T-SPOT.TB實(shí)驗(yàn)技術(shù)2015

1、上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司2015.7 結(jié)核感染基本知識(shí) T-SPOT.TB 技術(shù)原理 T-SPOT.TB 實(shí)驗(yàn)條件 T-SPOT.TB 標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)操作 T-SPOT.TB 結(jié)果分析討論 T-SPOT.TB 非血標(biāo)本采集要求及操作 T-SPOT.TB 實(shí)驗(yàn)常見問(wèn)題解答目錄3結(jié)核病 結(jié)核病是由結(jié)核桿菌感染引起的慢性傳染病。結(jié)核菌能侵入全身各個(gè)器官，但80%發(fā)生在肺部，常稱肺結(jié)核。常見肺外結(jié)核： 淋巴結(jié)核（最常見）、結(jié)核性腦膜炎（最嚴(yán)重）、結(jié)核性腹膜炎、腸結(jié)核、腎結(jié)核、附睪結(jié)核、女性生殖結(jié)核（引起不孕不育）、骨關(guān)節(jié)結(jié)核等。4結(jié)核病分枝桿菌細(xì)菌學(xué)分類1. 結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTC）2. 非結(jié)核分

2、枝桿菌（NTM）3. 麻風(fēng)分枝桿菌（M.leprae）掃描電子顯微鏡下的結(jié)核桿菌掃描電子顯微鏡下的結(jié)核桿菌結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTC）對(duì)人類致病5結(jié)核病與結(jié)核感染結(jié)核病與結(jié)核感染接觸活動(dòng)性結(jié)核病患者接觸活動(dòng)性結(jié)核病患者暴露程度不足，結(jié)核桿菌被機(jī)體免疫力清除暴露程度不足，結(jié)核桿菌被機(jī)體免疫力清除- 沒有癥狀沒有癥狀, ,結(jié)核桿菌仍舊結(jié)核桿菌仍舊存在而不能被偵測(cè)存在而不能被偵測(cè) - X- X-光光/ CT / CT 掃描顯示正常掃描顯示正常- 沒有抗體應(yīng)答沒有抗體應(yīng)答- 診斷困難診斷困難- 傳統(tǒng)的結(jié)核感染檢測(cè)只有傳統(tǒng)的結(jié)核感染檢測(cè)只有 TSTTST（PPDPPD）機(jī)體被感染機(jī)體被感染受機(jī)體免疫力抑

3、制受機(jī)體免疫力抑制沒有臨床癥狀沒有臨床癥狀終身處于感染狀態(tài)終身處于感染狀態(tài)潛伏感染潛伏感染有臨床癥狀有臨床癥狀具有傳染性具有傳染性- 結(jié)核桿菌可以通過(guò)涂片、結(jié)核桿菌可以通過(guò)涂片、培養(yǎng)檢測(cè)出培養(yǎng)檢測(cè)出- 胸部的胸部的 X- X-光或光或 CT CT 掃掃描顯示異常描顯示異常 - 肺外結(jié)核難以診斷肺外結(jié)核難以診斷 ( (特別是兒童特別是兒童)活動(dòng)性結(jié)核活動(dòng)性結(jié)核5%5%再次激活再次激活6結(jié)核病與結(jié)核感染 結(jié)核病當(dāng)結(jié)核分枝桿菌增加，并超過(guò)機(jī)體免疫系統(tǒng)所能控制，就會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的臨床癥狀。 潛伏性結(jié)核感染（LTBI）人體攜帶結(jié)核分枝桿菌，并能被機(jī)體免疫系統(tǒng)控制，這時(shí)只存在少量細(xì)菌，并且無(wú)臨床癥狀。7結(jié)核病

4、與結(jié)核感染 結(jié)核病有診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”細(xì)菌學(xué)檢測(cè)：抗酸桿菌染色、分枝桿菌培養(yǎng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)：抗酸桿菌染色、分枝桿菌培養(yǎng)病理診斷：有病灶破裂風(fēng)險(xiǎn) 結(jié)核感染診斷無(wú)“金標(biāo)準(zhǔn)”TST（PPD）結(jié)核抗體實(shí)驗(yàn)8細(xì)菌學(xué)診斷優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1.直接查到菌，金標(biāo)準(zhǔn)缺點(diǎn)：敏感性低，檢出率不足30%，大多數(shù)漏檢特異性較低，非結(jié)核分枝桿菌也可呈陽(yáng)性結(jié)果，需進(jìn)一步鑒定是否為結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)時(shí)間耗時(shí)長(zhǎng)，需2-8周，不能進(jìn)行早期診斷和治療只能診斷結(jié)核病，無(wú)法檢測(cè)結(jié)核感染只能診斷結(jié)核病，無(wú)法檢測(cè)結(jié)核感染結(jié)核抗體檢測(cè)結(jié)核抗體檢測(cè)PPDPPD結(jié)核菌素皮試結(jié)核菌素皮試假陽(yáng)性與假陰性比例高2011年7月20日，世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)出正式聲

