神經(jīng)生物學(xué)常用研究方法實(shí)用教案

1、 神經(jīng)科學(xué)的興起(xngq)中國內(nèi)經(jīng)（漢或秦）：腦為諸髓之海中國內(nèi)經(jīng)（漢或秦）：腦為諸髓之海國外：醫(yī)學(xué)之父希波克拉底（國外：醫(yī)學(xué)之父希波克拉底（HippocratesHippocrates， 460377BC.460377BC.）提出腦是精神活動的器官）提出腦是精神活動的器官; ;而古羅馬而古羅馬醫(yī)學(xué)家蓋倫則認(rèn)為醫(yī)學(xué)家蓋倫則認(rèn)為, ,腦是理性靈魂的器官腦是理性靈魂的器官, ,感覺、記感覺、記憶、思維憶、思維(swi)(swi)、想象、判斷等都是腦的功能；、想象、判斷等都是腦的功能；德國醫(yī)生加爾指出腦是思想的器官德國醫(yī)生加爾指出腦是思想的器官 “ “顱相學(xué)顱相學(xué)” 第1頁/共93頁第一頁，共93

2、頁。蓋倫（蓋倫（129-200）：醫(yī)學(xué)上的權(quán)威僅次于希波克拉底，他認(rèn)為）：醫(yī)學(xué)上的權(quán)威僅次于希波克拉底，他認(rèn)為人體具有三種靈魂，即（一）生長靈魂，這是人、動物和植人體具有三種靈魂，即（一）生長靈魂，這是人、動物和植物所共有的，在人體它位于臍部；物所共有的，在人體它位于臍部；(二）動物靈魂，這是人和二）動物靈魂，這是人和動物所共有的，它位于心臟、主管感覺和運(yùn)動；動物所共有的，它位于心臟、主管感覺和運(yùn)動；(三）理性靈三）理性靈性靈魂，這只有人才具備性靈魂，這只有人才具備(jbi),位于腦部，主管智慧。位于腦部，主管智慧。 希波克拉底（公元前希波克拉底（公元前460-377）：被西方尊為）：被西方尊

3、為“醫(yī)學(xué)之父醫(yī)學(xué)之父”的的古希臘著名醫(yī)生，歐洲醫(yī)學(xué)奠基人，古希臘醫(yī)師，西方醫(yī)學(xué)古希臘著名醫(yī)生，歐洲醫(yī)學(xué)奠基人，古希臘醫(yī)師，西方醫(yī)學(xué)奠基人。提出奠基人。提出“體液體液(ty)(humours)學(xué)說學(xué)說”， 認(rèn)為人的體液認(rèn)為人的體液(ty)由血液、粘液、黃膽和黑膽組成；破除巫術(shù)和宗教對醫(yī)由血液、粘液、黃膽和黑膽組成；破除巫術(shù)和宗教對醫(yī)學(xué)的禁錮，醫(yī)病人，而不是??；提出大腦是神經(jīng)系統(tǒng)的中心，學(xué)的禁錮，醫(yī)病人，而不是病；提出大腦是神經(jīng)系統(tǒng)的中心，批評亞里斯多德關(guān)于心臟是思維器官的說法批評亞里斯多德關(guān)于心臟是思維器官的說法 第2頁/共93頁第二頁，共93頁。加爾（加爾（19世紀(jì)初世紀(jì)初 ）：德國的解剖學(xué)家

4、，專門從事顱骨）：德國的解剖學(xué)家，專門從事顱骨(lg)和和腦的研究。顱相學(xué)指分析人的心理與頭顱形狀之間關(guān)系的理腦的研究。顱相學(xué)指分析人的心理與頭顱形狀之間關(guān)系的理論學(xué)說。加爾從小就喜歡觀察人的外表（尤其是顱骨論學(xué)說。加爾從小就喜歡觀察人的外表（尤其是顱骨(lg)外外表）同心理的關(guān)系。例如，他根據(jù)個人長期的個案觀察，發(fā)表）同心理的關(guān)系。例如，他根據(jù)個人長期的個案觀察，發(fā)現(xiàn)眼睛明亮的人，一般記憶力較好；頭骨隆起的人，可能象現(xiàn)眼睛明亮的人，一般記憶力較好；頭骨隆起的人，可能象征著貪婪的腦機(jī)能，是監(jiān)獄中扒手的特征等。根據(jù)當(dāng)時生理征著貪婪的腦機(jī)能，是監(jiān)獄中扒手的特征等。根據(jù)當(dāng)時生理和解剖知識，寫了一套名

