分子生物學(xué)第8章

1、第八章第八章 印跡雜交技術(shù)印跡雜交技術(shù)分子生物學(xué)常用的分析技術(shù)之一分子生物學(xué)常用的分析技術(shù)之一DNADNA印跡法、印跡法、RNARNA印跡法和蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡法）印跡法和蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡法） 第一節(jié)第一節(jié) 核酸分子雜交核酸分子雜交 核酸雜交技術(shù)是在核酸雜交技術(shù)是在DNADNA變性和復(fù)變性和復(fù)性原理的基礎(chǔ)性原理的基礎(chǔ)上建立起來的一種上建立起來的一種分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù) 一、變性（一、變性（denaturation） 在某些理化因素的作用下，維在某些理化因素的作用下，維系核酸二級結(jié)構(gòu)的氫鍵和堿基系核酸二級結(jié)構(gòu)的氫鍵和堿基堆積力受到破壞，堆積力受到破壞，DNADNA雙螺旋結(jié)雙螺旋

2、結(jié)構(gòu)松散，變成單鏈的過程稱為構(gòu)松散，變成單鏈的過程稱為核酸的變性核酸的變性 核酸雙螺旋區(qū)的核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂氫鍵斷裂，變，變成單鏈，但并不涉及共價鍵的成單鏈，但并不涉及共價鍵的斷裂斷裂DNA解鏈曲線解鏈曲線DNADNA變性的本質(zhì)是氫鍵的斷裂變性的本質(zhì)是氫鍵的斷裂核酸的變性因素核酸的變性因素 變性方法變性方法熱變性、酸堿變性、化學(xué)變性劑（乙醇、尿素和甲酰胺 ） 增色效應(yīng)（增色效應(yīng)（hyperchromichyperchromic effect effect）由于DNA變性而引起的光吸收增加的現(xiàn)象 使雙鏈?zhǔn)闺p鏈DNADNA解鏈度達(dá)到解鏈度達(dá)到50%50%所需的溫度稱為所需的溫度稱為解鏈溫度解鏈

3、溫度 (Tm)(Tm)、變性溫度、變性溫度、熔點熔點 DNADNA的解鏈溫度一般在的解鏈溫度一般在82-9582-95 ，與，與DNADNA的分子大小和堿基組成、溶液的分子大小和堿基組成、溶液的的pHpH值和離子強度（值和離子強度（+ +）等有關(guān)）等有關(guān) 二、復(fù)性二、復(fù)性 DNADNA復(fù)性：緩慢降溫可以使熱變性復(fù)性：緩慢降溫可以使熱變性DNADNA重新形成重新形成互補雙鏈結(jié)構(gòu)互補雙鏈結(jié)構(gòu) DNADNA的最適復(fù)性溫度通常的最適復(fù)性溫度通常比解鏈溫度低比解鏈溫度低20-2520-25 復(fù)性導(dǎo)致復(fù)性導(dǎo)致DNADNA的紫外吸收降低，稱為減色效應(yīng)的紫外吸收降低，稱為減色效應(yīng) 檢測檢測DNADNA紫外吸收

4、的變化可以分析其變性和復(fù)性紫外吸收的變化可以分析其變性和復(fù)性 不是簡單的逆變性過程，受多種因素影響不是簡單的逆變性過程，受多種因素影響:DNADNA濃度越高濃度越高，兩股互補鏈相遇的可能性就越大，因而復(fù)，兩股互補鏈相遇的可能性就越大，因而復(fù)性越快性越快序列簡單的序列簡單的DNA(DNA(例如重復(fù)序列例如重復(fù)序列) )復(fù)性快復(fù)性快，序列復(fù)雜的，序列復(fù)雜的DNA(DNA(例如單一序列例如單一序列) )復(fù)性慢，因而可以通過測定復(fù)性速度分復(fù)性慢，因而可以通過測定復(fù)性速度分析析DNADNA序列的復(fù)雜性序列的復(fù)雜性DNADNA片段越大片段越大，尋找完全互補序列的難度就越大，因而復(fù)，尋找完全互補序列的難度就