5、明，要求禁止將血清學(xué)檢測(cè)方法（抗原，抗體，蛋白芯片等）用于肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷。1.操作簡(jiǎn)單，價(jià)廉 2.特異性低：區(qū)分不出卡介苗接種和環(huán)境分枝桿菌感染，假陽(yáng)性高3.敏感性低：收到免疫低下/功能不全/受抑制影響，假陰性高。9結(jié)核潛伏感染檢測(cè)-干擾素釋放試驗(yàn) （IGRAs，interferon- gamma release assays ）酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù) （ELISPOT，Enzyme-Linked ImmunoSpot assay）結(jié)核桿菌特異抗原 早期抗原靶6（ESAT-6，early secreted antigenic target 6 ） 培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP 10，cultur

6、e filtrate protein 10 ）技術(shù)背景-干擾素釋放試驗(yàn)原理（IGRAs)TB抗原多肽T細(xì)胞活化T細(xì)胞-干擾素-干擾素檢測(cè)陽(yáng)性-干擾素檢測(cè)陰性可以作為機(jī)體是否正處于被感染的指標(biāo)，無(wú)論是否有臨床癥狀。T-SPOT .TB 實(shí)驗(yàn)方法學(xué)為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）ELISPOT方法結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（即ELISA 技術(shù)），是公認(rèn)的最靈敏的抗原特異性T細(xì)胞的體外檢測(cè)技術(shù)。其技術(shù)原理可用一句話概括為：用抗體捕獲培養(yǎng)中細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色方式將其表現(xiàn)出來(lái)。由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白；所有的卡介苗（BCG）均丟失該基因序列；絕大多

7、數(shù)的環(huán)境分枝桿菌也不存在RD1區(qū)。結(jié)核桿菌特異抗原ESAT-6與CFP 10抗原T-SPOT.TB 是利用結(jié)核特異抗原（ESAT-6/CFP 10），通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）檢測(cè)受試者體內(nèi)是否存在結(jié)核效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，從而判斷目前該受試者是否感染結(jié)核桿菌（現(xiàn)癥感染）的新方法。T-SPOT.TB 實(shí)驗(yàn)原理 T-SPOT.TB 技術(shù)原理 T-SPOT.TB 實(shí)驗(yàn)條件 T-SPOT.TB 標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)操作 T-SPOT.TB 結(jié)果分析討論 T-SPOT.TB 非血標(biāo)本采集要求及操作 T-Cell Xtend T-SPOT.TB 實(shí)驗(yàn)常見問(wèn)題解答目錄T-SPOT.TB 試劑盒T-SPOT.T

8、B 試劑盒組成及成分種類名稱數(shù)量規(guī)格成分說(shuō)明微孔培養(yǎng)板 1塊 96孔由128孔的板條組成，包被有小鼠抗人的干擾素單抗 結(jié)核桿菌特異混合多肽A 2瓶0.8ml/瓶 主要成分為ESAT-6抗原，牛血清白蛋白和抑菌劑 結(jié)核桿菌特異混合多肽B 2瓶0.8ml/瓶 主要成分為CFP 10抗原，牛血清白蛋白和抑菌劑 陽(yáng)性質(zhì)控 2瓶0.8ml/瓶 主要成分為植物血凝素PHA，牛血清白蛋白和抑菌劑 濃縮標(biāo)記抗體 1管50ul/管 含有堿性磷酸酶標(biāo)記的小鼠的抗人-干擾素單抗 顯色底物溶液 1瓶25ml/瓶 含5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）和氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT） CD光盤 1張含使用說(shuō)明書，技術(shù)手

9、冊(cè)，MSDS文件，操作指南等T-SPOT.TB 輔助試劑及耗材種類名稱規(guī)格與試劑盒配比量（2盒試劑所配輔助試劑的量）淋巴細(xì)胞分離液200ml/瓶1瓶（天津?yàn)蠡蛱旖蛎赖绿窖螅?640培養(yǎng)液500ml/瓶2瓶（天津美德太平洋或天津?yàn)螅〢IM-V培養(yǎng)液100ml/瓶待定（天津美德太平洋）10或1的PBS400ml/瓶與試劑盒配套的輔助試劑（公司會(huì)選擇性的與試劑盒配套贈(zèng)送）T-SPOT.TB 輔助試劑及耗材其他耗材（實(shí)驗(yàn)室自行采購(gòu)）種類名稱用量備注說(shuō)明15ml可高壓的尖底離心管 34根/人份使用之前必須高壓滅菌1.5ml尖底離心管（子彈頭）12個(gè)/人份一次性白黃藍(lán)槍頭若干一次性獨(dú)立包裝的無(wú)菌吸管

10、23根/人份計(jì)數(shù)板若干若用顯微鏡則需要T-SPOT.TB 所用儀器設(shè)備1.II級(jí)生物安全柜：T-SPOT不做特殊要求；2.離心機(jī)：水平轉(zhuǎn)子、溫控18-25、能離15ml尖底離心管、可以實(shí)現(xiàn)緩慢降速（Thermo ST-16R、 Eppendorf 5810R、力康1600R、飛鴿TDL-5000CR）；3. 培養(yǎng)箱：37、5%CO2、有保濕裝置（Thermo3111系列、SANYO、力康HF-151、三騰DH-160I）；4.細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)備：全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或普通顯微鏡加血細(xì)胞計(jì)數(shù)板；5.10l、100或200 l、1000 l量程的移液器；6.ELISPOT讀板儀： AID德國(guó)、CTL美國(guó)。

