敏方便；）檢測靈敏方便； （6）所需樣品）所需樣品DNA量極少，僅為量極少，僅為10ng,為為RFLP的的1/l000l/2000。 （7）能自動化。）能自動化。u不足：不足： （1）重復(fù)性不高。）重復(fù)性不高。RAPD在擴增反應(yīng)時使用的在擴增反應(yīng)時使用的是低溫復(fù)性是低溫復(fù)性(通常為通常為36),特異性不高特異性不高,引物與模引物與模板間有較高的錯配率板間有較高的錯配率,結(jié)果容易受到多種因素的結(jié)果容易受到多種因素的影響影響,不同的實驗室這間有時不能重復(fù)；不同的實驗室這間有時不能重復(fù)； （2）對模板）對模板DNA質(zhì)量要求高，操

13、作要求嚴格，質(zhì)量要求高，操作要求嚴格，檢驗成本相對較高；檢驗成本相對較高； （3）由于存在共遷移，分子量相同的片段可能）由于存在共遷移，分子量相同的片段可能不是同源的；另外一條帶中可能含有不同的擴增不是同源的；另外一條帶中可能含有不同的擴增產(chǎn)物；產(chǎn)物； （4）RAPD標記難以區(qū)分開雜合子和純合子基標記難以區(qū)分開雜合子和純合子基因型，不能有效的鑒定出雜合子。因型，不能有效的鑒定出雜合子。M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6不同不同Mg2+和和dN

14、TP濃度對濃度對RAPD帶型的影響帶型的影響 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 M1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 M不同Taq和Primer濃度對RAPD帶型的影響M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25不同循環(huán)量和模板不同循環(huán)量和模板DNA濃度對濃度對RAPD帶型的影響帶型的影響 M 1 2 3 4 5 6 C K 7 8 9 1 0 1 1 1 2M 1 2 3 4 5 6 C K 7 8 9 1 0 1 1 1 2 不同復(fù)性溫度對不

15、同復(fù)性溫度對RAPD帶型的影響帶型的影響u圖圖4 不同復(fù)性溫度對不同復(fù)性溫度對RAPD帶型的影響帶型的影響uFig 4 Effect on RAPD profiles in different annealing temperature M 1 2 3 4 5 6 C K 7 8 9 1 0 1 1 1 2M 1 2 3 4 5 6 C K 7 8 9 1 0 1 1 1 2 不同復(fù)性溫度對不同復(fù)性溫度對RAPD帶型的影響帶型的影響RAPD分析在中藥研究中的應(yīng)用 u道地藥材的評價 例：當歸藥材道地性的例：當歸藥材道地性的RAPD分析分析u野生與栽培種及不同農(nóng)家品種 親緣關(guān)親緣關(guān)系分析系分析 例

16、：人參及山參例：人參及山參RAPD指紋指紋u動物藥的鑒定 例：蛇類藥材分子遺傳標記鑒別的研例：蛇類藥材分子遺傳標記鑒別的研究究 u擴增酶切片段多態(tài)性擴增酶切片段多態(tài)性 (Amplified Restriction FragmentPolymorphism)是一種基是一種基于于PCR的的DNA指紋技術(shù)指紋技術(shù) ，AFLP是近幾是近幾年來繼年來繼RFLP、RAPD之后發(fā)展最快的之后發(fā)展最快的DNA分子標記技術(shù)。被譽為新一代的分子標記技術(shù)。被譽為新一代的分子標記技術(shù)，近年來已得到廣泛的應(yīng)分子標記技術(shù)，近年來已得到廣泛的應(yīng)用。用。 uAFLP的基本原理是對基因組的基本原理是對基因組DNA限制性限制性酶

17、切片段酶切片段進行選擇性擴增。進行選擇性擴增。 先將基因組先將基因組DNA用限制性酶消化，用限制性酶消化，產(chǎn)生粘性末端。然后使用人工合成的雙鏈產(chǎn)生粘性末端。然后使用人工合成的雙鏈接頭（接頭（artificial adapter）,與基因組與基因組DNA的酶切片段相連接形成擴增反應(yīng)的模的酶切片段相連接形成擴增反應(yīng)的模板。接頭和與接頭相鄰的酶切片段的幾個板。接頭和與接頭相鄰的酶切片段的幾個堿基序列作為引物的結(jié)合位點。堿基序列作為引物的結(jié)合位點。AFLP反應(yīng)反應(yīng)的結(jié)果是主要擴增那些由上述兩種酶的結(jié)果是主要擴增那些由上述兩種酶共同共同酶切的片段。酶切的片段。 u模板的制備：即模板的制備：即DNA酶切及

