實驗2-1 動物肝臟DNA提取

1、動物肝臟中動物肝臟中DNA的制備的制備學(xué)時：學(xué)時：4 41 1、掌握動物組織總、掌握動物組織總DNADNA的特性的特性2 2、掌握動物組織總、掌握動物組織總DNADNA提取方法及其原理。提取方法及其原理。要獲得純的要獲得純的DNADNA樣品，必須考慮以下幾點：樣品，必須考慮以下幾點：如何選材，如何破碎組織細胞？如何選材，如何破碎組織細胞？如何除去蛋白質(zhì)？如何除去蛋白質(zhì)？( (在真核細胞內(nèi)，在真核細胞內(nèi)，DNADNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白的形式存在。因此，分離白的形式存在。因此，分離DNADNA時必須使其與蛋白質(zhì)解離，并除去蛋時必須使其與蛋白質(zhì)解離，并除去蛋白質(zhì)。白質(zhì)。) )設(shè)法

2、除去設(shè)法除去RNARNA的污染；的污染；防止防止DNADNA酶的降解作用；酶的降解作用； （一）動物肝臟（一）動物肝臟DNA制備原理制備原理 要提取動物組織要提取動物組織DNADNA，一般選擇，一般選擇細胞膜較脆弱，容易破碎的動物臟細胞膜較脆弱，容易破碎的動物臟器，如胸腺、肝臟、脾臟、胰臟等。器，如胸腺、肝臟、脾臟、胰臟等。研磨：研磨：將剪碎的動物組織置于研缽或勻漿器中，加入將剪碎的動物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿，破碎細胞。這種方法溫和，少量石英砂研磨或勻漿，破碎細胞。這種方法溫和，適合實驗室使用。適合實驗室使用。組織搗碎器：組織搗碎器：較劇烈的破碎細胞的方法，為了防止發(fā)

3、較劇烈的破碎細胞的方法，為了防止發(fā)熱和升溫過高，通常是轉(zhuǎn)熱和升溫過高，通常是轉(zhuǎn)1010秒秒2020秒，停秒，停1010秒秒2020秒，秒，可反復(fù)多次?？煞磸?fù)多次。壓榨法：壓榨法：在在1000100010105 5PaPa2000200010105 5Pa Pa 的高壓下使幾的高壓下使幾十毫升的細胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓，細十毫升的細胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓，細胞將徹底破碎。溫和的、徹底破碎細胞的方法，但儀胞將徹底破碎。溫和的、徹底破碎細胞的方法，但儀器費用較高。器費用較高。細胞破碎方法細胞破碎方法機械物理法：反復(fù)凍融法：反復(fù)凍融法：將待破碎的細胞冷至將待破碎的細胞冷至1515到

4、到2020，然后放于室溫，然后放于室溫( (或或40)40)迅速融化，由于迅速融化，由于細胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引細胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細胞溶脹破碎。起細胞溶脹破碎。超聲波處理法：超聲波處理法：借助超聲波的振動力破碎細胞借助超聲波的振動力破碎細胞壁和細胞器。使用時注意降溫，防止過熱。壁和細胞器。使用時注意降溫，防止過熱。冷熱交替法：冷熱交替法：在在9090左右維持數(shù)分鐘，立即放左右維持數(shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細胞可以被破碎。細胞可以被破碎。細胞破碎方法細胞破碎方法機械物理法有機溶劑處理法：有

5、機溶劑處理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶利用氯仿、甲苯等脂溶性溶劑或劑或SDSSDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細胞，可將細胞膜溶解，從而使細胞破裂，理細胞，可將細胞膜溶解，從而使細胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。溶脹法：溶脹法：細胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液細胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，將細胞膜脹破釋放出溶劑分子大量進入細胞，將細胞膜脹破釋放出細胞內(nèi)含物。細胞內(nèi)含物。 脫氧核糖核蛋白脫氧核糖核蛋白在濃在濃NaClNaCl