11、1.采集外周全血，無(wú)需空腹，需用肝素/肝素鋰/肝素鈉抗凝劑，不得使用EDTA抗凝；2.采血要求：2歲以下兒童23ml，其他患者46ml；免疫力低下/受抑制患者（HIV/血液病/使用生物抑制劑或免疫抑制劑/老人）68ml；3.樣本室溫（15-25）保存與運(yùn)輸，不得冷凍或冷藏；4.標(biāo)本采集后4h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室，以便盡快完成檢測(cè)；5.一周內(nèi)有輸血史或做過(guò)PET-CT的患者會(huì)影響血液中淋巴細(xì)胞的分離，建議2周后進(jìn)行檢；6.運(yùn)輸過(guò)程中防止顛簸，避免樣本溶血影響結(jié)果。T-SPOT.TB 標(biāo)本要求 T-SPOT.TB 技術(shù)原理 T-SPOT.TB 試實(shí)驗(yàn)條件 T-SPOT.TB 標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)操作 T-SPOT.

12、TB 結(jié)果分析討論 T-SPOT.TB 非血標(biāo)本采集要求及操作 T-Cell Xtend T-SPOT.TB 實(shí)驗(yàn)常見問(wèn)題解答目錄實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備1.在正式實(shí)驗(yàn)操作1-2h前，將試劑盒、AIM-V培養(yǎng)液、RPMI 1640培養(yǎng)液、Ficoll淋巴細(xì)胞分離液從4冰箱拿出，平衡至室溫（18-25）。2.為避免污染，RPMI 1640培養(yǎng)液及AIM-V培養(yǎng)液一定要用無(wú)菌小瓶分裝（建議使用高壓滅菌的50ml離心管或一次性無(wú)菌痰盒來(lái)分裝RPMI 1640，因AIM-V每次用量較少，可以用每次壓好的15ml離心管分裝）。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備3. 務(wù)必嚴(yán)格檢查淋巴細(xì)胞分離液及RPMI 1640、AIM-V培養(yǎng)液是否污染。通

13、常正常的試劑清 澈透明，如遇液體渾濁、明顯的變黃、發(fā)現(xiàn)霉菌團(tuán)或絮狀物等異常，則表示可能已污染，嚴(yán)禁使用；如果RPMI 1640和AIM-V由鮮亮的橘紅色漸變?yōu)榉凵?，屬正?，F(xiàn)象，輕微的發(fā)粉可以使用，淋巴細(xì)胞分離液幾乎不容易長(zhǎng)菌，但也要注意霉菌的污染。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備4. 確認(rèn)設(shè)備是否正常：可以實(shí)現(xiàn)緩慢降速的水平溫控離心機(jī)（與15ml尖底離心管相匹配，注意靠近轉(zhuǎn)軸的位置是否會(huì)卡住離心管）；II級(jí)生物安全柜且使用前仔細(xì)擦拭并紫外滅菌30min；37、5CO 培養(yǎng)箱，確保CO 正常且培養(yǎng)箱內(nèi)有水盤；顯微鏡或者血細(xì)胞分析儀正常。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備5. 準(zhǔn)備好試劑和耗材：15ml尖底無(wú)菌離心管；1.5ml微量離心管（滅

14、菌）；加樣滅菌槍頭（10l、100l、1ml）；一次性獨(dú)立包裝的無(wú)菌吸管等。所有耗材現(xiàn)用現(xiàn)壓，不得使用高壓后放置過(guò)久的耗材。第一天第二天 采集外周肝素抗凝全血，密度梯度離心分離PBMCs，洗滌后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。PBMCs和結(jié)核特異性抗原同時(shí)加入到包被抗-干擾素抗體的反應(yīng)孔中，孵育過(guò)夜 （37C ，5%CO2）。洗滌反應(yīng)孔，加入標(biāo)記二抗孵育1h。洗滌反應(yīng)孔，顯色，計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)，一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)效應(yīng)T細(xì)胞。檢測(cè)過(guò)程分步操作第一步 細(xì)胞分離Ficoll Paque 法 將抗凝全血按1:1等比例與1640混勻，按23:1的比例小心將稀釋血樣輕緩加到Ficoll淋巴細(xì)胞分離液上；注意：不能將血樣與分離液混合

15、。 18，1000g，離心22min；注意：減速度要求調(diào)到最低檔升速也不要太快。淋巴細(xì)胞分離管法 將3ml淋巴細(xì)胞分離液加入分離管中，350g離心1min，使淋巴液低于多孔膜； 將樣本按5:3的比例與1640稀釋混勻。將稀釋血樣加入淋巴細(xì)胞分離管中，18，10min，離心1000g；注意：減速度要求調(diào)到最低檔升速也不要太快。分步操作第一步 細(xì)胞分離離心后實(shí)際效果圖血漿PBMCs層紅細(xì)胞淋巴細(xì)胞分離液分步操作第一步 細(xì)胞分離分步操作第二步 細(xì)胞洗滌 離心結(jié)束后，將分離出來(lái)的單個(gè)核細(xì)胞層（PBMCs）取出至新的15ml尖底離心管中；注意：不要吸到底層的紅細(xì)胞。分步操作第二步 細(xì)胞洗滌 加入1640