5、為神經(jīng)系統(tǒng)的解剖學(xué)和生理學(xué)和解剖知識，寫了一套名為神經(jīng)系統(tǒng)的解剖學(xué)和生理學(xué)的系列著作，除了就神經(jīng)系統(tǒng)及其機(jī)能進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)、保守的闡的系列著作，除了就神經(jīng)系統(tǒng)及其機(jī)能進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)、保守的闡述之外，還兼論顱相學(xué)。述之外，還兼論顱相學(xué)。 第3頁/共93頁第三頁，共93頁。神經(jīng)科學(xué) (1990-2000 腦的十年(sh nin) (2001-2100 腦的世紀(jì))生 命 科 學(xué)解剖學(xué)生理學(xué)生物化學(xué)(shn w hu xu) 認(rèn)知科學(xué)（人類(rnli)感知和思維信息處理過程的科學(xué)）開發(fā)腦開發(fā)人腦 增強(qiáng)智能模擬人腦 智能電腦保護(hù)腦壽命延長 PD, AD, 中風(fēng)高速交通 顱腦, 脊髓外傷生活節(jié)奏 焦慮,抑郁,精神病生

6、活質(zhì)量 鎮(zhèn)痛 祛痛社會開放 吸毒問題了解腦分子 細(xì)胞 網(wǎng)絡(luò) 全腦 (離體研究) (無創(chuàng)在體研究) Patch（電） 腦地形圖 RIA(化學(xué)） PET(化學(xué)） PCR(基因） fMRI (功能） Confocal CT(形態(tài)） (形態(tài)） 行為變化第4頁/共93頁第四頁，共93頁。百年(binin)來與神經(jīng)科學(xué)有關(guān)的諾貝爾獎獲得者選介(I)C.S.Sherrington (英)18571850190019502000C.Golgi (意)19261934神經(jīng)元染色(rns)方法18431852R.Cajal (西班牙)“神經(jīng)元學(xué)說(xu shu)”形態(tài)190619521932“突觸”定名“反射”概

7、念“交互”抑制反射學(xué)說生理電生理18891977感覺神經(jīng)纖維電活動傳入沖動大腦誘發(fā)電位神經(jīng)控制骨骼肌運(yùn)動機(jī)制E.D.Adrian (英)電生理O.Loewi (德 英)196118731936（乙酰膽堿）神經(jīng)化學(xué)蛙心灌流實(shí)驗(yàn)“迷走物質(zhì)”19681875H.Dale (英)神經(jīng)末梢分泌乙酰膽堿ACh神經(jīng)化學(xué)18741965194419631888J.Erlanger (美)H.S.Gasser (美)陰極射線示波器神經(jīng)纖維的分類ABC19731881W.R.Hess (瑞士)腦立體定位儀 hypothalamus方法學(xué)創(chuàng)新1949電生理OxfCambridge徒手切腦片銀染神經(jīng)元染出神經(jīng)末梢，發(fā)

8、現(xiàn)神經(jīng)元之間無原生質(zhì)聯(lián)系巴浦洛夫 （1904）第5頁/共93頁第五頁，共93頁。百年(binin)來與神經(jīng)科學(xué)有關(guān)的諾貝爾獎獲得者選介(II)神經(jīng)(shnjng)藥理學(xué)分子(fnz)藥理學(xué)1850190019502000J.C. Eccles (澳大利亞) 191419031963A.L.Hodgkin (英)B.Katz (德 英)1917A.F.Huxley (英)細(xì)胞內(nèi)微電極突觸后電位抑制性遞質(zhì)突觸電壓鉗技術(shù)動作電位的離子學(xué)說數(shù)學(xué)方程表述 NM終板電位遞質(zhì)“量子釋放”1911動作電位機(jī)制19051983U.Von Euler (瑞典)交感神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素1970兒茶酚胺代謝影響CAs

9、的藥物電生理1912J.Axelrod (美)（兒茶酚胺）神經(jīng)化學(xué)1913(左右腦)R.W.Sperry (美)1981“腦功能側(cè)化”D.Hubel (加 美)19261924T.Wiesel (瑞典 美)信息加工視皮層E.Neher (德)1991B.Sakmann (德)大腦視覺信息加工視覺系統(tǒng)發(fā)育的可塑性膜片鉗單通道方法學(xué)膜片鉗技術(shù)單個離子通道電流記錄1999英，澳CambridgeCambridgeLevi Montalcini 1986 Nerve growth Factor (NGF) (Italy)第6頁/共93頁第六頁，共93頁。百年(binin)來與神經(jīng)科學(xué)有關(guān)的諾貝爾獎獲得

10、者選介(3)1850190019502000192619232000P.Greengard (美)1930E.Kandel (美)A.Carlsson (瑞典(ru din)神經(jīng)系統(tǒng)(shnjngxtng)中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白磷酸化慢突觸傳遞多巴胺生理科學(xué)進(jìn)展2001 年第32 卷第2 期第7頁/共93頁第七頁，共93頁。 2004年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎頒發(fā)給美國科學(xué)家理查德阿克塞爾和琳達(dá)巴克，以表彰他們在人體(rnt)氣味受體和嗅覺系統(tǒng)組織方式研究中作出的杰出貢獻(xiàn)。 第8頁/共93頁第八頁，共93頁。神經(jīng)科學(xué)的特點(diǎn)(tdin)多學(xué)科(xuk)綜合第9頁/共93頁第九頁，共93頁。神經(jīng)科學(xué)的特點(diǎn)(