5、越大，因而復(fù)性越慢性越慢DNADNA溶液的溶液的離子強度越高離子強度越高，兩股互補鏈重新結(jié)合的速度就，兩股互補鏈重新結(jié)合的速度就越快，因而復(fù)性越快越快，因而復(fù)性越快 DNA-DNA雜交雙鏈分子雜交雙鏈分子三、雜交與核酸分子雜交技術(shù)三、雜交與核酸分子雜交技術(shù) 雜交定義雜交定義不同來源的、序列互補的單鏈RNA、 DNA，或DNA和RNA，根據(jù)堿基互補原則，借助氫鍵連接為雙鏈分子的過程。 核酸雜交類型核酸雜交類型單鏈DNA與單鏈DNA雜交（DNA-DNA）單鏈DNA與單鏈RNA雜交（DNA-RNA）單鏈RNA與單鏈RNA雜交（RNA-RNA）核酸分子雜交技術(shù)核酸分子雜交技術(shù) 定義：將定義：將已知序列

6、的單鏈核酸片段進行標(biāo)記已知序列的單鏈核酸片段進行標(biāo)記后，再后，再與另一種未知序列的待測核酸樣品進行雜交，從中與另一種未知序列的待測核酸樣品進行雜交，從中鑒定互補序列，以分析該樣品中是否存在特定基因鑒定互補序列，以分析該樣品中是否存在特定基因序列、基因序列是否存在變異，或研究目的基因的序列、基因序列是否存在變異，或研究目的基因的表達(dá)情況表達(dá)情況 探針探針(Probe)(Probe)：是帶有標(biāo)記物且序列已知、用于鑒定是帶有標(biāo)記物且序列已知、用于鑒定互補序列的單鏈核酸片段互補序列的單鏈核酸片段根據(jù)雜交體系的不同，核酸分子雜交可以分為：根據(jù)雜交體系的不同，核酸分子雜交可以分為：1 1、液相雜交：、液相

7、雜交：待測核酸和標(biāo)記的探針都待測核酸和標(biāo)記的探針都游離于溶液游離于溶液中，在一定條件中，在一定條件下進行雜交下進行雜交優(yōu)點：速度快、效率高，操作簡便優(yōu)點：速度快、效率高，操作簡便缺點：難以有效避免待測核酸的復(fù)性缺點：難以有效避免待測核酸的復(fù)性 雜交之后也不易將未雜交的多余探針完全除去，誤差較大雜交之后也不易將未雜交的多余探針完全除去，誤差較大2 2、固相雜交：、固相雜交：將將待測核酸先固定在固相支持物上待測核酸先固定在固相支持物上，然后與，然后與溶液中的溶液中的游離探針游離探針進行雜交，形成的雜交體結(jié)合在固相支持物上進行雜交，形成的雜交體結(jié)合在固相支持物上優(yōu)點：既可以避免待測核酸的復(fù)性，又可以

8、通過漂洗除去末雜交優(yōu)點：既可以避免待測核酸的復(fù)性，又可以通過漂洗除去末雜交的多余探針，而且結(jié)合在固相支持物上的雜交體的檢測也很方便的多余探針，而且結(jié)合在固相支持物上的雜交體的檢測也很方便印跡雜交技術(shù)中的核酸分子雜交就是以固相雜交為基礎(chǔ)的印跡雜交技術(shù)中的核酸分子雜交就是以固相雜交為基礎(chǔ)的第二節(jié)第二節(jié) 探針與標(biāo)記探針與標(biāo)記 合適的探針具備以下條件合適的探針具備以下條件: :具有高度特異性具有高度特異性，只與待測核酸雜交。因此，通，只與待測核酸雜交。因此，通常首選常首選編碼序列編碼序列制備探針制備探針為單鏈核酸為單鏈核酸，用雙鏈核酸制備的探針使用前要先，用雙鏈核酸制備的探針使用前要先變性解鏈變性解鏈

9、帶有標(biāo)記物帶有標(biāo)記物，標(biāo)記物靈敏度高而穩(wěn)定，檢測方便，標(biāo)記物靈敏度高而穩(wěn)定，檢測方便 一、探針種類一、探針種類 1 1基因組基因組DNADNA探針（最常用的探針（最常用的DNADNA探針）探針）多為某一基因的全部序列或部分序列多為某一基因的全部序列或部分序列2 2RNARNA探針探針雜交效率高、穩(wěn)定性高、敏感性和均一性強雜交效率高、穩(wěn)定性高、敏感性和均一性強非特異性雜交較少、低本底非特異性雜交較少、低本底 3 3cDNAcDNA探針探針 不含內(nèi)含子等非編碼序列，特異性高，研究基因表達(dá)不含內(nèi)含子等非編碼序列，特異性高，研究基因表達(dá)不易制備不易制備4 4寡核苷酸探針寡核苷酸探針 根據(jù)已知核酸序列人