16、至10ml，18 ，600g，離心7min，進(jìn)行第一次洗滌； 離心后棄去上清，加入1ml1640將細(xì)胞輕緩重新懸浮后，再加1640至10ml，18 ，350g，離心7min，進(jìn)行第二遍洗滌； 離心后小心棄去上清液，加入500l的AIM-V（根據(jù)細(xì)胞數(shù)量，可以適當(dāng)調(diào)節(jié)加入AIM-V量），輕緩重懸細(xì)胞；注意： 盡量棄去上清液，可以準(zhǔn)備無(wú)菌濾紙，倒掉液體后，將管口輕叩一下；此步驟嚴(yán)禁使1640。分步操作第二步 細(xì)胞洗滌顯微鏡計(jì)數(shù) 取10l細(xì)胞懸液加40l 0.4的臺(tái)酚藍(lán)染液，制備1:5的細(xì)胞稀釋液，充分混勻取10l加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板并進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)；死細(xì)胞（藍(lán)色）活細(xì)胞（透明立體）細(xì)胞凝塊分步操作第三步

17、 細(xì)胞計(jì)數(shù)手工使用血細(xì)胞技術(shù)板或快讀一次性計(jì)數(shù)片，計(jì)數(shù)44大格的細(xì)胞數(shù)目每ml細(xì)胞數(shù)量細(xì)胞計(jì)數(shù)稀釋倍數(shù)104；分步操作第三步 細(xì)胞計(jì)數(shù)分步操作第三步 細(xì)胞計(jì)數(shù)全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 選用上樣量100l的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，用1.5ml的Ep管取5080l細(xì)胞液，用全血模式計(jì)數(shù)細(xì)胞，直接得到細(xì)胞濃度；分步操作第四步 細(xì)胞懸液的配制 計(jì)數(shù)完成后，以WBC 2.5106/ml為標(biāo)準(zhǔn)濃度（顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)目為44細(xì)胞數(shù)達(dá)到50個(gè)，其濃度就是2.5106/ml ），若2.5則需要按照所給Excel表格（光盤里有）配制成500l標(biāo)準(zhǔn)濃度細(xì)胞液；若2.5且2.0則不用另外做稀釋處理；若2.0則建議增加血量來(lái)保證細(xì)

18、胞達(dá)標(biāo)；注意：配制細(xì)胞液是一定要使用AIM-V，不得使用1640；若淋巴細(xì)胞百分比70%或淋巴細(xì)胞沒有分出來(lái)，統(tǒng)一以WBC的數(shù)值為標(biāo)準(zhǔn)，若淋巴細(xì)胞百分比70%可以以淋巴細(xì)胞數(shù)值為標(biāo)準(zhǔn)參考。分步操作第五步 加板孵育過(guò)夜 培養(yǎng)板加試劑將培養(yǎng)板從鋁封袋中取出，并平衡到室溫（18-25），標(biāo)記樣本順序，在每個(gè)樣本的板條上按順序加入50l AIM-V，50l抗原A，50l抗原B和50l陽(yáng)性對(duì)照（PHA）。注意：避免槍頭接觸到膜，以免損害膜；遇單數(shù)樣本，需把另外四個(gè)孔用醫(yī)用膠帶或封口膜封住，禁止掰斷板條。分步操作第五步 加板孵育過(guò)夜 培養(yǎng)板加樣本的標(biāo)準(zhǔn)溶液在上述四孔內(nèi)分別加入100l細(xì)胞懸液（含有25萬(wàn)個(gè)

19、細(xì)胞）371 ，5CO2，孵育1620h；注意：在吸取細(xì)胞懸浮液時(shí)，輕輕混勻細(xì)胞液，確保細(xì)胞均勻地分布；加液后輕輕敲擊培養(yǎng)板，使液體均勻分布底部；要求培養(yǎng)箱保持濕度；勿堆疊放置培養(yǎng)板于培養(yǎng)箱里，以免溫度和通風(fēng)不均勻。分步操作第六步 洗板與顯色 配制無(wú)菌 1PBS同時(shí)根據(jù)標(biāo)本數(shù)目配制新鮮的酶標(biāo)二抗工作液；二抗配制方法：取出二抗，室溫平衡，用無(wú)菌 1 PBS按1:200配置新鮮酶標(biāo)抗體工作液 （即用即配），1個(gè)樣本需要1l二抗，考慮到耗損，酌情多配；注意：配置二抗前，需要用力甩3-5次，避免二抗粘連在瓶蓋和管壁上；遵循少量往多量中加是原則；無(wú)菌1PBS不能含有表面活性劑，并用無(wú)菌去離子水或蒸餾水配

20、制。分步操作第六步 洗板與顯色 洗板取出培養(yǎng)板，棄去孔內(nèi)液體，拍干后以200l新鮮配制的無(wú)菌PBS洗滌4遍；注意：每次洗板后拍干；無(wú)菌1PBS不能含有表面活性劑。 二抗孵育每孔加50l新鮮的酶標(biāo)抗體工作液，將酶標(biāo)板在2-8孵育1h； 洗板顯色無(wú)菌PBS洗滌4遍除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體每孔加50l底物工作液,室溫避光7min；注意：顯色液提前從冰箱取出，恢復(fù)到室溫。分步操作第七步 斑點(diǎn)計(jì)數(shù) 蒸餾水終止反應(yīng)，培養(yǎng)37烘箱干燥4小時(shí)或室溫過(guò)夜干燥，干燥后使用顯微鏡、放大鏡或自動(dòng)計(jì)數(shù)儀進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。注意：嚴(yán)禁在板條未干燥之前報(bào)結(jié)果，以免造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的錯(cuò)誤判斷。 T-SPOT.TB 技術(shù)原理 T-SPOT.