6、（1-2mol1-2molL L）溶液中）溶液中溶解度很大，但在溶解度很大，但在0.14mol0.14molL NaClL NaCl溶液中溶解度很低，溶液中溶解度很低，而而核糖核蛋白核糖核蛋白則溶于則溶于0.14mol0.14molL NaClL NaCl溶液中，利用溶液中，利用這一性質(zhì)可將脫氧核糖核蛋白與絕大部分核糖核蛋白分這一性質(zhì)可將脫氧核糖核蛋白與絕大部分核糖核蛋白分離開來。離開來。用用氯仿一異戊醇氯仿一異戊醇混合液振蕩核蛋白溶液，使蛋白質(zhì)變性，混合液振蕩核蛋白溶液，使蛋白質(zhì)變性，然后離心除去變性蛋白質(zhì)，此時蛋白質(zhì)凝膠停留在水相然后離心除去變性蛋白質(zhì)，此時蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間

7、，而及氯仿相中間，而DNADNA溶于上層水相。用兩倍體積溶于上層水相。用兩倍體積 9595乙醇溶液可將乙醇溶液可將DNADNA鈉鹽沉淀出來。鈉鹽沉淀出來。用用十二烷基硫酸鈉（十二烷基硫酸鈉（SDSSDS）等去污劑使蛋白質(zhì)變性，可等去污劑使蛋白質(zhì)變性，可以直接從生物材料中提取以直接從生物材料中提取DNADNA。為了防止為了防止DNADNA酶的降解，提取時可加入適酶的降解，提取時可加入適量量EDTAEDTA（乙二胺四乙酸）、檸檬酸，以降（乙二胺四乙酸）、檸檬酸，以降低低DNADNA酶的活性。酶的活性。加入加入RNARNA酶降解剩余的酶降解剩余的RNARNA，獲得純的，獲得純的DNADNA。保存：將

8、保存：將DNADNA于濾紙上干燥，溶于于濾紙上干燥，溶于1mlTE1mlTE中中低溫保存。低溫保存。（二）瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的原理：（二）瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的原理：l瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠電泳是用電泳是用瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)的一種作為支持介質(zhì)的一種電泳分離方法，是一種簡便、快速分離鑒定核酸的方電泳分離方法，是一種簡便、快速分離鑒定核酸的方法，已成為分子生物學(xué)及基因工程研究中常用實驗方法，已成為分子生物學(xué)及基因工程研究中常用實驗方法之一。法之一。l瓊脂糖瓊脂糖英文名英文名agarose，是從是從瓊脂瓊脂中提取出來的，由中提取出來的，由半乳糖半乳糖和和3.6-3.6-脫水脫水-

9、-L- L- 半乳糖半乳糖相互結(jié)合的相互結(jié)合的鏈狀多糖鏈狀多糖。瓊脂糖和瓊脂瓊脂糖和瓊脂都可在不同濃度的水溶液下可形成都可在不同濃度的水溶液下可形成多孔多孔的凝膠的凝膠，電泳中具有，電泳中具有分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)。但。但瓊脂糖含硫酸根瓊脂糖含硫酸根比瓊脂少比瓊脂少，電滲作用電滲作用降低，因而分離效果明顯提高。降低，因而分離效果明顯提高。lDNADNA分子分子在在pH高于其等電點的溶液中帶負電荷，在電場高于其等電點的溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動（中向正極移動（電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)） 。lDNA分子泳動速率的大小除與分子泳動速率的大小除與DNA分子的帶電量有關(guān)分子的帶電量有關(guān)外，還與外，還與DN

10、A分子的大小和空間構(gòu)象有關(guān)（瓊脂糖凝膠分子的大小和空間構(gòu)象有關(guān)（瓊脂糖凝膠的的分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)）。）。l電泳時，用電泳時，用溴酚藍溴酚藍做前沿指示劑，用做前沿指示劑，用溴化乙啶溴化乙啶 （ethidium bromide，EB） 指示指示DNA樣品在凝膠中的樣品在凝膠中的確切位置。確切位置。l溴化乙啶溴化乙啶是一種熒光染料，可插入是一種熒光染料，可插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩個堿基對之間，與兩個堿基對之間，與DNA分子形成絡(luò)合物，在紫外光的分子形成絡(luò)合物，在紫外光的激發(fā)下發(fā)出橙黃色的熒光。激發(fā)下發(fā)出橙黃色的熒光。l熒光熒光來自兩方面，一是核酸吸收來自兩方面，一是核酸吸收260260