11、tdin)多層次的研究(ynji)第10頁/共93頁第十頁，共93頁。研究(ynji)水平 整體行為水平：行為學(xué)，軀體感覺，視整體行為水平：行為學(xué)，軀體感覺，視聽覺，痛覺等聽覺，痛覺等 細(xì)胞水平：神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞水平：神經(jīng)細(xì)胞(shn jn x bo)培養(yǎng)、生物電活動檢測、通路示蹤、細(xì)培養(yǎng)、生物電活動檢測、通路示蹤、細(xì)胞染色、免疫化學(xué)、凋亡檢測胞染色、免疫化學(xué)、凋亡檢測 分子水平的實(shí)驗(yàn)：離子通道、受體、酶、分子水平的實(shí)驗(yàn)：離子通道、受體、酶、遺傳物質(zhì)等遺傳物質(zhì)等第11頁/共93頁第十一頁，共93頁。神經(jīng)生物學(xué)常用(chn yn)研究方法 形態(tài)學(xué)方法形態(tài)學(xué)方法 大體：解剖、影像大體：解剖、影像 組織

12、：常規(guī)染色和特殊染色、束路追蹤組織：常規(guī)染色和特殊染色、束路追蹤(zhuzng)、免疫組化、原位雜交、神經(jīng)細(xì)、免疫組化、原位雜交、神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)等胞培養(yǎng)等 生理學(xué)方法生理學(xué)方法 生物化學(xué)方法生物化學(xué)方法 分子生物學(xué)方法分子生物學(xué)方法第12頁/共93頁第十二頁，共93頁。神經(jīng)(shnjng)影像（Neuroimaging） Invasive: Single unit recording Multi-unit recording PET (positron emission tomography) Non-invasive: CT (computed tomography) ERP (event-r

13、elated potential) MEG (magnoencephalography) MRI (magnetic resonance imaging) fMRI (functional magnetic resonance imaging)第13頁/共93頁第十三頁，共93頁。Choice of the MethodsChoice of the methods depends on the scientific question being asked. For neuronal activity, at a cellular level, use single- or multi-uni

14、t recording. For questions of structure, use CT or MRI. For questions of function, or system interactions, where the anatomy is of interest, use PET or fMRI. For questions of processing, where timing is important, use ERP and/or MEG.第14頁/共93頁第十四頁，共93頁。Single- & Multi-unit RecordingInvasive: implanti

15、ng an electrode into the brainPassive: recording the activity (action potentials) of one or more neurons, not stimulating activityUsually only done with animals or people requiring neurosurgery第15頁/共93頁第十五頁，共93頁。Positron Emission Tomography (PET，正電子發(fā)射(fsh)計(jì)算機(jī)斷層顯像)O15 Water FDG orF18 fluorodeoxygluco

16、se第16頁/共93頁第十六頁，共93頁。18F-FDG PET18F-FDG PET腦代謝顯像，腦代謝顯像，正常人與老年性癡呆對照正常人與老年性癡呆對照(duzho)(duzho)，患者雙側(cè)頂葉、，患者雙側(cè)頂葉、顳葉皮質(zhì)對稱性低代謝。顳葉皮質(zhì)對稱性低代謝。 18F-DOPA PET18F-DOPA PET腦受體顯像，正常人腦受體顯像，正常人與帕金森氏病腦紋狀體多巴胺受體與帕金森氏病腦紋狀體多巴胺受體密度影像對照，患者雙側(cè)紋狀體密密度影像對照，患者雙側(cè)紋狀體密度明顯度明顯(mngxin)(mngxin)減少減少 第17頁/共93頁第十七頁，共93頁。CT or CAT scan(Compute

17、d Tomography)第18頁/共93頁第十八頁，共93頁。Magnetoencephalography (腦磁波描計(jì)術(shù)，腦磁波描計(jì)術(shù)，MEG)151 Channel MEG Current flow in neurons creates local magnetic fields MEG measures local magnetic field changes from the surface of the scalp using superconducting coils or SQUIDs Excellent temporal resolution Better spatial r

18、esolution than ERP第19頁/共93頁第十九頁，共93頁。MRI vs MEG第20頁/共93頁第二十頁，共93頁。Magnetic Resonance Imaging (MRI)第21頁/共93頁第二十一頁，共93頁。fMRI (functional magnetic resonance imaging)Brain activityOxygen consumptionCerebral blood flowOxyhemoglobinDeoxyhemoglobinMagnetic susceptibility T2* MRI signal intesity 第22頁/共93頁第二

19、十二頁，共93頁。組織學(xué)與細(xì)胞學(xué) 常規(guī)染色和特殊染色 束路追蹤 免疫組化 原位雜交 神經(jīng)細(xì)胞(shn jn x bo)培養(yǎng)等第23頁/共93頁第二十三頁，共93頁。常用普通(ptng)染色方法TTC染色(rns) HE鋨酸染色(rns)氯化金浸染 Cajal銀浸染色(rns) 尼氏染色(rns) 第24頁/共93頁第二十四頁，共93頁。HE（蘇木(s m)素伊紅）第25頁/共93頁第二十五頁，共93頁。鋨酸染色是神經(jīng)科學(xué)研究的一種常用(chn yn)而普遍的方法，它本來是用來固定脂質(zhì)的，由于髓鞘的主要成分是脂質(zhì)，所以用于有髓神經(jīng)纖維的染色 鋨酸染色(rns)第26頁/共93頁第二十六頁，共93