10、工合成的根據(jù)已知核酸序列人工合成的DNADNA探針探針; ;分析點突變分析點突變5 5鎖式探針鎖式探針 一種特別設(shè)計的一種特別設(shè)計的DNADNA探針，中間為連接序列探針，中間為連接序列6 6實時定量實時定量PCRPCR探針探針 二、探針標(biāo)記物二、探針標(biāo)記物 ( (一一) )放射性同位素標(biāo)記物放射性同位素標(biāo)記物( (3232P P、2 2H H和和3232S)S)極高的靈敏度和特異性極高的靈敏度和特異性放射性污染放射性污染, ,半衰期短半衰期短, ,昂貴昂貴( (二二) )非放射性標(biāo)記物非放射性標(biāo)記物( (生物素、地高辛和熒光素等生物素、地高辛和熒光素等) )實驗周期短實驗周期短; ;穩(wěn)定性好穩(wěn)

11、定性好, ,標(biāo)記探針可以長時間存放備用標(biāo)記探針可以長時間存放備用; ;無放無放射性污染射性污染靈敏度和特異性有時不理想靈敏度和特異性有時不理想三、探針標(biāo)記法三、探針標(biāo)記法1 1、體內(nèi)標(biāo)記：、體內(nèi)標(biāo)記：將放射性化合物加入培養(yǎng)基，由細(xì)胞吸收將放射性化合物加入培養(yǎng)基，由細(xì)胞吸收之后經(jīng)過合成代謝摻入新合成的核酸分子之后經(jīng)過合成代謝摻入新合成的核酸分子2 2、體外標(biāo)記（最常用）、體外標(biāo)記（最常用）：化學(xué)法和酶促法：化學(xué)法和酶促法化學(xué)法：利用標(biāo)記物分子上的活性基團與探針分子上化學(xué)法：利用標(biāo)記物分子上的活性基團與探針分子上的基團進行交聯(lián)，將的基團進行交聯(lián)，將標(biāo)記物直接結(jié)合到探針分子標(biāo)記物直接結(jié)合到探針分子上

12、。上。簡便快速、標(biāo)記均勻簡便快速、標(biāo)記均勻酶促法：酶促法：先用標(biāo)記物標(biāo)記核苷酸，再通過酶促反應(yīng)將先用標(biāo)記物標(biāo)記核苷酸，再通過酶促反應(yīng)將標(biāo)記核苷酸摻入探針分子，或?qū)?biāo)記基團從核苷酸轉(zhuǎn)標(biāo)記核苷酸摻入探針分子，或?qū)?biāo)記基團從核苷酸轉(zhuǎn)移到探針分子移到探針分子 (一一)切口平移標(biāo)記法切口平移標(biāo)記法 (二二)隨機引物標(biāo)記法隨機引物標(biāo)記法 末端標(biāo)記末端標(biāo)記法法( (三三) )聚合酶鏈反應(yīng)標(biāo)記法聚合酶鏈反應(yīng)標(biāo)記法 一種標(biāo)記一種標(biāo)記dNTPdNTP和三種普通和三種普通dNTPdNTP為底物，短鏈探針為底物，短鏈探針( (四四) )末端標(biāo)記法末端標(biāo)記法 T4T4多核苷酸激酶、末端轉(zhuǎn)移酶、多核苷酸激酶、末端轉(zhuǎn)移酶、

13、KlenowKlenow片段和片段和T4 T4 DNADNA聚合酶聚合酶 四、探針純化四、探針純化1 1乙醇沉淀法乙醇沉淀法 DNADNA片段可以被無水乙醇沉淀片段可以被無水乙醇沉淀 操作簡便，首選方法操作簡便，首選方法2 2凝膠過濾法凝膠過濾法 利用凝膠的分子篩特性利用凝膠的分子篩特性 凝膠填料是凝膠填料是SephadexSephadex G-50 G-50和和Bio-Gel P-60Bio-Gel P-60第三節(jié)第三節(jié) 固相支持物與印跡固相支持物與印跡 一、固相支持物：一、固相支持物：硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚偏乙烯二硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚偏乙烯二氟氟(PVDF)(PVDF)膜和活化濾紙膜

