植物組織培養(yǎng)技術(shù)

1、1 1 實驗室設(shè)置及儀器設(shè)備實驗室設(shè)置及儀器設(shè)備2 2 實驗基本操作實驗基本操作3 3 培養(yǎng)基的成分及其配制培養(yǎng)基的成分及其配制4 4 培養(yǎng)條件的選擇培養(yǎng)條件的選擇植物細(xì)胞工程實驗室及基本操作植物細(xì)胞工程實驗室及基本操作1 1 實驗室設(shè)置及儀器設(shè)備實驗室設(shè)置及儀器設(shè)備 實驗室是進(jìn)行組培研究的主要場所，應(yīng)實驗室是進(jìn)行組培研究的主要場所，應(yīng)能滿足清洗、培養(yǎng)基制備、儲藏、無菌能滿足清洗、培養(yǎng)基制備、儲藏、無菌操作、培養(yǎng)、鑒定等多方面的工作。操作、培養(yǎng)、鑒定等多方面的工作。一、實驗室設(shè)計一、實驗室設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)室包括標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)室包括洗滌室（區(qū)）洗滌室（區(qū)）制備室（區(qū)）制備室（區(qū)）滅菌室（區(qū)）滅菌室

2、（區(qū)）儲放室（區(qū)）儲放室（區(qū)）操作室（區(qū)）操作室（區(qū)）培養(yǎng)室（區(qū)）培養(yǎng)室（區(qū)）觀察室（區(qū)）觀察室（區(qū)）藥品室（區(qū)）藥品室（區(qū)） 1 1基本實驗室基本實驗室1.1 1.1 洗滌間洗滌間 根據(jù)工作量的大小決定其大小，一般面積控根據(jù)工作量的大小決定其大小，一般面積控制在制在30-50m30-50m2 2。在實驗室的一側(cè)設(shè)置專用的洗滌。在實驗室的一側(cè)設(shè)置專用的洗滌水槽，用來清洗玻璃器皿。中央實驗臺還應(yīng)配置水槽，用來清洗玻璃器皿。中央實驗臺還應(yīng)配置2 2個水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量個水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以購置一臺洗瓶機。準(zhǔn)備大，可以購置一臺洗瓶機。準(zhǔn)備1-21-2個洗

3、液缸，個洗液缸，專門用于洗滌對潔凈度要求很高的玻璃器皿。此專門用于洗滌對潔凈度要求很高的玻璃器皿。此外還應(yīng)配置落水架、干燥箱、柜子、超聲波清洗外還應(yīng)配置落水架、干燥箱、柜子、超聲波清洗器等。地面應(yīng)耐濕并排水良好。器等。地面應(yīng)耐濕并排水良好。 面積面積60平方米左右，配備的主要儀器設(shè)備有平方米左右，配備的主要儀器設(shè)備有 ：冰：冰箱、天平、微波爐、箱、天平、微波爐、pH計、培養(yǎng)基分裝器、藥品計、培養(yǎng)基分裝器、藥品柜、器械柜、抽氣泵、電爐、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、柜、器械柜、抽氣泵、電爐、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶、儲藏瓶培養(yǎng)皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶、儲藏瓶等。冰箱以體積等

4、。冰箱以體積180-200L為宜，用于儲存培養(yǎng)基為宜，用于儲存培養(yǎng)基母液、激素維生素等貴重藥品、彩色膠卷、及保母液、激素維生素等貴重藥品、彩色膠卷、及保存植物材料。天平應(yīng)有不同感量。存植物材料。天平應(yīng)有不同感量。1.2培養(yǎng)基配制間培養(yǎng)基配制間 配備實驗臺、高壓滅菌鍋、排風(fēng)滅火設(shè)備、細(xì)配備實驗臺、高壓滅菌鍋、排風(fēng)滅火設(shè)備、細(xì)菌過濾設(shè)備、干熱消毒柜、電爐等。滅菌鍋的選擇菌過濾設(shè)備、干熱消毒柜、電爐等。滅菌鍋的選擇應(yīng)根據(jù)不同的要求選擇不同型號的滅菌鍋。一般實應(yīng)根據(jù)不同的要求選擇不同型號的滅菌鍋。一般實驗室可選用小型的醫(yī)用手提式高壓滅菌鍋，較大的驗室可選用小型的醫(yī)用手提式高壓滅菌鍋，較大的實驗室可選用