11、nmnm的紫外光，并的紫外光，并將能量傳給將能量傳給EB；二是二是EB本身吸收波長為本身吸收波長為302302nmnm和和360360nmnm的紫外光。這兩方面的能量最終激發(fā)的紫外光。這兩方面的能量最終激發(fā)EB發(fā)出發(fā)出波長為波長為590590nmnm的紅橙色熒光。的紅橙色熒光。l溴化乙啶可加入凝膠中，也可以在電泳后，將凝膠溴化乙啶可加入凝膠中，也可以在電泳后，將凝膠放在含放在含EB的溶液中浸泡的溶液中浸泡.l溴化乙啶檢測溴化乙啶檢測DNA的靈敏度很高，可檢出的靈敏度很高，可檢出10ng甚至甚至更少的更少的DNA。瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的影響因素瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的影響因素（1）核酸大小與瓊

12、脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系核酸大小與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系 凝膠中，凝膠中，DNA片段遷移率與片段遷移率與DNA分子大小分子大小(堿基對的對數(shù)堿基對的對數(shù))成反比成反比( 20kb) ，因此通過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離因此通過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。時行比較，便可測出未知片段的大小。（2）核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系不同構(gòu)型不同構(gòu)型DNA的移動速度次序為：閉環(huán)的移動速度次序為：閉環(huán)DNA直線直線DNA開環(huán)的雙鏈環(huán)開環(huán)的雙鏈環(huán)狀狀DNA.（3）不同大小的不同大小的DNA需要用不同濃

13、度的瓊脂糖凝膠進行電泳需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。分離。瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度/%/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0線狀線狀DNADNA大小大小/ /kbkb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-0.2 2-0.1注：注：DNADNA片段在片段在5-5005-500bpbp之間時，一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳（之間時，一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGEPAGE）進進行電泳分離。行電泳分離。瓊脂糖凝膠電泳具有以下優(yōu)點：瓊脂糖凝膠電泳具有以下優(yōu)點：（1 1）操作簡單、制備容易快速、凝膠機械性能好、電泳速度）操作簡單、制備容易快速、凝膠機械性

14、能好、電泳速度快、分離快、分離DNADNA片段范圍廣、樣品不需事先處理就可以進行電泳。片段范圍廣、樣品不需事先處理就可以進行電泳。（2 2）凝膠結(jié)構(gòu)均勻，對樣品吸附小，電泳圖譜清晰，分辨率）凝膠結(jié)構(gòu)均勻，對樣品吸附小，電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。高，重復(fù)性好。（3 3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光檢測及定量測定。光檢測及定量測定。（4 4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。成干膜可長期保存。因此，因此，瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠電泳已成為分子

15、生物學(xué)及基因工程研電泳已成為分子生物學(xué)及基因工程研究中常用實驗方法之一，究中常用實驗方法之一， DNADNA樣本的分離、純化、鑒定以及樣本的分離、純化、鑒定以及相對分子質(zhì)量測定常用瓊脂糖凝膠電泳。相對分子質(zhì)量測定常用瓊脂糖凝膠電泳。 熒光染料熒光染料EB染色染色后，在紫外燈后，在紫外燈(305nm)下觀察下觀察到的電泳結(jié)果：到的電泳結(jié)果： * * 熒光染料熒光染料EBEB染色的原理和優(yōu)點是什么？染色的原理和優(yōu)點是什么？ 1 1、原理：、原理： EBEB：即即3,8-3,8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲錠溴鹽苯基菲錠溴鹽( (Ethidium Bromide)Ethidium