14、和活化濾紙1 1硝酸纖維素膜硝酸纖維素膜 結(jié)合量大、本底較低、操作簡便結(jié)合量大、本底較低、操作簡便結(jié)合力不強，堿性、真空烘烤破裂變脆結(jié)合力不強，堿性、真空烘烤破裂變脆2 2尼龍膜尼龍膜 韌性較強，不易破裂韌性較強，不易破裂中性尼龍膜和正電荷修飾尼龍膜中性尼龍膜和正電荷修飾尼龍膜二、印跡方法二、印跡方法 第四節(jié)第四節(jié) 常用核酸印跡雜交技術(shù)常用核酸印跡雜交技術(shù) 常用的核酸分子雜交技術(shù)常用的核酸分子雜交技術(shù)多為固相雜交多為固相雜交 根據(jù)操作方法的不同分為根據(jù)操作方法的不同分為 印跡雜交：印跡雜交：將凝膠電泳的高分辨率與核酸分子雜交的將凝膠電泳的高分辨率與核酸分子雜交的高靈敏度相結(jié)合，包括高靈敏度相結(jié)

15、合，包括DNADNA印跡法和印跡法和RNARNA印跡法等印跡法等 原位雜交：原位雜交：包括組織原位雜交法及菌落雜交法、噬菌包括組織原位雜交法及菌落雜交法、噬菌斑雜交法等斑雜交法等 核酸分子雜交（固相雜交）操作程序核酸分子雜交（固相雜交）操作程序制備待測核酸樣品制備待測核酸樣品分離、變性、轉(zhuǎn)移、固化分離、變性、轉(zhuǎn)移、固化DNA片段片段雜交雜交加入標(biāo)記核酸探針加入標(biāo)記核酸探針檢測雜交信號檢測雜交信號標(biāo)記核酸探針標(biāo)記核酸探針預(yù)雜交預(yù)雜交制備核酸探針制備核酸探針漂洗去除未參與雜交的標(biāo)記探針漂洗去除未參與雜交的標(biāo)記探針一、一、DNA印跡法印跡法 1.1.樣品制備；樣品制備；2.2.電泳分離；電泳分離；

16、3.3.變性；變性； 4 4印跡；印跡； 5 5固定；固定； 6 6預(yù)雜交；預(yù)雜交；7.7.雜交；雜交；8 8洗膜；洗膜；9 9分析分析 放射自顯影照片放射自顯影照片二、二、RNA印跡法印跡法 RNARNA印跡法分析的印跡法分析的待測核酸是待測核酸是RNARNA與與DNADNA印跡法基本一致印跡法基本一致，所不同的是，所不同的是: : 為了保持為了保持RNARNA呈單鏈狀態(tài)進行電泳，以使呈單鏈狀態(tài)進行電泳，以使RNARNA按分子大小分離，需要按分子大小分離，需要先用變性劑將先用變性劑將RNARNA樣品完全變性樣品完全變性，再電泳分離，再電泳分離 RNARNA樣品只能用樣品只能用甲醛、乙二醛、二

17、甲基亞砜甲醛、乙二醛、二甲基亞砜 (DMSO)(DMSO)等變性等變性，不能不能用堿變性用堿變性，因為堿會導(dǎo)致，因為堿會導(dǎo)致RNARNA降解。降解。RNARNA印跡法可以用于定性或定量分析組織細(xì)胞內(nèi)的總印跡法可以用于定性或定量分析組織細(xì)胞內(nèi)的總RNARNA或某一特定或某一特定RNARNA，特別是分析，特別是分析mRNAmRNA的大小和含量，從而研究的大小和含量，從而研究基因表達(dá)基因表達(dá)。避免避免RNaseRNase污染污染，包括抑制內(nèi)源性，包括抑制內(nèi)源性RNaseRNase的活性的活性三、斑點雜交法和狹縫雜交法三、斑點雜交法和狹縫雜交法將將粗制或純化的粗制或純化的DNADNA或或RNARNA樣