5、立式自動控制壓力和溫度的滅菌鍋。實驗室可選用立式自動控制壓力和溫度的滅菌鍋。生產(chǎn)性的實驗室可選用大型的臥式滅菌鍋。生產(chǎn)性的實驗室可選用大型的臥式滅菌鍋。 如果沒有條件的話，可以將上述工作間合并如果沒有條件的話，可以將上述工作間合并成一個準(zhǔn)備間，要求是設(shè)備的安裝和排列要合理、成一個準(zhǔn)備間，要求是設(shè)備的安裝和排列要合理、房間要寬敞、明亮、透風(fēng)，地面要便于清潔、防滑。房間要寬敞、明亮、透風(fēng)，地面要便于清潔、防滑。1.3 消毒間消毒間無菌操作室主要用于實驗材料的接種操作，所以又叫無菌操作室主要用于實驗材料的接種操作，所以又叫接種室。通常由里外兩間組成，外間是緩沖間，用于接種室。通常由里外兩間組成，外間

6、是緩沖間，用于準(zhǔn)備工作，還有防止污染的作用。緩沖間的門應(yīng)該與準(zhǔn)備工作，還有防止污染的作用。緩沖間的門應(yīng)該與接種室的門錯開，兩個門也不要同時開啟，以保證無接種室的門錯開，兩個門也不要同時開啟，以保證無菌室不因開門和人的進(jìn)出帶進(jìn)雜菌。緩沖間內(nèi)應(yīng)該設(shè)菌室不因開門和人的進(jìn)出帶進(jìn)雜菌。緩沖間內(nèi)應(yīng)該設(shè)有水槽、實驗臺、鞋帽架、和柜子、紫外燈。無菌操有水槽、實驗臺、鞋帽架、和柜子、紫外燈。無菌操作室的內(nèi)壁應(yīng)當(dāng)用塑鋼板或瓷磚裝修，工作人員進(jìn)入作室的內(nèi)壁應(yīng)當(dāng)用塑鋼板或瓷磚裝修，工作人員進(jìn)入操作間前要穿上消過毒的工作服和拖鞋。操作間前要穿上消過毒的工作服和拖鞋。 室內(nèi)應(yīng)配有超凈工作臺，紫外燈、解剖鏡、各種室內(nèi)應(yīng)配有

7、超凈工作臺，紫外燈、解剖鏡、各種接種器械等。接種器械等。 1.4 無菌操作室無菌操作室 為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時間及其強度，培養(yǎng)為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時間及其強度，培養(yǎng)室的房間不要窗戶，但應(yīng)當(dāng)留一個通氣窗，并安上排氣室的房間不要窗戶，但應(yīng)當(dāng)留一個通氣窗，并安上排氣扇。室內(nèi)溫度由空調(diào)控制，光照由日光燈控制。天花板扇。室內(nèi)溫度由空調(diào)控制，光照由日光燈控制。天花板和內(nèi)墻最好用塑料鋼板裝修，地面用水磨石或瓷磚鋪設(shè)，和內(nèi)墻最好用塑料鋼板裝修，地面用水磨石或瓷磚鋪設(shè)，一般要分兩間，一為光照培養(yǎng)室，一為暗培養(yǎng)室。培養(yǎng)一般要分兩間，一為光照培養(yǎng)室，一為暗培養(yǎng)室。培養(yǎng)室外應(yīng)有一預(yù)備間或走廊。室外應(yīng)有一預(yù)