20、頁。氯化金浸染(jnrn)運(yùn)動(yndng)終板Ach熒光(ynggung)染色氯化金浸染第27頁/共93頁第二十七頁，共93頁。Cajal銀浸染(jnrn)色第28頁/共93頁第二十八頁，共93頁。尼氏染色(rns) 多種方法，HE、甲苯胺(bn n)藍(lán)，焦油紫，硫堇，天青，派洛寧，中性紅以及棓花青等堿性苯胺(bn n)染料均可以使尼氏體著色 第29頁/共93頁第二十九頁，共93頁。束路追蹤(zhuzng) 原理：軸漿運(yùn)輸 示蹤物質(zhì)：HRP，熒光染料(rnlio)，各種標(biāo)記物標(biāo)記的葡萄糖，放射性核素標(biāo)記的氨基酸等。 觀察：根據(jù)示蹤物質(zhì)不同，采用組織顯色、熒光顯微鏡或放射自顯影等方法。第30頁

21、/共93頁第三十頁，共93頁。免疫組化 原理(yunl)示意圖： 間接法： 直接法：第31頁/共93頁第三十一頁，共93頁。免疫組化 根據(jù)(gnj)二抗標(biāo)記的不同（熒光素、酶、鐵蛋白、膠體金或銀標(biāo)記），免疫組化包括免疫熒光、免疫酶組織化學(xué)、免疫金銀及鐵標(biāo)記技術(shù) 第32頁/共93頁第三十二頁，共93頁。原位雜交 核酸分子雜交技術(shù)，檢測細(xì)胞內(nèi)mRNA和DNA序列片段，原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。 基本原理是根據(jù)兩條單鏈核苷酸互補(bǔ)堿基序列專一配對的特點(diǎn)，應(yīng)用已知堿基序列并具有(jyu)標(biāo)記物的RNA或DNA片段即核酸探針（probe），與組織切片或細(xì)胞內(nèi)的待測核酸（RNA或DNA片段

22、）進(jìn)行雜交，通過標(biāo)記物的顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在與定位。第33頁/共93頁第三十三頁，共93頁。原位雜交 此項(xiàng)技術(shù)需首先制備某種核酸探針，其種類主要有三種：利用大肝桿菌重組帶有目的基因的質(zhì)粒DNA，制成互補(bǔ)DNA探針(cDNA)；應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶消化制成線性DNA模板，在體外轉(zhuǎn)錄獲得反義RNA探針(cDNA)；依照待測核酸的核苷酸序列，應(yīng)用DNA合成(hchng)儀合成(hchng)寡聚核苷酸探針。 cRNA和cDNA的常用標(biāo)記物有32S、32P、3H等放射性核素和熒光素、生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)。第34頁/共93頁第三十四頁，共93頁。原位雜交 組織學(xué)應(yīng)用的

23、原位雜交術(shù)主要是染色體原位雜交和細(xì)胞原位雜交。前者是研究遺傳基因、抗原基因、受體基因、癌基因等在染色體上的定位與表達(dá)；后者是研究細(xì)胞某種蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄物mRNA在胞質(zhì)內(nèi)的定位與表達(dá)。 核酸分子雜交術(shù)有很高的敏感性和特異性，它是免疫細(xì)胞化學(xué)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從分子水平探討細(xì)胞功能的表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制(jzh)的，已成為當(dāng)前神經(jīng)生物學(xué)研究的重要手段。第35頁/共93頁第三十五頁，共93頁。 最常用(chn yn)的有兩種 神經(jīng)行為學(xué) 電生理學(xué)第36頁/共93頁第三十六頁，共93頁。一、神經(jīng)(shnjng)行為學(xué) Behavioral neuroscience is the study of the

24、neural mechanisms mediating normal and abnormal behaviors. 自主活動 動物焦慮檢測：實(shí)施焦慮因素，如飲食或飲水剝奪，檢測反應(yīng)，可以用于藥物篩選。 性和生殖行為：進(jìn)化，神經(jīng)(shnjng)內(nèi)分泌作用機(jī)制 學(xué)習(xí)記憶 攝食行為 驚恐反射 社會行為 .第37頁/共93頁第三十七頁，共93頁。自主(zzh)活動箱實(shí)驗(yàn) 動物的自主活動標(biāo)志著動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮狀態(tài)，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮時，自主活動加強(qiáng)，抑制時則自主活動減少。觀察動物自主活動是評價中樞神經(jīng)興奮狀態(tài)的一項(xiàng)主要(zhyo)指標(biāo)。 多種作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物都可影響動物的自主活動，因而自