18、品變性之后直接點于固樣品變性之后直接點于固相膜表面相膜表面，經(jīng)過固定、預(yù)雜交之后與過量探針進行，經(jīng)過固定、預(yù)雜交之后與過量探針進行雜交分析雜交分析印跡印跡: :圓斑圓斑(dot),(dot),短線短線(slot)(slot)用于檢測用于檢測DNADNA樣品的樣品的同源性、細(xì)胞內(nèi)特定基因的拷同源性、細(xì)胞內(nèi)特定基因的拷貝數(shù)和基因表達(dá)貝數(shù)和基因表達(dá)情況情況優(yōu)點優(yōu)點: :用樣量少，操作簡便用樣量少，操作簡便，不電泳和轉(zhuǎn)移，在同，不電泳和轉(zhuǎn)移，在同一張固相膜上可以分析多個樣品一張固相膜上可以分析多個樣品缺點缺點: :特異性不高特異性不高, ,不能分析樣品的不能分析樣品的分子量分子量 斑點雜交和狹縫雜交斑

19、點雜交和狹縫雜交 制備樣品點樣固定（可用斑點雜交儀或直接點樣） 優(yōu)點：優(yōu)點：簡便、快速、靈敏、樣本用量少 缺點：缺點：特異性不高，有一定比例的假陽性NCF濾 紙點 樣 板支 撐 板至 真 空 泵廢 液 儲 槽96孔12 8四、組織原位雜交四、組織原位雜交(in situ hybridization)把把組織切片組織切片進行適當(dāng)處理，增加細(xì)胞膜的通透性，然后進行適當(dāng)處理，增加細(xì)胞膜的通透性，然后置于含探針的雜交液中，使探針進入細(xì)胞內(nèi)，與置于含探針的雜交液中，使探針進入細(xì)胞內(nèi)，與DNADNA或或RNARNA雜交雜交以以cDNAcDNA為探針檢測與其互補的為探針檢測與其互補的mRNAmRNA在細(xì)菌或

20、其他真核細(xì)在細(xì)菌或其他真核細(xì)胞中的位置，稱為胞中的位置，稱為RNARNA原位雜交原位雜交，是分析基因表達(dá)的常用，是分析基因表達(dá)的常用方法方法不需提取核酸，保持組織和細(xì)胞的形態(tài)，分析待測核酸不需提取核酸，保持組織和細(xì)胞的形態(tài)，分析待測核酸的組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞甚至染色體的組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞甚至染色體定位定位分析特定基因表達(dá)情況、病原體的存在部位和方式分析特定基因表達(dá)情況、病原體的存在部位和方式熒光原位雜交熒光原位雜交 (FISH)(FISH)是用熒光素標(biāo)記探針進行的原位雜是用熒光素標(biāo)記探針進行的原位雜交交靈敏、穩(wěn)定、安全、直觀靈敏、穩(wěn)定、安全、直觀多色熒光原位雜交可以多色熒光原位雜交可以同時分析多

21、種靶序列同時分析多種靶序列 熒光標(biāo)記探針檢測精子熒光標(biāo)記探針檢測精子五、菌落雜交和噬菌斑雜交五、菌落雜交和噬菌斑雜交 六、等位基因特異性寡核苷酸雜交六、等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASOH) ASOHASOH：最早檢測已知：最早檢測已知點突變點突變，目前廣泛采用的，目前廣泛采用的基因診斷方法基因診斷方法關(guān)鍵：設(shè)計一對關(guān)鍵：設(shè)計一對ASOASO，長度，長度15-20nt15-20nt，只有一個堿基不同，對應(yīng)突變位點（，只有一個堿基不同，對應(yīng)突變位點（正正常探針，突變探針常探針，突變探針）診斷遺傳病，例如診斷苯丙酮酸尿癥診斷遺傳病，例如診斷苯丙酮酸尿癥(PKU) (PKU) ，根據(jù)某個突變位點，根