8、備間或走廊。 培養(yǎng)室應(yīng)配有培養(yǎng)架、轉(zhuǎn)床、搖床、光照培養(yǎng)箱、培養(yǎng)室應(yīng)配有培養(yǎng)架、轉(zhuǎn)床、搖床、光照培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、自動控時器等。日光燈一般用生化培養(yǎng)箱、自動控時器等。日光燈一般用40W，固定，固定在培養(yǎng)架的側(cè)面或擱板的下面，每層有兩支日光燈，距在培養(yǎng)架的側(cè)面或擱板的下面，每層有兩支日光燈，距離在離在20cm，光照強度為，光照強度為2000-3000lx。1.5 培養(yǎng)室培養(yǎng)室2 2輔助實驗室輔助實驗室 2.12.1鑒定室鑒定室 細(xì)胞學(xué)鑒定室細(xì)胞學(xué)鑒定室 其功能是對培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒其功能是對培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學(xué)儀定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光

9、學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。應(yīng)配置各種顯微鏡、照相器不受潮濕和灰塵污染。應(yīng)配置各種顯微鏡、照相系統(tǒng)等。系統(tǒng)等。 生化分析室生化分析室 在以培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為主要目的的實驗在以培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為主要目的的實驗室中，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗實驗室，以便于對培室中，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗實驗室，以便于對培養(yǎng)物的有效成分隨時進(jìn)行取樣檢查。養(yǎng)物的有效成分隨時進(jìn)行取樣檢查。 離心機、酶離心機、酶聯(lián)免疫檢測儀、天平、聯(lián)免疫檢測儀、天平、PCRPCR儀等。儀等。為試管苗提供滿足生長的適宜環(huán)境條件。為試管苗提供滿足生長的適宜環(huán)境條件。2.2、溫室、溫室(1)(1)洗滌液的洗滌液的配制配制2 2 實驗基本操作實驗基本操作一一.

10、.洗滌技術(shù)洗滌技術(shù)A A、新購買的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性新購買的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用物質(zhì)，可先用0.5的去污劑洗刷，再用自來水洗的去污劑洗刷，再用自來水洗凈，然后浸泡在凈，然后浸泡在12鹽酸溶液中過夜（不可鹽酸溶液中過夜（不可少于四小時），再用自來水沖洗，最后用無離子少于四小時），再用自來水沖洗，最后用無離子水沖洗兩次，在水沖洗兩次，在100120烘箱內(nèi)烘干備用。烘箱內(nèi)烘干備用。(2)(2)洗滌方法洗滌方法 先用自來水洗刷至無污物，再用合適的先用自來水洗刷至無污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉）洗刷，或浸泡在毛刷沾去污劑（粉）洗刷，或浸泡在0.50.5的清洗劑中超聲

11、清洗（比色皿決不可超聲），的清洗劑中超聲清洗（比色皿決不可超聲），然后用自來水徹底洗凈去污劑，用無離子水然后用自來水徹底洗凈去污劑，用無離子水洗兩次，烘干備用（計量儀器不可烘干）。洗兩次，烘干備用（計量儀器不可烘干）。清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗，清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗，若重洗后仍掛有水珠，則需用洗液浸泡數(shù)小若重洗后仍掛有水珠，則需用洗液浸泡數(shù)小時后（或用去污粉擦洗），重新清洗。時后（或用去污粉擦洗），重新清洗。B B、使用過的玻璃儀器的清洗、使用過的玻璃儀器的清洗 聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化學(xué)聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化學(xué)實驗中已用的越來越多。

12、第一次使用塑料器皿時，實驗中已用的越來越多。第一次使用塑料器皿時，可先用可先用8mol/L尿素（用濃鹽酸調(diào)尿素（用濃鹽酸調(diào)pH = 1）清洗，接）清洗，接著依次用無離子水、著依次用無離子水、1 mol/L KOH和無離子水清洗，和無離子水清洗，然后用然后用103 mol/L EDTA 除去金屬離子的污染，最除去金屬離子的污染，最后用無離子水徹底清洗，以后每次使用時，可只用后用無離子水徹底清洗，以后每次使用時，可只用0.5的去污劑清洗，然后用自來水和無離子水洗凈的去污劑清洗，然后用自來水和無離子水洗凈即可。即可。C、 塑料器皿的清洗塑料器皿的清洗金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的金屬用品一般