25、主活動的記錄是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的主要(zhyo)方法，而且在新藥研究中，觀察藥物對動物自主活動的影響也是評價藥物是否影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要方法第38頁/共93頁第三十八頁，共93頁。自主活動(hu dng)箱實(shí)驗(yàn)主要(zhyo)技術(shù)指標(biāo)：運(yùn)動次數(shù)第39頁/共93頁第三十九頁，共93頁。洞板實(shí)驗(yàn)(shyn)檢測小鼠自動活動，可用于新藥，一般藥理，神經(jīng)系統(tǒng)的研究和中樞興奮性，抑制性研究。主要技術(shù)指標(biāo)：小鼠探小鼠探洞次數(shù)洞次數(shù)。第40頁/共93頁第四十頁，共93頁。學(xué)習(xí)記憶學(xué)習(xí)記憶(jy)的行為學(xué)檢測的行為學(xué)檢測 學(xué)習(xí)記憶功能包括空間學(xué)習(xí)記憶功能和非空間學(xué)習(xí)記憶功能。隨著對大腦學(xué)習(xí)記憶機(jī)制研究(

26、ynji)的不斷深入以及尋找有效防治認(rèn)知障礙類疾病方法的需要，使得動物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)成為研究(ynji)腦高級功能及其他神經(jīng)科學(xué)的不可缺少的重要手段，客觀準(zhǔn)確地評價實(shí)驗(yàn)動物的學(xué)習(xí)記憶水平已成為神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)中非常重要的研究(ynji)內(nèi)容。 第41頁/共93頁第四十一頁，共93頁。學(xué)習(xí)記憶功能檢測的常用實(shí)驗(yàn)(shyn)程序空間學(xué)習(xí)記憶任務(wù)空間學(xué)習(xí)記憶任務(wù)非空間學(xué)習(xí)記憶任務(wù)非空間學(xué)習(xí)記憶任務(wù)Morris水迷宮水迷宮T迷宮迷宮6或或8臂放射狀水迷宮臂放射狀水迷宮Lashley 迷宮迷宮放射狀迷宮（放射狀迷宮（8臂、臂、12臂）臂）H-W迷宮迷宮Y迷宮迷宮新奇物體認(rèn)知新奇物體認(rèn)知環(huán)形平臺環(huán)形平臺

27、嗅覺辨別嗅覺辨別T迷宮迷宮穿梭箱實(shí)驗(yàn)穿梭箱實(shí)驗(yàn)跳臺實(shí)驗(yàn)跳臺實(shí)驗(yàn)第42頁/共93頁第四十二頁，共93頁。 Morris迷宮(mgng) 1981年，英國心理學(xué)家Morris首次設(shè)計(jì)應(yīng)用了這種水迷宮及其程序。目的是幫助大腦學(xué)習(xí)記憶機(jī)制的研究。起初實(shí)驗(yàn)動物主要為大鼠，此后該迷宮系統(tǒng)成為評估嚙齒類動物空間學(xué)習(xí)和記憶能力(nngl)的經(jīng)典程序，廣泛運(yùn)用于神經(jīng)生物學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中。第43頁/共93頁第四十三頁，共93頁。Morris水迷宮(mgng) 應(yīng)用(yngyng):判斷動物空間學(xué)習(xí)記憶能力組成: 觀察指標(biāo)觀察指標(biāo): :潛伏期，潛伏期，路徑，不同路徑，不同(b (b tn)tn)象限

28、的停留時象限的停留時間和長度，搜索策間和長度，搜索策略等略等 第44頁/共93頁第四十四頁，共93頁。Morris水迷宮(mgng)第45頁/共93頁第四十五頁，共93頁。第46頁/共93頁第四十六頁，共93頁。Morris水迷宮(mgng) 原理 水是嚙齒類動物非常厭惡的刺激或環(huán)境。鼠在水池中就會急于尋找逃路。它們的習(xí)性為在水池四周尋找出口逃避，但深而光滑的垂直池壁阻礙了這種企圖。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的水下平臺（用于小鼠的常為水面下1 cm）可提供鼠棲身的場所。但在巨大的水面上，強(qiáng)迫游泳的動物不能看見平臺。它們?nèi)粢焖僬业狡脚_而避免淹沒就必須利用環(huán)境中的線索進(jìn)行定位。從而檢測了鼠記住環(huán)境中的線索及其與

29、平臺位置關(guān)系而對平臺進(jìn)行定位的能力（學(xué)習(xí)(xux)記憶能力）。第47頁/共93頁第四十七頁，共93頁。Morris水迷宮(mgng)的優(yōu)點(diǎn)及不足 由于對年齡相關(guān)性空間記憶損害有可靠的敏感性，Morris水迷宮是判斷老年小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的特別有用的工具。 驅(qū)動動物逃避的是水刺激，而不需要食物和水的剝奪。因此，避免了剝奪食物和水后給實(shí)驗(yàn)動物帶來的新陳代謝方面的問題。 動物不必接受電休克，這在那些食欲促進(jìn)任務(wù)（appetitive tasks）如輻射狀迷宮和T迷宮中是常規(guī)的要求。 能提供較多的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，系統(tǒng)全面地考察實(shí)驗(yàn)動物空間認(rèn)知加工的過程，客觀(kgun)地反映其認(rèn)知水平。 將實(shí)驗(yàn)動物的學(xué)習(xí)