21、TB 實(shí)驗(yàn)條件 T-SPOT.TB 標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)操作 T-SPOT.TB 結(jié)果分析討論 T-SPOT.TB 非血標(biāo)本采集要求及操作 T-Cell Xtend T-SPOT.TB 實(shí)驗(yàn)常見問(wèn)題解答目錄 T-SPOT.TB 實(shí)驗(yàn)設(shè)有陰性對(duì)照、以植物血凝素（PHA）作為刺激源的陽(yáng) 性對(duì)照以及以ESAT-6和CFP 10作為刺激源的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)孔； 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用每25萬(wàn)個(gè)外周血單核細(xì)胞中斑點(diǎn)形成細(xì)胞（spot-forming cell，SFC）的數(shù)目來(lái)判斷陰陽(yáng)性結(jié)果： 當(dāng)陰性孔斑點(diǎn)數(shù)小于6時(shí)，任意一實(shí)驗(yàn)孔的斑點(diǎn)數(shù)減去陰性對(duì)照孔斑點(diǎn) 數(shù)大于等于6，結(jié)果判為陽(yáng)性； 當(dāng)陰性孔斑點(diǎn)數(shù)為大于6個(gè)小于10個(gè)時(shí)，任意一實(shí)驗(yàn)

22、孔的斑點(diǎn)數(shù)大于陰 性孔斑點(diǎn)數(shù)的兩倍，結(jié)果判為陽(yáng)性。結(jié)果判讀空白對(duì)照孔沒有或有很少的斑點(diǎn)而陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)超 過(guò)20個(gè)結(jié)果有效。不確定結(jié)果：空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)超過(guò)10個(gè)或當(dāng)陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)少于20個(gè)時(shí)為“不確定”，需要復(fù)查，除非抗原A或抗原B孔根據(jù)結(jié)果解釋和判斷標(biāo)準(zhǔn)確定為“有反應(yīng)性”，此檢測(cè)結(jié)果有效。 陰性孔出斑點(diǎn)：1.培養(yǎng)液、試管等耗材污染 2.實(shí)驗(yàn)操作原因 3.病人自身原因，包括藥物（升白細(xì)胞，血小板）或者菌 血癥影響，病人的白細(xì)胞處于亢奮狀態(tài)（內(nèi)源性干擾素 ）通過(guò)分離洗滌步驟，不能完全去除內(nèi)源性干擾素 陽(yáng)性斑點(diǎn)生長(zhǎng)不好，斑點(diǎn)小或斑點(diǎn)數(shù)量少甚至沒有斑點(diǎn)生長(zhǎng)點(diǎn)不多： 1.CO2培養(yǎng)箱溫度

23、、濃度或濕度不正確 2.孵育時(shí)間不足 3.未按要求加入足夠數(shù)量的細(xì)胞 4.二抗或者底物，陽(yáng)性對(duì)照等沒有按實(shí)驗(yàn)要求加樣 5.標(biāo)本對(duì)陽(yáng)性對(duì)照（PHA）不敏感 6.近期使用抑制劑患者或PET-CT患者可能細(xì)胞不達(dá)標(biāo)可能導(dǎo)致陽(yáng)性孔斑點(diǎn)較少。結(jié)果解釋 陰性結(jié)果提示患者體內(nèi)不存在針對(duì)結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細(xì)胞。假陰性結(jié)果：感染階段不同（如樣本是在細(xì)胞免疫發(fā)生前獲取的）；少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不全/基礎(chǔ)疾病，如HIV患者、腫瘤患者、兒童等；樣本不正常保存與運(yùn)輸，實(shí)驗(yàn)非正常操作。 陽(yáng)性結(jié)果提示患者體內(nèi)存在針對(duì)結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細(xì)胞，患者存在結(jié)核感染，但是否是活動(dòng)性結(jié)核病，需結(jié)合臨床癥狀和其它檢測(cè)指標(biāo)綜合判斷。T-S

24、POT.TB 不能作為單獨(dú)的或決定性的診斷結(jié)核病的依據(jù)。假陽(yáng) 性結(jié)果：4種環(huán)境分枝桿菌感染時(shí)：M.kansasii（堪薩斯）、M.szulgai（蘇氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）。結(jié)果解釋陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果空白對(duì)照抗原 AESAT-6抗原 BCFP10陽(yáng)性對(duì)照（PHA）實(shí)際效果圖斑點(diǎn)識(shí)別斑點(diǎn)的識(shí)別斑點(diǎn)的識(shí)別 (a) (b) (c)陰性孔的鑒別 (a) (b) (c) （d）陽(yáng)性孔的鑒別 （e） （f） （g） （h） （a） （b） （c） （d） 典型異常結(jié)果 N A B P N A B P典型異常結(jié)果長(zhǎng)菌典型異常結(jié)果污染典型異常結(jié)果污染 N A B P典型異常結(jié)

