牡丹籽粕中提取芍藥苷方法的研究

1、牡丹籽粕中提取芍藥苷方法的研究菏澤堯舜牡丹生物科技有限公司主要內(nèi)容 課題選擇的背景一一 研究的意義二二 研究的內(nèi)容三三 經(jīng)濟效益分析 專利及查新報告一、課題選擇的背景 本項目研究目的是開發(fā)油用牡丹籽粕的附加值。 首先對牡丹籽粕中生物活性成分進行分析評估，探索開發(fā)利用的方法。從而延長牡丹產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)鏈，以高新技術(shù)促進牡丹生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展。 本課題以本公司生產(chǎn)牡丹籽油后的牡丹籽粕為原料，對其水醇提取液進行了高效液相、質(zhì)譜分析首先確定了含有芍藥苷成分，進一步確認了芍藥總苷含量約在2.65mg/g。后續(xù)研究了從牡丹籽提取芍藥苷的提取工藝及純化工藝。二、研究的意義芍藥苷是來源于赤芍白芍的一種藥物，是一種單萜類

2、糖。國內(nèi)外研究其藥理作用廣泛： 具有擴張血管、擴張冠脈血管、對抗急性心肌缺血以及抑制血小板凝聚等多方面作用， 鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗炎抗?jié)?、解熱解痙、 利尿、抗應(yīng)激性潰瘍病。 市場產(chǎn)品有芍藥苷膠囊，主治類風(fēng)濕性疾病，療效非常顯著。芍藥苷傳統(tǒng)的主要來源是毛茛科植物芍藥的根，含量以赤芍為高，含量約3%。以植物根部為主，一次性利用，且植物生長周期為5-6年，生產(chǎn)周期長。本課題以牡丹籽粕為芍藥苷的來源，每年都可以收獲種子，且種子產(chǎn)量高，有明顯的經(jīng)濟效益和社會效益。我國是世界上最大的牡丹種植國家，研究表明，牡丹籽畝均產(chǎn)籽300-400公斤，目前產(chǎn)量高達5萬噸左右，居世界第一位。目前牡丹產(chǎn)業(yè)化利用報到較少，主要集

3、中于牡丹籽油的生產(chǎn)工藝、質(zhì)控和用途研究方面。而牡丹籽油生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的籽粕的開發(fā)利用未見詳細的研究報到。三、研究內(nèi)容 牡丹籽粕中芍藥苷類成分的分離牡丹籽粕中芍藥苷類成分的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定純化和結(jié)構(gòu)鑒定 牡丹籽粕中芍藥苷類的含量分析牡丹籽粕中芍藥苷類的含量分析 牡丹籽粕中提取芍藥苷的工藝研究牡丹籽粕中提取芍藥苷的工藝研究 芍藥苷提取液的純化研究芍藥苷提取液的純化研究三-1、牡丹籽粕中芍藥苷類成分 的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定 取1 Kg牡丹餅粕過40目篩，用30%乙醇冷浸提取3次，合并提取液，減壓濃縮，再用高濃度乙醇沉淀，取上清液濃縮回收溶劑，得到480 mL混懸液。過HPD-200A型大孔吸附樹脂柱

4、，用50%乙醇洗脫。流出液合并后，各洗脫餾分用半制備型高效液相色譜分離純化。三-1、牡丹籽粕中芍藥苷類成分 的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定 各洗脫餾分用半制備型高效液相色譜分離純化，分別得到主要的化學(xué)成分，包括化合物1（380 mg）、2（700 mg）、3（100 mg）、4（400 mg）、5（320 mg）和6（140 mg）。圖1 餅粕提取物的LC-MS色譜圖三-1、牡丹籽粕中芍藥苷類成分 的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定 對提取物進行LC-MS分析，經(jīng)質(zhì)譜碎片分析得出：化合物1和3為同分異構(gòu)體，相對分子質(zhì)量為642，2和4為同分異構(gòu)體，相對分子質(zhì)量為480。 對6種化合物進行H-NMR分析（譜圖見附表），

5、結(jié)合文獻初步確定了這6種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，它們分別是：化合物1： 6-O-D葡萄糖芍藥內(nèi)酯苷；2：芍藥內(nèi)酯苷； 3： -gentiobiosylpaeoniflorin；4： 芍藥苷；5： 苯甲酸；6：芍藥苷元。6種化合物H-NMR圖1、 6-O-D葡萄糖芍藥內(nèi)酯苷5： 苯甲酸3： -gentiobiosylpaeoniflorin6：芍藥苷元4： 芍藥苷2芍藥內(nèi)酯苷三-2、牡丹籽餅粕中芍藥苷類 的含量分析 以上述試驗中制備出的6種成分的純品為對照品，建立了一種直接測定牡丹籽餅粕中芍藥苷類成分的HPLC分析方法，其色譜條件如下： 流動相：A：500 L/L甲酸水溶液； B：甲醇含500 L/L

6、的甲酸； 梯度洗脫程序：（min/B%）0/40，4/40， 8/60，15/60，16/40，20/40； DAD檢測器，檢測波長：230 nm； 流速：0.8 mL/min； 溫度：30； 進樣量：5 L；峰面積外標法定量。三-2、牡丹籽餅粕中芍藥苷類 的含量分析 精確稱取1、2、3、4、5、6號物質(zhì)的對照品溶于40%甲醇中，配制成一定濃度的混合對照品貯備液，取上述對照品貯備液，用40%甲醇稀釋合適的倍數(shù)，按上述的色譜條件重復(fù)進樣分析（n = 5），以評價方法的精密度。 取上述對照品貯備液，用40%甲醇稀釋，配制不同濃度的系列標準溶液，按上述的色譜條件分析，以進樣質(zhì)量為自變量（X，g），峰