22、據(jù)某個突變位點 ( (例如例如Arg243Gln)Arg243Gln)設(shè)計一對探針設(shè)計一對探針: :用兩種探針分別和待測用兩種探針分別和待測DNADNA雜交，雜交，顯性純合子只與正常探針雜交顯性純合子只與正常探針雜交，雜雜合子與正常和突變探針都雜交，隱性純合子只與突變探針雜交合子與正常和突變探針都雜交，隱性純合子只與突變探針雜交，因此，因此根據(jù)雜交結(jié)果可以判斷待測個體的基因型根據(jù)雜交結(jié)果可以判斷待測個體的基因型苯丙酮酸尿癥患者基因型是隱性純合子苯丙酮酸尿癥患者基因型是隱性純合子第五節(jié)第五節(jié) 影響雜交的因素影響雜交的因素 核酸分子雜交的效果取決于雜交的核酸分子雜交的效果取決于雜交的特異性特異性和

23、雜交的和雜交的效率效率1 1核酸分子大（核酸分子大（）小和濃度（正相關(guān)）小和濃度（正相關(guān)） 發(fā)生碰撞才可能雜發(fā)生碰撞才可能雜交交2 2探針種類和濃度探針種類和濃度：單鏈探針雜交效率會隨著濃度的增加而提：單鏈探針雜交效率會隨著濃度的增加而提高，雙鏈探針與此相反高，雙鏈探針與此相反3 3雜交溫度雜交溫度：最適雜交溫度：最適雜交溫度( (比解鏈溫度低比解鏈溫度低20-2520-25時時) )；特異性；特異性4 4離子強度和離子強度和甲酰胺濃度甲酰胺濃度：最適雜交溫度最適雜交溫度5.5.雜交時間雜交時間：控制在：控制在2020小時左右小時左右6 6雜交促進劑雜交促進劑: :250nt250nt探針雜交

24、用惰性多聚體探針雜交用惰性多聚體( (硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖/PEG) /PEG) 7.7.非特異性雜交非特異性雜交：預(yù)雜交，即用封閉物（變性的非特異性：預(yù)雜交，即用封閉物（變性的非特異性DNA DNA 、高分子化合物）封閉非特異性雜交位點高分子化合物）封閉非特異性雜交位點第六節(jié)第六節(jié) 蛋白質(zhì)印跡法蛋白質(zhì)印跡法 蛋白質(zhì)印跡法可以用于蛋白質(zhì)印跡法可以用于定性和半定定性和半定量分析量分析混合物中的蛋白質(zhì)混合物中的蛋白質(zhì) 綜合了綜合了聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率高高和固相和固相免疫分析特異性高、靈敏免疫分析特異性高、靈敏度高度高等優(yōu)點等優(yōu)點一、基本內(nèi)容一、基本內(nèi)容 二、注意事項二、

25、注意事項1 1選用合適的選用合適的聚丙烯酰胺凝膠濃度聚丙烯酰胺凝膠濃度2 2印跡時，應(yīng)選用印跡時，應(yīng)選用小孔徑的固相膜小孔徑的固相膜，以免小分子量蛋，以免小分子量蛋白質(zhì)透過固相膜丟失白質(zhì)透過固相膜丟失3 3蛋白質(zhì)印跡法檢測信號的強弱受多種因素的影響，蛋白質(zhì)印跡法檢測信號的強弱受多種因素的影響，所以一般只用于所以一般只用于半定量分析半定量分析即測定目的蛋白的相對含量，確定該目的蛋白是即測定目的蛋白的相對含量，確定該目的蛋白是否存在，比較其在不同細(xì)胞內(nèi)的含量否存在，比較其在不同細(xì)胞內(nèi)的含量不同目的蛋白用不同抗體檢測時，分析結(jié)果沒有不同目的蛋白用不同抗體檢測時，分析結(jié)果沒有可比性可比性 三種印跡技術(shù)

26、的比較三種印跡技術(shù)的比較第七節(jié)第七節(jié) 生物芯片生物芯片 定義：定義：也稱為也稱為生物微陣列生物微陣列，是指通過，是指通過微電子、微加工技術(shù)微電子、微加工技術(shù)，用，用生物大生物大分子分子 ( (例如核酸、蛋白質(zhì)例如核酸、蛋白質(zhì)) )或或細(xì)胞細(xì)胞等在數(shù)平方厘米大小的等在數(shù)平方厘米大小的固相介質(zhì)表固相介質(zhì)表面面構(gòu)建的構(gòu)建的微型分析系統(tǒng)微型分析系統(tǒng)，用以對生物組分進行，用以對生物組分進行快速、高效、靈敏快速、高效、靈敏的分的分析與處理析與處理種類：種類：基因基因芯片、芯片、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)芯片、芯片、組織組織芯片、芯片、微流控微流控芯片和芯片芯片和芯片實驗室實驗室 固相支持物（基片）：硅芯片、玻璃片、聚丙