25、果本底不干凈患者血本身有一些干擾成分去除不掉，淋巴細(xì)胞層可見塊狀蛋白類物質(zhì)。細(xì)胞洗滌不干凈。顯色時(shí)間長(zhǎng)分離后發(fā)現(xiàn)血漿層連同淋巴細(xì)胞層有紅細(xì)胞殘留或者僅僅在淋巴細(xì)胞層或血漿層有紅細(xì)胞殘留。 N P A B N P A B兩日后重復(fù)結(jié)果典型異常結(jié)果非特異性雜質(zhì) 同一個(gè)標(biāo)本兩次的結(jié)果陰性孔和AB孔讀數(shù)儀讀出的數(shù)值都是0，陽(yáng)性孔讀出的點(diǎn)數(shù)也不多，幾十個(gè)，細(xì)胞數(shù)都?jí)颍R床那反饋是沒有相應(yīng)的結(jié)核感染臨床表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)的目的就是一個(gè)篩查，結(jié)果都報(bào)的陰性。 P A B N洗板后典型異常結(jié)果紅細(xì)胞殘留太多典型異常結(jié)果個(gè)別結(jié)果反應(yīng)異常 洗滌不干凈 培養(yǎng)箱CO2濃度、溫度、濕度影響細(xì)胞生長(zhǎng)，死亡的細(xì)胞會(huì)形成一些干擾物附

26、著在板孔上導(dǎo)致本底不干凈。 T-SPOT.TB 技術(shù)原理 T-SPOT.TB 實(shí)驗(yàn)條件 T-SPOT.TB 標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)操作 T-SPOT.TB 結(jié)果分析討論 T-SPOT.TB 非血標(biāo)本采集要求及操作 T-SPOT.TB 實(shí)驗(yàn)常見問(wèn)題解答目錄62結(jié)核感染時(shí)，有活性的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞主要集中在炎癥反應(yīng)的部位以對(duì)抗感染，如胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液、腹水、腦脊液、腸道灌洗液，血液中的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞只占所有效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的20%-30%，因此，檢測(cè)炎癥部位體液的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞有利于區(qū)別結(jié)核感染和其他原因?qū)е碌难装Y反應(yīng)，對(duì)確診結(jié)核病具有重要的臨床意義。 非血樣本的檢測(cè)輔助判斷活動(dòng)性結(jié)核對(duì)臨床判斷活動(dòng)性結(jié)

27、核或其它病癥有非常大的幫助，是T-SPOT檢測(cè)的獨(dú)占優(yōu)勢(shì)。非血標(biāo)本的檢測(cè)意義63 胸水 腹水 心包積液 關(guān)節(jié)液 腦脊液 支氣管肺泡灌洗液（BAL）？非血標(biāo)本的種類64胸水、腹水、心包積液：無(wú)菌密閉容器留取50ml以上，每100毫升加2500IU肝素（0.4ml）抗凝并立即混勻；關(guān)節(jié)液：無(wú)菌小瓶留取4ml以上，每毫升加125IU肝素（0.02ml）抗凝并立即混勻； 腦脊液：無(wú)菌小瓶留取4ml以上，每毫升加125IU肝素（0.02ml）抗凝并立即混勻 。采集量及抗凝劑的添加量注：抗凝劑肝素可以是“肝素鈉注射液”2ml：1.25萬(wàn)單位非血標(biāo)本的采集65采集容器選擇 胸水、腹水、心包積液等因所需的體積

28、比較大，推薦用鹽水瓶（氯化鈉注射液）留取，具體方法：新打開一瓶鹽水，倒掉里面的液體并將抽取的胸水、腹水或心包積液等打到里面，按上述比例添加抗凝劑并立即混勻。 注意：可以選擇直接將標(biāo)本打到肝素采血管內(nèi)，但不能用飲料瓶、塑料酒精瓶等留取標(biāo)本。 腦脊液和關(guān)節(jié)液因所能得到的體積比較小，可以用無(wú)菌帶蓋采集管留取。非血標(biāo)本的采集66 容器推薦非血標(biāo)本的采集67該混懸液示為血液輕輕加到4ml Ficoll液面上斑點(diǎn)計(jì)數(shù)取2030ml標(biāo)本于2個(gè)15ml離心管內(nèi)倒掉上清掉，再加入1640至10ml重懸沉淀倒掉上清掉，在2支管子中共加入1640 8ml左右混勻并合并于一管中600g，7min600g，7min吸出