16、Bromide)。 EBEB是一種扁平分子，它可以嵌是一種扁平分子，它可以嵌入核酸的堿基之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅橙色熒入核酸的堿基之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅橙色熒光。光。 激發(fā)的熒光的能量來源于兩個方面：一是核酸吸激發(fā)的熒光的能量來源于兩個方面：一是核酸吸收收2 260nm60nm的紫外線后將能量傳遞給的紫外線后將能量傳遞給EBEB，二是二是EBEB本身吸收本身吸收302302nmnm和和360360nmnm的紫外線的能量。這兩方面的能量最終的紫外線的能量。這兩方面的能量最終激發(fā)激發(fā)EBEB發(fā)射波長為發(fā)射波長為590590nmnm的可見光（紅橙區(qū)）。的可見光（紅橙區(qū)）。 2 2、優(yōu)點：、

17、優(yōu)點：（1 1）染色比較簡便、快捷，一般在）染色比較簡便、快捷，一般在10101515minmin就可反應(yīng)。就可反應(yīng)。（2 2）EBEB對核酸分子無破壞作用，這是其它染料所不能做對核酸分子無破壞作用，這是其它染料所不能做 到的。到的。（3 3）EBEB靈敏度高，可檢測出靈敏度高，可檢測出1010ngng或更少的或更少的DNADNA含量。含量。（4 4）既可用于）既可用于DNADNA也可用于也可用于RNARNA的檢測。的檢測。（5 5）EBEB可加到樣品中，也可加到凝膠中，可隨時用紫外可加到樣品中，也可加到凝膠中，可隨時用紫外 燈檢測電泳的進程和效果。燈檢測電泳的進程和效果。（6 6）EB-DN

18、AEB-DNA復(fù)合物中的復(fù)合物中的EBEB發(fā)出的熒光比游離的發(fā)出的熒光比游離的EBEB強強1010倍，倍， 因此不需洗凈凝膠中游離的因此不需洗凈凝膠中游離的EBEB也可檢測出也可檢測出DNADNA的條帶。的條帶。3 3、缺點：、缺點： 溴化乙啶是一種強的致突變劑，在操作和配制試劑溴化乙啶是一種強的致突變劑，在操作和配制試劑時應(yīng)戴手套。含溴化乙啶的溶液不能直接倒入下水道，時應(yīng)戴手套。含溴化乙啶的溶液不能直接倒入下水道，應(yīng)進行處理。應(yīng)進行處理。（1 1）每）每100100mlml溶液中加入溶液中加入100100mgmg粉狀活性炭；粉狀活性炭；（2 2）室溫下放置）室溫下放置1 1小時，不時的搖動；

19、小時，不時的搖動；（3 3）用新華一號濾紙過濾，棄濾液；）用新華一號濾紙過濾，棄濾液；（4 4）用塑料袋封裝濾紙和活性炭，作為有害廢物處理。）用塑料袋封裝濾紙和活性炭，作為有害廢物處理。* *溴化乙啶在溴化乙啶在260260分解，在標準條件下進行焚化后不會有分解，在標準條件下進行焚化后不會有危險性。危險性。(一一)材料：動物肝臟材料：動物肝臟 (二二)試劑：試劑： （1）0.14molLNaCl0.15molL EDTA-Na溶液：溶液： （2）20SDS溶液：溶液： （3）氯仿一異戊醇氯仿一異戊醇(24:1)混合液：混合液： （4）95乙醇溶液。乙醇溶液。 （5）80乙醇溶液乙醇溶液。 （6

20、） pH8.0TE緩沖液：緩沖液：10 mmolLTrisHCI，lmmolL EDTANa，其中含其中含RNA酶酶20ugmL。（7）電泳緩沖液：電泳緩沖液：Tris-硼酸硼酸EDTA（50TBE）pH8.0。（8）加樣緩沖液：加樣緩沖液：0.25%溴酚藍（溴酚藍（BPB）40%蔗糖。蔗糖。（9）溴化乙啶（溴化乙啶（EB）溶液：溶液：10g/ml。（10）瓊脂糖凝膠：濃度為瓊脂糖凝膠：濃度為0.7%。 (三三)儀器儀器（1）穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 （2）可調(diào)微量移液器可調(diào)微量移液器 （3）水平電泳槽水平電泳槽 （4）暗箱紫外透射儀等。暗箱紫外透射儀等。自動取液器的構(gòu)造 自動取液器的使用