30、記憶障礙和感覺、運(yùn)動缺陷等分離開來，減少它們對學(xué)習(xí)記憶過程檢測的干擾。 既可以檢測空間參考記憶又可以檢測空間工作記憶。在用固定平臺測試小鼠的空間參考記憶后再將平臺的位置改為不固定，就可檢測它們的工作記憶能力。顯然，尋找不固定平臺的認(rèn)知過程要復(fù)雜一些，需要動物對時間和空間上的分離信息加以整合和判斷。 操作簡便，數(shù)據(jù)誤差較小。第48頁/共93頁第四十八頁，共93頁。Morris水迷宮(mgng)的不足之處 由于需要監(jiān)視系統(tǒng)及分析軟件，只有少數(shù)裝備較好的實(shí)驗(yàn)室可以實(shí)施。 實(shí)驗(yàn)程序的設(shè)計(jì)需要考慮的因素較多，同時需要實(shí)驗(yàn)者具備一定的神經(jīng)生理學(xué)、認(rèn)知生理學(xué)和數(shù)理統(tǒng)計(jì)方面的知識，給實(shí)驗(yàn)的開展和結(jié)果的解釋帶來

31、困難，同時也限制了該迷宮的深入廣泛的應(yīng)用。 由于體力消耗太大，體溫也喪失過多，年老體弱鼠完成任務(wù)較困難。 并非所有鼠株都適合于Morris迷宮測試，如BALB/c不能學(xué)會該任務(wù)（成績并不隨天數(shù)的增加而進(jìn)步），129/SvJ的學(xué)習(xí)成績也偏差。 個體間的成績差異巨大。 某些株，如129/SvJ株的小鼠由于有年齡相關(guān)性視路病變(visual pathology)，在衰老時完成以視覺為基礎(chǔ)的學(xué)習(xí)記憶任務(wù)時就會出現(xiàn)困難。在C57BL/6株，由于嚴(yán)重(ynzhng)的禿頭癥（alopecia）存在，可能使某些小鼠產(chǎn)生抑郁，加上潰瘍性皮炎，最終可能影響小鼠的游泳能力而影響實(shí)驗(yàn)成績。 對輕微的學(xué)習(xí)記憶能力的減

32、退，該迷宮程序可能不敏感。 所占實(shí)驗(yàn)場地過大。 第49頁/共93頁第四十九頁，共93頁。Lashley III水迷宮(mgng)第50頁/共93頁第五十頁，共93頁。Lashley III水迷宮(mgng) 是一種相對復(fù)雜的迷宮。它含有動物必須學(xué)會避免的盲端（culs-de-sac）和動物必須做出正確的左或右拐彎的T選擇。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5天，每天進(jìn)行2次測試（上下午各1次）。每天的2次測試被平均。指標(biāo)包括：學(xué)習(xí)指數(shù)(zhsh)（正確進(jìn)入數(shù)/進(jìn)入總數(shù)）、游向目標(biāo)時的盲端進(jìn)入數(shù)及T選擇錯誤數(shù)、向后進(jìn)入總數(shù)、逃生所用時間等。 第51頁/共93頁第五十一頁，共93頁。八臂放射狀旱迷宮(mgng)八臂放射狀旱

33、迷宮，是八臂放射狀旱迷宮，是OltenOlten和和SamnelsonSamnelson在在19761976年設(shè)計(jì)的，做為一年設(shè)計(jì)的，做為一種評估大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的方法種評估大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的方法(fngf)(fngf)。它可以同時評估實(shí)驗(yàn)動。它可以同時評估實(shí)驗(yàn)動物的工作記憶和參考記憶。物的工作記憶和參考記憶。原理原理 利用食物作為激勵措施而到達(dá)目的利用食物作為激勵措施而到達(dá)目的地，饑餓的動物需要實(shí)行特別的搜地，饑餓的動物需要實(shí)行特別的搜索順序或利用最短的時間或最小的索順序或利用最短的時間或最小的錯誤來尋求獎賞。錯誤來尋求獎賞。 第52頁/共93頁第五十二頁，共93頁。八臂放射狀旱迷宮(mgn

34、g) 裝 置 八臂放射狀旱迷宮是由從中央平臺伸出的8個相等的臂呈放射狀排列組成，8臂中有4臂的末端放有食物，在同一天的整個實(shí)驗(yàn)過程中哪些臂中含有食物保持固定不變，但每天之間均有改變。迷宮周圍有若干(rugn)空間線索。實(shí)驗(yàn)前大鼠需被剝奪食物和水，實(shí)驗(yàn)開始時，大鼠被放在中央平臺處后去尋找食物。在實(shí)驗(yàn)中大鼠需記住哪些臂已被探索過，食物已被攝取，以避免再次進(jìn)入，從而在最短的時間內(nèi)獲得最大量的食物。同時，在每天的實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠還必須放棄當(dāng)天的記憶信息，以準(zhǔn)備適應(yīng)第二天的實(shí)驗(yàn)。 第53頁/共93頁第五十三頁，共93頁。八臂放射狀旱迷宮(mgng) 應(yīng)用 評估動物工作記憶和參考記憶 工作記憶是指利用一個