29、細(xì)胞，加1640至10ml洗滌倒掉上清，加1640至10ml洗滌1000g，22min600g，7min倒掉上清，加500 l AIM-V重懸350g，7min臺(tái)盼藍(lán)5倍稀釋用顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞洗板加酶標(biāo)二抗洗板顯色2.5 106/ml加板37 ，5%CO2，1620h28 ，1h室溫，7min注意：最開始洗滌時(shí)如果發(fā)現(xiàn)離心后的沉淀很少，應(yīng)增大標(biāo)本量，再取2030ml，將沉淀合在一起；非血標(biāo)本中會(huì)出現(xiàn)一些類似于大細(xì)胞的雜細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)注意不要數(shù)上，但如果雜細(xì)胞太多要考慮適當(dāng)?shù)募哟笙♂?。檢測(cè)步驟胸水、腹水、心包積液和關(guān)節(jié)液68將腦脊液轉(zhuǎn)入15ml無(wú)菌離心管中/如果是離心管直接采集的可直接離心即可倒

30、掉上清，加入510ml AIM-V混勻倒掉上清，加加500 l AIM-V重懸700g，7min臺(tái)盼藍(lán)5倍稀釋用顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞洗板加酶標(biāo)二抗洗板顯色2.5 106/ml加板37 ，5%CO2，1620h28 ，1h室溫，7min注意：腦脊液細(xì)胞往往不多，謹(jǐn)慎加樣。600g，7min斑點(diǎn)計(jì)數(shù)檢測(cè)步驟腦脊液69 添加的肝素量不一定非常準(zhǔn)確，但一定要加； 凝塊會(huì)嚴(yán)重影響淋巴細(xì)胞的數(shù)量，如果發(fā)現(xiàn)有凝塊不建議繼續(xù)操作； 樣本采集后4小時(shí)內(nèi)必須送至實(shí)驗(yàn)室，常溫保存（15-25），不可冷凍或冷藏； 腦脊液的細(xì)胞往往比較少，為提高實(shí)驗(yàn)效率或成功率，操作之前可以先查一下“常規(guī)”數(shù)據(jù)中有無(wú)淋巴細(xì)胞； 非血標(biāo)本T-

31、SPOT檢測(cè)時(shí)，需同時(shí)送檢病人血樣； 非血標(biāo)本單個(gè)核細(xì)胞的計(jì)數(shù)采用顯微鏡下計(jì)數(shù)； 不可使用配有海綿（半固體組織）或墊片的淋巴細(xì)胞分離管。操作注意事項(xiàng)70血樣結(jié)果非血結(jié)果可能解釋+活動(dòng)性TB-非TB+-潛伏感染（LTBI）/病灶部位非TB-+活動(dòng)性TB（提高檢出率）臨界值靈敏度特異性686-100%60-80%1492%89%2580%65%（文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，僅供參考）（文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，僅供參考）結(jié)果分析及討論71文獻(xiàn)：Utility of T-Cell Interferon-c Release Assays for Diagnosing Tuberculous Serositis: A Prospecti

32、ve Study in Beijing, China PLOS ONE 2014目的：評(píng)估通過(guò)T-SPOT方法檢測(cè)漿膜腔積液中的T淋巴細(xì)胞，對(duì)于結(jié)核性漿膜炎的診斷效率。方法：選取了北京協(xié)和醫(yī)院2008年至2011年收住的，以包括胸腔積液、腹腔積液、心包積液等在內(nèi)的漿膜腔積液為主要臨床表現(xiàn)的、疑診為結(jié)核性漿膜炎的206例住院病人開展了一項(xiàng)前瞻性研究，比較了漿膜腔積液和外周血T-SPOT兩種檢測(cè)方法對(duì)結(jié)核性漿膜炎的診斷價(jià)值。文獻(xiàn)解讀72敏感性敏感性特異性特異性陽(yáng)性預(yù)測(cè)值陽(yáng)性預(yù)測(cè)值陰性預(yù)測(cè)值陰性預(yù)測(cè)值外周血73%73.1%68.45%7.3%非血91.9%87.1%85%93.1%Cutoff為56

33、時(shí)非血90.5% 89.2% 87%92.2%結(jié)果：漿膜腔積液T-SPOT.TB的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值顯著高于外周血；漿膜腔積液結(jié)核特異性T細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于外周血，是后者的4.6倍；漿膜腔積液T-SPOT.TB診斷結(jié)核性漿膜炎的最佳臨界值為56（SFCs/106SEMC）。結(jié)論：T-SPOT方法檢測(cè)漿膜腔液中的T淋巴細(xì)胞，可以作為結(jié)核性漿膜腔炎診斷的新方法，其最佳臨界值為56（SFCs/106SEMC），當(dāng)漿膜腔積液T-SPOT與外周血T-SPOT二者的斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)之比大于1時(shí)，更傾向于診斷結(jié)核性漿膜炎 。 73 因非血標(biāo)本目前沒有確定的cutoff值，建議暫不報(bào)陰陽(yáng)性結(jié)果