18、人工接頭的酶切及人工接頭的連接（連接（Restriction of the DNA and ligation of oligonucleotide adapters） u限制性片段的選擇性擴增（限制性片段的選擇性擴增（Selective amplification of sets of restriction fragments） u擴增產(chǎn)物凝膠電泳分析（擴增產(chǎn)物凝膠電泳分析（Gel analysis of the amplified fragments） AFLP反應(yīng)流程：反應(yīng)流程：uAFLP反應(yīng)程序主要包括模板反應(yīng)程序主要包括模板DNA制備，酶切片段擴增及凝制備，酶切片段擴增及凝膠電泳分析

19、這膠電泳分析這3個基本步驟。各步驟具體的過程有：個基本步驟。各步驟具體的過程有：u首先要制備高分子量首先要制備高分子量(HMW)基因組基因組DNA，選擇，選擇6個堿基識個堿基識別位點的限制性內(nèi)切酶別位點的限制性內(nèi)切酶(通常是通常是EcoRI或或PstI或或SacI)。 u酶切后的限制性片段在酶切后的限制性片段在T4連接酶的作用下與特定的接頭相連接酶的作用下與特定的接頭相連接，形成帶有接頭的特異性片段。連接，形成帶有接頭的特異性片段。 uDNA片段的預(yù)擴增。片段的預(yù)擴增。 u在在Taq聚合酶的作用下，完成聚合酶的作用下，完成AFLP的選擇性擴增。的選擇性擴增。 uPCR產(chǎn)物變性后在含尿素的聚丙烯

20、酰胺變性膠上電泳。產(chǎn)物變性后在含尿素的聚丙烯酰胺變性膠上電泳。 u多態(tài)性比較分析，特異片段回收克隆分析。多態(tài)性比較分析，特異片段回收克隆分析。為什么用雙酶解為什么用雙酶解?u適合PCR擴增的效率與變性膠的分辨率u減少PCR擴增的片段,從而減少使用選擇性堿基的數(shù)目u使標記單鏈成為可能u增加PCR擴增的靈活性u增加使用引物的靈活性u減少選擇性堿基的錯配u降低背景噪音熒光標記全自動熒光標記全自動AFLPFor ABI 377 DNA Sequencer and AFLP Kitsu擴增效率高，多態(tài)性比例高擴增效率高，多態(tài)性比例高 uAFLP標記穩(wěn)定可靠，不受基因組來源和復(fù)雜標記穩(wěn)定可靠，不受基因組來

21、源和復(fù)雜度的影響，沒有種屬特異性度的影響，沒有種屬特異性 uAFLP技術(shù)較簡便易行，不需要技術(shù)較簡便易行，不需要Southern雜雜交，不需要預(yù)先知道交，不需要預(yù)先知道DNA的順序信息，對模的順序信息，對模板濃度的變化不敏感，允許一定程度的共擴板濃度的變化不敏感，允許一定程度的共擴增，且只需要極少量的增，且只需要極少量的DNA材料材料 uAFLP是一項專利技術(shù)，受專利權(quán)保護，其分是一項專利技術(shù)，受專利權(quán)保護，其分析試劑盒價格偏高析試劑盒價格偏高 Jones et al.（1997）同一實驗在歐洲）同一實驗在歐洲的的8個實驗室重復(fù)，個實驗室重復(fù)，172條帶只有條帶只有1條在條在一次實驗中沒有，重

22、復(fù)率一次實驗中沒有，重復(fù)率99.4%，與，與SSR的水平相當?shù)乃较喈敗＃?。（Jones, C. J. et al. 1997. Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a network of European laboratories. Mol. Breed. 3:381-390)AFLP在分子中藥中的應(yīng)用在分子中藥中的應(yīng)用 uAFLP技術(shù)可產(chǎn)生豐富而穩(wěn)定的遺傳標技術(shù)可產(chǎn)生豐富而穩(wěn)定的遺傳標記，它可以用于藥用植物遺傳分析的各記，它可以用于藥用植物遺傳分析的各個方面，如分類、系統(tǒng)發(fā)育、品種鑒別、個方

23、面，如分類、系統(tǒng)發(fā)育、品種鑒別、遺傳圖譜構(gòu)建及目的基因的定位等遺傳圖譜構(gòu)建及目的基因的定位等 u例：例：AFLP法構(gòu)建人參、西洋參基因組 DNA指紋圖譜 微衛(wèi)星標記分析（微衛(wèi)星標記分析（SSR）u微衛(wèi)星中重復(fù)單位的數(shù)目存在高度變異，這些變異表現(xiàn)為微微衛(wèi)星中重復(fù)單位的數(shù)目存在高度變異，這些變異表現(xiàn)為微衛(wèi)星數(shù)目的整倍性變異或重復(fù)單位序列中的序列有可能不完衛(wèi)星數(shù)目的整倍性變異或重復(fù)單位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多個位點的多態(tài)性。如果能夠?qū)⑦@些變異全相同，因而造成多個位點的多態(tài)性。如果能夠?qū)⑦@些變異揭示出來，就能發(fā)現(xiàn)不同的揭示出來，就能發(fā)現(xiàn)不同的SSR在不同的種甚至不同個體間在不同的種甚至