13、不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用熱洗衣粉水洗凈），需要清洗時，一可以用熱洗衣粉水洗凈），需要清洗時，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。般用酒精擦洗，然后火焰干燥。 E E、除菌過濾器用清水沖洗后，用洗液沖洗，、除菌過濾器用清水沖洗后，用洗液沖洗，再用清水沖洗，最后用蒸餾水沖洗，晾干備再用清水沖洗，最后用蒸餾水沖洗，晾干備用。用。D D、金屬用品洗滌、金屬用品洗滌（一）、滅菌工作是極其重要的。（一）、滅菌工作是極其重要的。 首先應(yīng)建立有菌和無菌的概念有菌的范疇：首先應(yīng)建立有菌和無菌的概念有菌的范疇：有菌：有菌：凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的。凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的

14、。如植物的表面、超凈工作臺的臺面，未處理的工具和手等。如植物的表面、超凈工作臺的臺面，未處理的工具和手等。 無菌無菌：高壓高溫處理（工具、器皿、培養(yǎng)基等）：高壓高溫處理（工具、器皿、培養(yǎng)基等） 物理或化學(xué)處理；物理或化學(xué)處理； 火烤后的物體；火烤后的物體； 健康的動植物不與內(nèi)外部表面接觸的組織健康的動植物不與內(nèi)外部表面接觸的組織 內(nèi)部可能是無菌的（有時也有內(nèi)生菌，但內(nèi)部可能是無菌的（有時也有內(nèi)生菌，但 不會影響培養(yǎng)，也不會污染）不會影響培養(yǎng)，也不會污染）二二. .滅菌滅菌1 1、物理方法物理方法：干熱、濕熱、過濾（：干熱、濕熱、過濾（0.250.25微微米）紫外燈、超聲波等。米）紫外燈、超聲波

15、等。 2 2、化學(xué)方法化學(xué)方法：使用滅菌劑或抗菌素，如酒：使用滅菌劑或抗菌素，如酒精、次氯酸鈉、升汞、漂白粉、高錳酸鉀、精、次氯酸鈉、升汞、漂白粉、高錳酸鉀、雙氧水、福爾馬林等雙氧水、福爾馬林等 （二）、滅菌的方法（二）、滅菌的方法干熱滅菌干熱滅菌 玻璃器皿、器械玻璃器皿、器械 濕熱滅菌濕熱滅菌 培養(yǎng)基、蒸餾水、器械、棉塞等培養(yǎng)基、蒸餾水、器械、棉塞等熏蒸滅菌熏蒸滅菌 接種室、培養(yǎng)室接種室、培養(yǎng)室過濾滅菌過濾滅菌 液體培養(yǎng)基、蒸餾水液體培養(yǎng)基、蒸餾水藥劑滅菌藥劑滅菌 培養(yǎng)材料培養(yǎng)材料燒灼滅菌燒灼滅菌 器械、瓶口、棉塞、包頭紙器械、瓶口、棉塞、包頭紙輻射滅菌輻射滅菌 接種室。培養(yǎng)間接種室。培養(yǎng)間

16、各種滅菌方法及其使用范圍各種滅菌方法及其使用范圍適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方法：法：150 150 、40min40min或或120 120 、120min120min，如，如果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌，果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌，160 160 、9090120min120min（1 1）干熱滅菌）干熱滅菌適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、棉塞、紙等。棉塞、紙等。121 121 維持維持202030min30min注意點：加足水、排盡氣、氣壓降到注意點：加足水、排盡氣、氣壓降到0 0時，時，才能開蓋才能開蓋（2 2）濕熱滅菌）