21、 吸入液體吸入液體 排出液體排出液體使用注意事項：不超量程使用；不倒置；使用完畢調(diào)至最大刻度上。使用注意事項：不超量程使用；不倒置；使用完畢調(diào)至最大刻度上。1 1取新鮮動物肝，稱取取新鮮動物肝，稱取1g1g，切成小塊，加切成小塊，加入入2ml 0.14mol2ml 0.14molL NaClL NaCl0.15mol0.15molL EDTAL EDTA溶溶液，于研缽中研磨至勻漿，再加液，于研缽中研磨至勻漿，再加2ml2ml清洗轉(zhuǎn)入清洗轉(zhuǎn)入離心管中離心管中，以以40004000r rminmin的轉(zhuǎn)速離心的轉(zhuǎn)速離心 10 10minmin。2 2在上述沉淀物中加入在上述沉淀物中加入2mL2mL

22、 0.14 0.14molmolL NaClL NaCl0.15mol0.15molL EDTAL EDTA溶液，然后在溶液，然后在6060下，滴加下，滴加 2020SDSSDS溶液溶液3 35 5滴滴，邊加邊搖動，再搖動邊加邊搖動，再搖動 10 10minmin，使核酸與蛋白質(zhì)分離。使核酸與蛋白質(zhì)分離。3. 3. 加固體氯化鈉加固體氯化鈉0.0.2g2g混勻，使其最終濃度達到混勻，使其最終濃度達到l.4moll.4molL L，水浴水浴3030minmin。 4 4加等體積的氯仿一異戊醇，加等體積的氯仿一異戊醇，混勻，搖動混勻，搖動5 5minmin，以，以40004000r rminmin

23、的的轉(zhuǎn)速離心轉(zhuǎn)速離心1010minmin。離心管內(nèi)的物質(zhì)離心管內(nèi)的物質(zhì)分為三層，上層為含分為三層，上層為含DNADNA的水相層，的水相層，下層為氯仿一異成醇混合物，中間下層為氯仿一異成醇混合物，中間層為變性蛋白凝膠。層為變性蛋白凝膠。5 5吸出上清液，加入吸出上清液，加入2 2倍體積倍體積9595乙醇溶液（預(yù)乙醇溶液（預(yù)冷），產(chǎn)生沉淀。冷），產(chǎn)生沉淀。6.6.再以再以40004000r rminmin的轉(zhuǎn)速離心溶液的轉(zhuǎn)速離心溶液1010minmin，棄去棄去上清液上清液 ( (沉淀用沉淀用8080乙醇溶液離心洗滌乙醇溶液離心洗滌) )。7 7將沉淀置于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然將沉淀置于吸水

24、紙上，除盡乙醇，室溫自然干燥后，加入干燥后，加入200200ul ul 電極緩沖液電極緩沖液，使使DNADNA充分溶解，充分溶解，待用。待用。 8.8.凝膠板的制備：凝膠板的制備：（1 1）取瓊脂糖）取瓊脂糖0.7 0.7 g g，加加1 1TBETBE緩沖溶液緩沖溶液100100mlml，于沸水浴中于沸水浴中至熔化，制成至熔化，制成0.7%0.7%的瓊脂糖膠液。的瓊脂糖膠液。（2 2）膠床兩頭貼上防水膠帶，形成）膠床兩頭貼上防水膠帶，形成8 8mmmm高的擋墻，壓緊膠帶，高的擋墻，壓緊膠帶，置水平臺面上。置水平臺面上。（3 3）插入梳子，梳齒下端離板底插入梳子，梳齒下端離板底0.50.51 1mmmm。（4 4）在膠床上滴加在膠床上滴加2 23 3滴滴 0.5 0.5g/mLg/mL的的EBEB溶液。溶液。（5 5）將將6060凝膠不間斷倒入膠床，高凝膠不間斷倒入膠床，高3 34 4mmmm，避免氣泡，搖避免氣泡，搖勻，室溫下凝固。勻，室溫下凝固。（6 6）完全凝固后，撕掉膠帶，置于電泳槽中，加入電泳緩沖完全凝固后，撕掉膠帶，置于電泳槽中，加入電泳緩沖液，高于膠面液，高于膠面1 12 2mmmm，從一頭輕輕斜