24、不同個體間的多態(tài)性。的多態(tài)性。uSSR標記又稱為標記又稱為sequence tagged microsatellite site,簡簡寫為寫為STMS，是目前最常用的微衛(wèi)星標記之一。由于基因組，是目前最常用的微衛(wèi)星標記之一。由于基因組中某一特定的微衛(wèi)星的側(cè)翼序列通常都是保守性較強的單一中某一特定的微衛(wèi)星的側(cè)翼序列通常都是保守性較強的單一序列，因而可以將微衛(wèi)星側(cè)翼的序列，因而可以將微衛(wèi)星側(cè)翼的DNA片段克隆、測序，然片段克隆、測序，然后根據(jù)微衛(wèi)星的側(cè)翼序列就可以人工合成引物進行后根據(jù)微衛(wèi)星的側(cè)翼序列就可以人工合成引物進行PCR擴增，擴增，從而將單個微衛(wèi)星位點擴增出來。由于單個微衛(wèi)星位點重復(fù)從而將

25、單個微衛(wèi)星位點擴增出來。由于單個微衛(wèi)星位點重復(fù)單元在數(shù)量上的變異，個體的擴增產(chǎn)物在長度上的變化就產(chǎn)單元在數(shù)量上的變異，個體的擴增產(chǎn)物在長度上的變化就產(chǎn)生長度的多態(tài)性，這一多態(tài)性稱為簡單序列重復(fù)長度多態(tài)性生長度的多態(tài)性，這一多態(tài)性稱為簡單序列重復(fù)長度多態(tài)性(SSLP)，每一擴增位點就代表了這一位點的一對等位基因。，每一擴增位點就代表了這一位點的一對等位基因。由于由于SSR重復(fù)數(shù)目變化很大，所以重復(fù)數(shù)目變化很大，所以SSR標記能揭示比標記能揭示比RFLP高得多的多態(tài)性。高得多的多態(tài)性。 u約約50%50%呈多態(tài)性呈多態(tài)性u共顯性共顯性 u數(shù)目多且在基因組中均勻分布數(shù)目多且在基因組中均勻分布u多數(shù)位

26、點呈選擇中性，符合群體遺傳學(xué)多數(shù)位點呈選擇中性，符合群體遺傳學(xué)了理論了理論u技術(shù)上適合用技術(shù)上適合用PCRPCR分析半自動化，結(jié)果分析半自動化，結(jié)果可靠可靠u部分降解的部分降解的DNADNA樣品也可用樣品也可用u適合于等位酶變異小的居群水平的研究適合于等位酶變異小的居群水平的研究 u可用的位點數(shù)目少可用的位點數(shù)目少 u設(shè)計引物的費用高，耗時長設(shè)計引物的費用高，耗時長u物種專一性物種專一性u在說明群體分化和物種分化時可能產(chǎn)生在說明群體分化和物種分化時可能產(chǎn)生錯誤錯誤SSR標記的應(yīng)用領(lǐng)域標記的應(yīng)用領(lǐng)域u遺傳圖譜的構(gòu)建遺傳圖譜的構(gòu)建u連鎖分析特殊的基因（如感病基因）連鎖分析特殊的基因（如感病基因）u

27、姻親分析樣品鑒定（如父本分析、血緣分析、等號姻親分析樣品鑒定（如父本分析、血緣分析、等號樣品分析、雜種分析）樣品分析、雜種分析）u物種和居群的遺傳多樣性物種和居群的遺傳多樣性u群體遺傳學(xué)分析（如有效群體大小、群體遺傳結(jié)構(gòu)、群體遺傳學(xué)分析（如有效群體大小、群體遺傳結(jié)構(gòu)、群體分化、遷移與基因流動）群體分化、遷移與基因流動）u傳粉生物學(xué)與散布生物學(xué)（如花粉和種子的散布、傳粉生物學(xué)與散布生物學(xué)（如花粉和種子的散布、交配系統(tǒng)）交配系統(tǒng)）u保護生物學(xué)保護生物學(xué)CriterionAFLPRAPDSSRRFLPAllozymesQuantity ofinformationHighHighHighLowLowR