27、烯膜和尼龍膜等固相支持物（基片）：硅芯片、玻璃片、聚丙烯膜和尼龍膜等特點：特點：高通量、集成化、標(biāo)準(zhǔn)化和微型化高通量、集成化、標(biāo)準(zhǔn)化和微型化 一、基因芯片（一、基因芯片（gene chip） DNA芯片芯片 、DNA微陣列微陣列 、寡核苷酸微陣列、寡核苷酸微陣列定義定義: : 是在是在固相支持物上原位合成固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接將大量寡核苷酸或直接將大量DNADNA探針以探針以點涂點涂的方式有序地固化于支持物表面，然后與的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)標(biāo)記的樣品記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析，即可得出樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析，即可得出樣品的信號（即基因序列或表

28、達(dá)的信息）的信號（即基因序列或表達(dá)的信息）基本原理依然是基于基本原理依然是基于核酸分子雜交核酸分子雜交，屬于固相雜交，屬于固相雜交不同：不同：探針固相化、集成化并且不標(biāo)記探針固相化、集成化并且不標(biāo)記; ;而而待測樣品游離于待測樣品游離于液相并且被標(biāo)記液相并且被標(biāo)記 (一一)基本原理和基本操作基本原理和基本操作 基因芯片技術(shù)是以基因芯片技術(shù)是以斑點雜交為基礎(chǔ)斑點雜交為基礎(chǔ)建立的建立的高通量檢測高通量檢測DNADNA的技術(shù)的技術(shù) 基本操作分為四個步驟基本操作分為四個步驟 芯片制作芯片制作 樣品制備樣品制備 分子雜交分子雜交 檢測分析檢測分析1芯片制作芯片制作一個復(fù)雜而精密的過程，需要專門的儀器一個

29、復(fù)雜而精密的過程，需要專門的儀器(1)(1)原位合成法原位合成法: :光引導(dǎo)原位合成法光引導(dǎo)原位合成法分子印章法分子印章法(2)(2)微量點樣法微量點樣法: :噴墨打?。ㄎ⒖祝﹪娔蛴。ㄎ⒖祝┙佑|打?。c樣針）接觸打印（點樣針）2 2樣品制備樣品制備 待測樣品（待測樣品（Cy3Cy3）；對照樣品（）；對照樣品（Cy5Cy5）3.3.分子雜交分子雜交 探針含量遠(yuǎn)多于待測探針含量遠(yuǎn)多于待測DNADNA含量（雜交信號強弱與待測含量（雜交信號強弱與待測DNADNA含量成正比）含量成正比） 優(yōu)化雜交條件：離子強度、溫度、時間優(yōu)化雜交條件：離子強度、溫度、時間4 4、檢測分析、檢測分析 以掃描儀對熒光信號

30、進行檢測和分析，通過陳列上以掃描儀對熒光信號進行檢測和分析，通過陳列上DNADNA探針的原始序列將靶探針的原始序列將靶DNADNA的信息反映出來的信息反映出來DNADNA芯片技術(shù)流程芯片技術(shù)流程大規(guī)?；蛐酒膽?yīng)用大規(guī)模基因芯片的應(yīng)用 (二二)應(yīng)用應(yīng)用 基因芯片技術(shù)的主要用途是進行基因芯片技術(shù)的主要用途是進行DNADNA測序測序和研究和研究基因表達(dá)基因表達(dá) 在這兩種用途的基礎(chǔ)上，基因芯片技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于基因組在這兩種用途的基礎(chǔ)上，基因芯片技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于基因組研究研究 ( (包括雜交測序、基因組文庫作圖、基因表達(dá)譜測定、包括雜交測序、基因組文庫作圖、基因表達(dá)譜測定、多態(tài)性分析和突變檢測等多態(tài)性分析和突變檢測等) )、基因診斷基因診斷、藥