35、僅僅在短時間內(nèi)的保留信息，或稱為實(shí)驗(yàn)特定信息（trial-specific information）而獲得的記憶，它是對實(shí)驗(yàn)中可變事物的記憶能力。 參考記憶是對持續(xù)(chx)存在的信息，或稱為任務(wù)特定信息（task-specific information）的記憶，它是對實(shí)驗(yàn)中不變事物的記憶能力。第54頁/共93頁第五十四頁，共93頁。八臂放射狀旱迷宮(mgng) 觀察指標(biāo) 時間測定和錯誤積分 存在的問題 優(yōu)點(diǎn)：同時評估實(shí)驗(yàn)動物的工作記憶和參考記憶 不足： 氣味的影響。包括食物的氣味、其他動物的氣味以及動物自身的氣味。 實(shí)驗(yàn)動物被限制食物和水，由此會帶來的影響。 并且不同的食物獎賞也可產(chǎn)生明顯

36、的影響； 另外(ln wi)，動物種屬的不同使其在食物需求上也可導(dǎo)致不同的結(jié)論。第55頁/共93頁第五十五頁，共93頁。穿梭箱實(shí)驗(yàn)(shyn) 試驗(yàn)裝置實(shí)驗(yàn)箱大小為50cm16cm18cm。箱底部格柵為可以通電的不銹鋼棒，箱底中央部有一高1.2cm的擋板，將箱底部分隔成左右兩列。實(shí)驗(yàn)箱頂部有光源，蜂鳴音控制器。 訓(xùn)練時，將大白鼠放入箱內(nèi)任何一側(cè)，20s后開始呈現(xiàn)燈光和（或）蜂鳴音，持續(xù)15s，后10s內(nèi)同時給以電刺激(100V，O.2mA，50Hz，AC)。最初，動物只對電擊有反應(yīng)，即逃至對側(cè)以回避電擊。20s后再次出現(xiàn)條件刺激并繼之在動物所在側(cè)施以電刺激，迫使動物跳至另一側(cè)如此來往穿梭。當(dāng)蜂

37、鳴音或燈光信號呈現(xiàn)時，大白鼠立即逃至對側(cè)安全區(qū)以躲避電擊，即認(rèn)為出現(xiàn)了條件反應(yīng)(或稱主動回避反應(yīng))。每閑天訓(xùn)練一回，每回100次。約訓(xùn)練45回后動物的主動回避反應(yīng)率可達(dá)8090。 此法可同時觀察被動和主動回避性反應(yīng).此外 從動物的反應(yīng)次數(shù)也可以了解動物系處于(chy)興 奮或抑制狀態(tài)。第56頁/共93頁第五十六頁，共93頁。穿梭箱實(shí)驗(yàn)(shyn)自動記錄系統(tǒng)可以輸出以下內(nèi)容：(1)動物序號；(2)遭受刺激次數(shù)；(3) 遭受刺激時間；(4) 主動回避反應(yīng)(fnyng)時間。 以上各值均為在設(shè)定的穿梭次數(shù)內(nèi)反應(yīng)(fnyng)的總和。遭受電激次數(shù)是被動回避的次數(shù)，該值與設(shè)定循環(huán)次數(shù)之差即為主動回避次

38、數(shù)；刺激時間是指動物在被動回避過程受到電刺激的時間和，該值愈小，說明動物被動反應(yīng)(fnyng)愈敏捷，主動回避時間是指動物在接受條件刺激的時間長短，該值越短，說明動物主動回避反應(yīng)(fnyng)越迅速第57頁/共93頁第五十七頁，共93頁。跳臺(tioti)試驗(yàn) 跳臺實(shí)驗(yàn)屬一次性刺激回避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)（ONE TRAIL AVOIDANCE TEST）。 裝置：試驗(yàn)裝置為一長方形反射(fnsh)箱，大小為10cm10cm60cm，用黑色塑板分割成5間。地面鋪以柵欄，間距0.5cm，可以通電，每間角落置一高和直徑均為4.5cm的平臺。第58頁/共93頁第五十八頁，共93頁。跳臺(tioti)試驗(yàn) 原理

39、在一個開闊的空間，動物大部分時間都在邊緣及角落里活動。在一個方形中心設(shè)置一個高的平臺，當(dāng)把動物放在平臺時，它幾乎立即跳下平臺并向四周探索接近邊緣 指標(biāo) 潛伏期：記錄動物從上平臺到第一次下平臺的時間 操作步驟 一個典型的例子包含三個過程：熟悉過程 學(xué)習(xí)過程 記憶(jy)檢測 熟悉過程：將動物放在平臺上，開始計(jì)時，至動物跳下。此時間段為潛伏期。動物探索10s以后，放回籠中 學(xué)習(xí)過程：動物一旦從平臺上跳下后，立即受到電刺激，然后放回籠中 記憶(jy)檢測：學(xué)習(xí)試驗(yàn)24h后，將實(shí)驗(yàn)動物重新放回平臺上，記錄跳下平臺的潛伏期。動物跳下平臺或持續(xù)停留在平臺上標(biāo)志著驗(yàn)的結(jié)束（終止時間為60s）。 將動物放入反