17、濕熱滅菌 培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些生長調(diào)培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些生長調(diào)節(jié)劑節(jié)劑GA3GA3、玉米素等），就需要過濾滅菌。另外酶、玉米素等），就需要過濾滅菌。另外酶、血清等也需要過濾滅菌血清等也需要過濾滅菌 滅菌方法：將生長調(diào)節(jié)劑或酶配成一定濃度，滅菌方法：將生長調(diào)節(jié)劑或酶配成一定濃度，用注射器注入微孔濾膜慮，濾膜孔徑用注射器注入微孔濾膜慮，濾膜孔徑0.220.220.450.45微米。制培養(yǎng)基時，現(xiàn)將培養(yǎng)基高壓滅菌，待降微米。制培養(yǎng)基時，現(xiàn)將培養(yǎng)基高壓滅菌，待降至至5050左右時，加入適量的激素

18、，然后分裝。左右時，加入適量的激素，然后分裝。（3 3）過濾滅菌）過濾滅菌主要是利用紫外燈進(jìn)行照射，適合實驗室主要是利用紫外燈進(jìn)行照射，適合實驗室空氣、操作臺等，滅菌時間空氣、操作臺等，滅菌時間202030min30min。注意：關(guān)燈后注意：關(guān)燈后5min5min后再進(jìn)入。超凈工作臺后再進(jìn)入。超凈工作臺關(guān)燈后要打開風(fēng)機。關(guān)燈后要打開風(fēng)機。（4 4）射線滅菌）射線滅菌用火焰灼燒達(dá)到滅菌目的，適用于用火焰灼燒達(dá)到滅菌目的，適用于接種器皿的滅菌。接種器皿的滅菌。（5 5）火焰灼燒滅菌）火焰灼燒滅菌適用外植體、實驗器皿、操作表面、皮膚等。適用外植體、實驗器皿、操作表面、皮膚等。幾種常用消毒劑的效果比較

19、幾種常用消毒劑的效果比較消消 毒毒 劑劑使用濃度使用濃度(%)(%)消毒時間消毒時間(min.)(min.)效效 果果殘液去除殘液去除難易難易乙醇乙醇70-7570-750.1-30.1-3好好易易新潔爾滅新潔爾滅101020205 53030好好易易氯化汞氯化汞0.10.11 12 21515最好最好最難最難過氧化氫過氧化氫101012125 51515較好較好最易最易抗菌素抗菌素4 450mgl50mgl-1-130306060較好較好較難較難次氯酸鈣次氯酸鈣/ /納納9 9 10105 53030好好易易（6 6）消毒劑）消毒劑長期不用的培養(yǎng)室或接種室要進(jìn)行熏蒸。方法：長期不用的培養(yǎng)室或

20、接種室要進(jìn)行熏蒸。方法：甲甲醛、高錳酸鉀熏蒸醛、高錳酸鉀熏蒸。 甲醛的用量通常按每立方米空間甲醛的用量通常按每立方米空間2-62-6毫升計算，毫升計算，高錳酸鉀的用量是甲醛的一半。室內(nèi)準(zhǔn)備妥當(dāng)后，高錳酸鉀的用量是甲醛的一半。室內(nèi)準(zhǔn)備妥當(dāng)后，把稱好的高錳酸鉀放在瓷碗或燒杯內(nèi)把稱好的高錳酸鉀放在瓷碗或燒杯內(nèi)( (最好在碗或最好在碗或杯下面鋪一張報紙，以利清洗杯下面鋪一張報紙，以利清洗) )，然后將甲醛也倒，然后將甲醛也倒入碗或杯內(nèi)，立即出屋關(guān)門。幾秒鐘后，甲醛溶液入碗或杯內(nèi)，立即出屋關(guān)門。幾秒鐘后，甲醛溶液即沸騰揮發(fā)。高錳酸鉀是一種氧化劑，當(dāng)它與一部即沸騰揮發(fā)。高錳酸鉀是一種氧化劑，當(dāng)它與一部分甲