28、eplicabilityHighVariableHighHighHighResolution of geneticdifferencesHighModerate HighHighModerateEase of use anddevelopmentModerate EasyDifficultDifficultEasyDevelopment timeShortShortLongLongShortu微衛(wèi)星引物微衛(wèi)星引物PCR(MP-PCR) 也叫單引物擴增也叫單引物擴增RCP(single amplification PCR,簡寫為簡寫為SPAR)u該方法是利用單個微衛(wèi)星的人工合成寡核苷酸片段該方法

29、是利用單個微衛(wèi)星的人工合成寡核苷酸片段為引物進行為引物進行PCR擴增。可以想象，如果兩個反向排擴增?？梢韵胂?，如果兩個反向排列的微衛(wèi)星出現(xiàn)于同一可擴增的范圍內(nèi)，這兩個反列的微衛(wèi)星出現(xiàn)于同一可擴增的范圍內(nèi)，這兩個反向排列的微衛(wèi)星間的序列就可擴增出來，因而該方向排列的微衛(wèi)星間的序列就可擴增出來，因而該方法稱為微衛(wèi)星引物法稱為微衛(wèi)星引物PCR。u用此方法擴增出來的是兩個反向排列的微衛(wèi)星之間用此方法擴增出來的是兩個反向排列的微衛(wèi)星之間的序列，并非微衛(wèi)星位點本身。實踐證明，用該方的序列，并非微衛(wèi)星位點本身。實踐證明，用該方法對三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星法對三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸重復(fù)的

30、微衛(wèi)星位點的擴增效果較好，而對二核苷酸位點重復(fù)的擴位點的擴增效果較好，而對二核苷酸位點重復(fù)的擴增效果較差增效果較差。uISSR(Intersimple sequence repeat) 這是這是Zietkiewitcz等等(1994)發(fā)展起來的又一種微衛(wèi)星基礎(chǔ)上的分子標記。發(fā)展起來的又一種微衛(wèi)星基礎(chǔ)上的分子標記。1.與與SSR標記相反，該法是直接利用同位素標記的標記相反，該法是直接利用同位素標記的SSR序列為引物，用序列為引物，用PCR的方法擴增兩個的方法擴增兩個SSR之間的單拷貝序列。之間的單拷貝序列。2.為增加特異性，設(shè)計引物時在引物的為增加特異性，設(shè)計引物時在引物的5端和端和3端分別引入

31、端分別引入12個選擇個選擇性堿基，引物長度性堿基，引物長度1618bp，擴增產(chǎn)物通過放射自顯影顯現(xiàn)，這樣，擴增產(chǎn)物通過放射自顯影顯現(xiàn)，這樣其擴增物就是其擴增物就是MP-PCR擴增產(chǎn)物中的一部分，提高了實驗結(jié)果的可重擴增產(chǎn)物中的一部分，提高了實驗結(jié)果的可重復(fù)性。復(fù)性。3.ISSR引物的開發(fā)不象引物的開發(fā)不象SSR引物一樣需測序獲得引物一樣需測序獲得SSR兩測的單拷貝序兩測的單拷貝序列，開發(fā)費用降低。與列，開發(fā)費用降低。與SSR標記相比，標記相比，ISSR引物可以在不同的物種引物可以在不同的物種間通用，不象間通用，不象SSR標記一樣具有較強的種特異性；與標記一樣具有較強的種特異性；與RAPD和和R

32、FLP相相比，比，ISSR揭示的多態(tài)性較高，可獲得幾倍于揭示的多態(tài)性較高，可獲得幾倍于RAPD的信息量，精確度的信息量，精確度幾乎可與幾乎可與RFLP相媲美，檢測非常方便，因而是一種非常有發(fā)展前途相媲美，檢測非常方便，因而是一種非常有發(fā)展前途的分子標記，已用于遺傳作圖、品種鑒定等研究。的分子標記，已用于遺傳作圖、品種鑒定等研究。 uDNA測序原理 及方法及方法u優(yōu)點及不足 優(yōu)點：優(yōu)點：DNA測序技術(shù)重現(xiàn)性好、結(jié)果準確測序技術(shù)重現(xiàn)性好、結(jié)果準確清楚，而且可以利用已測物種的清楚，而且可以利用已測物種的DNA序列序列建立建立“對照序列對照序列”文庫文庫 ，避免設(shè)立對照品。，避免設(shè)立對照品。新測定的新測定的DNA序列也可加入此對照文庫中，序列也可加入此對照文庫中，供他人參考；供他人參考； 不足：不足：操作相對復(fù)雜，成本高，不易普及操作相對復(fù)雜，成本高，不易普及