40、應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3min，然后立即通以36V交流電。動物受到電擊，其正常反應(yīng)是跳回平臺以躲避傷害性刺激。多數(shù)動物可能再次或多次跳至柵欄上，受到電擊后又迅速跳回平臺。如此訓(xùn)練5min，并記錄每鼠受到電擊的次數(shù)或叫錯誤次數(shù)（number of errors），以此作為學(xué)習(xí)成績。24h后重做測試，此即叫記憶(jy)保持測試。記錄受電擊死亡動物數(shù)、第一次跳下平臺的潛伏期和3min內(nèi)的錯誤次數(shù)。第59頁/共93頁第五十九頁，共93頁。二、電生理學(xué) 電生理學(xué)的方法包括胞外記錄、胞內(nèi)記錄、腦內(nèi)電刺激(cj)、電壓鉗、膜片鉗、腦電圖等技術(shù)。 第60頁/共93頁第六十頁，共93頁。Event-Related Po

41、tential (事件(shjin)相關(guān)電位，ERP)128 Channel Cap Brief changes in EEG signal Time-aligned with stimulus onset Averaged over 100s of responses Excellent temporal resolution Terrible spatial resolution第61頁/共93頁第六十一頁，共93頁。第62頁/共93頁第六十二頁，共93頁。第63頁/共93頁第六十三頁，共93頁。波形命名與極性按極性和出現(xiàn)順序 P1，N1，P2，N2，P3按極性和平均潛伏期 N200，P3

42、00，N400.正性波（P），負(fù)性波（N），一般下正上負(fù)波形識別(shbi)與測量第64頁/共93頁第六十四頁，共93頁。膜片鉗（patch clamp） 內(nèi)爾(Neher) 薩克曼(Sakmann) （1944-） （1942-） （德國細(xì)胞(xbo)生理學(xué)家） （德國細(xì)胞(xbo)生理學(xué)家） 合作發(fā)明了膜片箝技術(shù)，并應(yīng)用這一技術(shù)首次證實(shí)了細(xì)胞(xbo)膜上存在離子通道。這一成果對于研究細(xì)胞(xbo)功能的調(diào)控至關(guān)重要，可揭示神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及糖尿病等多種疾病的發(fā)病機(jī)理，并提供治療的新途徑。 二人共獲1991年諾貝爾獎。第65頁/共93頁第六十五頁，共93頁。膜片鉗The pa

43、tch clamp consists of an electrode inside a glass pipette. The pipette, which contains a salt solution resembling the fluid normally found within the cell, is lowered to the cell membrane where a tight seal is formed. When a little suction is applied to the pipette, the patch of membrane within the

44、pipette ruptures, permitting access to the whole cell. The electrode, which is connected to specialized circuitry, can then be used to measure the currents passing through the ion channels of the cell. Furthermore, we can use our electrical circuitry to clamp the membrane potential to any voltage th

45、at we desire: very handy when measuring the activity of voltage-dependent channels. 第66頁/共93頁第六十六頁，共93頁。膜片鉗第67頁/共93頁第六十七頁，共93頁。經(jīng)典記錄模式經(jīng)典記錄模式(msh)(msh)： 貼附式（貼附式（Cell-attached Cell-attached 或或 on cell) on cell) 內(nèi)膜向外式內(nèi)膜向外式(Inside-out)(Inside-out) 外膜向外式外膜向外式(Outside-out)(Outside-out) 全細(xì)胞記錄方式全細(xì)胞記錄方式(Whole

46、-cell recording)(Whole-cell recording)第68頁/共93頁第六十八頁，共93頁。 經(jīng)典的生物化學(xué)方法包括： 離心 電泳 層析 質(zhì)譜等 由于生物化學(xué)方法與藥理學(xué)、免疫學(xué)等其他學(xué)科相結(jié)合，又發(fā)展了： 放射(fngsh)免疫(Radioimmunoassay，RIA) 放射(fngsh)受體 免疫印跡等方面第69頁/共93頁第六十九頁，共93頁。離心(lxn)（centrifuge） 離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大(jd)的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細(xì)胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離

47、，而沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度。 第70頁/共93頁第七十頁，共93頁。離心(lxn) 離心機(jī)種類 制備型離心機(jī) 普通：（6000rpm以下(yxi)） 高速冷凍（25000rpm以下(yxi)） 超速（可達(dá)5000080000 rpm ） 分析型離心機(jī)第71頁/共93頁第七十一頁，共93頁。離心(lxn) 制備型離心方法(fngf) 差速沉降離心法 密度梯度區(qū)帶離心法（簡稱區(qū)帶離心法） 第72頁/共93頁第七十二頁，共93頁。電泳(din yn) 電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。 電泳技術(shù)就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子(fnz)帶電性質(zhì)以及分子(fnz)本身大小、形狀等