7、面積為因變量（Y，mvs），分別求出各成分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。以3倍信噪比（S/N）所對應(yīng)的進樣質(zhì)量求得最低檢出限。三-2、牡丹籽餅粕中芍藥苷類 的含量分析 結(jié)果顯示，用該方法對餅粕中的芍藥苷類成分進行分析，各成分具有較好的分離度，相對標準偏差在1.91%2.72% 之間，線性范圍在20 ng5000 ng之間，最低檢出限為3.6 ng16.1 ng之間，回歸方程的相關(guān)系數(shù)r介于0.99920.9999，6種成分可以在16 min之內(nèi)實現(xiàn)良好分離。HPLC色譜圖如圖2所示。三-2、牡丹籽餅粕中芍藥苷類 的含量分析 經(jīng)與標準品定量分析得出芍藥苷的含量大約為15.6 mg/g。芍藥

8、苷同族物總含量大約為26.6 mg/g（以芍藥苷計，1號峰為2.05 mg/g牡丹籽粕，2號峰為6.95 mg/g牡丹籽粕）。圖中成分：1，2：可能是芍藥苷同系物；3：未知多酚成分；4：芍藥苷。三-3、牡丹籽粕中提取芍藥苷 的工藝研究 稱取一定質(zhì)量牡丹籽粕，考察不同溫度、料液比、乙醇濃度，超聲提取時間等因素，以測得樣品芍藥總苷含量為考察指標，選用L9(34)正交試驗。抽濾，殘渣按上述條件重復(fù)提取一次，抽濾，合并提取液，50真空水浴濃縮，直至無醇味，4000 r/min離心15 min除去上層懸浮物，備用。三-3、牡丹籽粕中提取芍藥苷 的工藝研究通過對表2各因素的綜合評價，由表2中極差大小可以看

9、出，影響提取液芍藥苷濃度的因素主次順序為BCDA。隨所選水平因素變動，4種因素的最佳組合為A3,B3,C2,D3，這與R的大小排列是一致的，即用10倍于原料的70 %乙醇溶液在50的超聲處理30 min，芍藥苷提取量最高。三-4、芍藥苷提取液的純化研究 95%乙醇處理后樹脂（HPD200A，HPD100， D-101，D-101A，AB-8）做吸附解吸附純化研究實驗，通過靜態(tài)動力吸附曲線、動態(tài)吸附試驗篩選樹脂，并在此基礎(chǔ)上考察上樣液濃度對吸附效果的影響和乙醇濃度對洗脫效果的影響三-4、芍藥苷提取液的純化研究由表3選用吸附率和解吸率都較高的HPD-200A、D101A和HPD100三種樹脂，以吸

10、附時間為橫坐標，吸附量為縱坐標作圖，進行樹脂的靜態(tài)吸附動力曲線分析，結(jié)果如圖4所示。三種樹脂都在1h左右即可達到吸附平衡，但HPD200A吸附量較另兩種更高些，所以選用HPD200A進行試驗。三-4、芍藥苷提取液的純化研究上樣濃度為8 mg/ml時泄漏點出現(xiàn)較早且上樣量為5倍柱體積時吸附量最大，為88.07 mg/g。由圖可以看出為了使泄露點更早些上樣量還可以再大些。如圖可以看出20%乙醇不能充分洗脫目標物，40%、50%和60%都可將目標物較完全洗出，出于節(jié)省試劑和時間以及提高產(chǎn)品純度的考慮，選用50%乙醇，3.5BV進行洗脫目標物最合適。此條件下芍藥苷收率為61.6%，芍藥苷純度為50.2

11、6%，芍藥苷同族物總含量占84.2%（HPLC法）。牡丹籽粕中提取芍藥苷工藝流程牡丹籽粕糖漿狀浸膏晶體膏狀物粗品70%乙醇超聲逆流提取真空濃縮（T60）用水溶解后石油醚萃取三次水相真空濃縮（T60）用洗脫劑（50%乙醇）溶解過硅膠柱真空濃縮放置結(jié)晶重結(jié)晶四、經(jīng)濟效益分析 本項目總投資為1168萬元，其中建設(shè)投資768萬元，流動資金400萬元。銷售價格90%含量的1.35萬元/KG，按年生產(chǎn)6噸計算，本項目生產(chǎn)期年銷售收入為8100萬元，年平均利稅6617萬元，年平均稅后利潤為 2835萬元。 從財務(wù)分析數(shù)據(jù)可見，本項目投資利潤率 218.60%，盈虧平衡點13.53%，具有較強的抗風(fēng)險能力，表明該項目在經(jīng)濟上是可行的。五、專利及查新報告 已受理專利一篇：一種從牡丹籽粕中提取芍藥苷的方法，申請?zhí)?01310044907.3 查新結(jié)論 國內(nèi)外有從牡丹根、莖、葉中提取芍藥苷的報道，除本項目委托單位外，未見與本項目研究內(nèi)容完全相同的牡丹籽粕中提取芍藥苷方法的報道