34、只報(bào)斑點(diǎn)數(shù)； 對(duì)于陰性孔、A孔和B孔均出現(xiàn)很多斑點(diǎn)的情況：三個(gè)孔幾乎一樣，可能是雜細(xì)胞過(guò)多或標(biāo)本本身微生物污染嚴(yán)重，此種情況重復(fù)的意義并不大，建議不報(bào)結(jié)果，告知臨床具體情況；如果A/B孔斑點(diǎn)明顯是陰性的2倍，可以直接報(bào)陽(yáng)性； 如果有對(duì)應(yīng)血液結(jié)果，請(qǐng)多加關(guān)注對(duì)應(yīng)結(jié)果； 肺泡灌洗液考慮到生物安全性問(wèn)題，暫不建議做； 第三方不建議開展非血標(biāo)本，如有意愿，一定要詳細(xì)告知其中的問(wèn)題，我們不承擔(dān)不確定結(jié)果的損失及后續(xù)事宜； 隔夜標(biāo)本/非當(dāng)天標(biāo)本是否可以操作？非血難點(diǎn)問(wèn)題討論 T-SPOT.TB 技術(shù)原理 T-SPOT.TB 實(shí)驗(yàn)條件 T-SPOT.TB 標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)操作 T-SPOT.TB 結(jié)果分析討論 T

35、-SPOT.TB 非血標(biāo)本采集要求及操作 T-SPOT.TB 實(shí)驗(yàn)常見問(wèn)題解答目錄常見問(wèn)題 T-SPOT.TB的檢測(cè)原理和用途？的檢測(cè)原理和用途？T-SPOT.TB陽(yáng)性結(jié)果代表什么？陰性結(jié)果代表什么？陽(yáng)性結(jié)果代表什么？陰性結(jié)果代表什么？嘗試解釋嘗試解釋T-SPOT.TB的報(bào)告單的報(bào)告單 陰性孔出斑點(diǎn)是什么原因？污染如何避免？ T-SPOT.TB 標(biāo)本要求標(biāo)本要求 影響淋巴細(xì)胞分離效果和數(shù)量的因素有哪些； 有時(shí)PBMC 層中會(huì)摻雜紅細(xì)胞，如何解釋； 第二次離心速度是600g，第三次離心速度是350g，兩次離心的目的是什么；CO2培養(yǎng)箱濃度、溫度和濕度條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響大嗎；其它標(biāo)本結(jié)果都正常，個(gè)

36、別標(biāo)本陽(yáng)性對(duì)照孔偏弱/斑點(diǎn)少、小或不顯示沒有斑點(diǎn)出現(xiàn)，原因有哪些； 如果陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)大于20個(gè)，A孔或B孔的斑點(diǎn)數(shù)有陰性對(duì)照孔的2-3倍，結(jié)果能報(bào)陽(yáng)嗎； 為什么有些標(biāo)本的板條背景顏色比較深？哪些實(shí)驗(yàn)非正常操作會(huì)造成“假陰性”和“假陽(yáng)性”（王詩(shī)文） ？病人已經(jīng)排除結(jié)核，為何TSPOT檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性（王詩(shī)文） ？T-SPOT.TB 所用儀器設(shè)備有哪些所用儀器設(shè)備有哪些（王詩(shī)文） ？ 如何給客戶配試劑（配比比例）（王詩(shī)文） ？常見問(wèn)題 陰性對(duì)照孔出現(xiàn)斑點(diǎn)的原因； 如果一整板中只有不相連的個(gè)別陰性孔出斑點(diǎn)，可能是患者個(gè)體差異的原因，患者血液中有其他病原（如胞內(nèi)病毒，兒童容易感染的EB病毒）污染刺激導(dǎo)

37、致其他淋巴細(xì)胞發(fā)生應(yīng)答產(chǎn)生的，不是實(shí)驗(yàn)操作的問(wèn)題。病人在此期間服用某些藥物（升白細(xì)胞，血小板等），內(nèi)源性干擾因素會(huì)使結(jié)果陰性孔有斑點(diǎn)。如果一整板或者相連很多陰性孔出斑點(diǎn)，很可能是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中污染造成的，必須檢查實(shí)驗(yàn)各個(gè)環(huán)節(jié)，找到污染源，同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)復(fù)查。如果是污染或?qū)嶒?yàn)操作的原因，一定要重新抽血復(fù)查；如果有可能是病人本身的原因，建議兩周以后再?gòu)?fù)查。 常見問(wèn)題常見問(wèn)題 影響淋巴細(xì)胞分離效果的因素有哪些； 1. Ficoll和所用培養(yǎng)液沒有恢復(fù)到室溫，要提前一個(gè)小時(shí)從冰箱取出；標(biāo)本抽取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；2. 標(biāo)本沒有在1825保溫；3. 血液稀釋時(shí)沒有充分混勻或沒有嚴(yán)格按照1:1稀釋；4. 血液抗凝不充分，出現(xiàn)凝塊；5. 個(gè)體的差異，同一種實(shí)驗(yàn)條件，不同來(lái)源血可能情況不一，特別是特殊人群（老人/HIV患者/免疫力低下患者）細(xì)胞本身就少一些；6. 離心速度過(guò)小以致尚未完全分層或速度不穩(wěn)定；7. 離心機(jī)降速太快，目的細(xì)胞無(wú)法富集，要使離心機(jī)完全停下來(lái)的時(shí)間在2min以上比較理想。 8. AIM-V添加量過(guò)多，500l 使細(xì)胞濃度降低（建議最后加400-500l)。最后一步洗滌后1640殘留過(guò)多。常見問(wèn)題 有時(shí)PBMC 層中會(huì)摻雜紅細(xì)胞，如何解釋； 可能血液是血液中的紅細(xì)胞破裂成碎片，