21、醛作用時，由氧化反應(yīng)產(chǎn)生的熱可使其余的甲分甲醛作用時，由氧化反應(yīng)產(chǎn)生的熱可使其余的甲醛揮發(fā)為氣體。醛揮發(fā)為氣體。熏蒸滅菌熏蒸滅菌甲醛熏蒸接種室應(yīng)至少在使用前甲醛熏蒸接種室應(yīng)至少在使用前2424小時進(jìn)行，熏蒸后小時進(jìn)行，熏蒸后密閉保持密閉保持4 4小時以上再進(jìn)入室內(nèi)工作。甲醛對人的眼、小時以上再進(jìn)入室內(nèi)工作。甲醛對人的眼、鼻有強烈刺激作用。因此，可在使用前用氨進(jìn)行中和。鼻有強烈刺激作用。因此，可在使用前用氨進(jìn)行中和。取與甲醛等量的氨水，倒在另一個燒杯里，迅速放入取與甲醛等量的氨水，倒在另一個燒杯里，迅速放入熏蒸室內(nèi)，使甲醛和氨水發(fā)生中和反應(yīng)，以消除甲醛熏蒸室內(nèi)，使甲醛和氨水發(fā)生中和反應(yīng)，以消除甲

22、醛味，減少對人體的刺激作用。使用氨水應(yīng)在工作前味，減少對人體的刺激作用。使用氨水應(yīng)在工作前2 2小時進(jìn)行。小時進(jìn)行。 對有材料的培養(yǎng)室，也可以采用乙二醇加熱熏蒸對有材料的培養(yǎng)室，也可以采用乙二醇加熱熏蒸人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素物品因素器器皿皿和和用用具具培養(yǎng)皿：洗培養(yǎng)皿：洗熱壓熱壓 玻璃器皿：洗玻璃器皿：洗干熱（干熱箱）或晾干干熱（干熱箱）或晾干 接種用具：用接種用具：用CCLCCL4 4布擦布擦濕布擦濕布擦 泡泡75%95%75%95%酒精酒精燒燒培養(yǎng)基：濕熱培養(yǎng)基：濕熱培培養(yǎng)養(yǎng)材材料料外部細(xì)菌：用水

23、沖洗外部細(xì)菌：用水沖洗化學(xué)藥劑處理化學(xué)藥劑處理 內(nèi)部細(xì)菌內(nèi)部細(xì)菌 莖尖培養(yǎng)莖尖培養(yǎng) 加抗生素：青霉素、利福平加抗生素：青霉素、利福平操作的空氣：洗刷地板操作的空氣：洗刷地板95%酒精擦超凈工作臺酒精擦超凈工作臺 用化學(xué)試劑薰蒸用化學(xué)試劑薰蒸污染來源污染來源三、無菌操作技術(shù)三、無菌操作技術(shù)1 1、實驗器具和材料的準(zhǔn)備、實驗器具和材料的準(zhǔn)備2 2、用、用75%75%的酒精擦拭超凈工作臺，然后室內(nèi)及超的酒精擦拭超凈工作臺，然后室內(nèi)及超凈工作臺用紫外燈殺菌凈工作臺用紫外燈殺菌20min-30min20min-30min。注意：臺。注意：臺面上的用品不要放置太多或重疊放置，以免降低面上的用品不要放置太多

24、或重疊放置，以免降低滅菌效果。滅菌效果。3 3、關(guān)紫外燈、打開風(fēng)機，過、關(guān)紫外燈、打開風(fēng)機，過5-10min5-10min進(jìn)入緩沖間，進(jìn)入緩沖間，以以75%75%洗手和手臂，更換無菌服、帽子和口罩。洗手和手臂，更換無菌服、帽子和口罩。進(jìn)入接種室。（注：沒有特別情況，盡量不要下進(jìn)入接種室。（注：沒有特別情況，盡量不要下工作臺）工作臺）4 4、用、用70707575的酒精拭擦臺面并消毒雙手。試驗的酒精拭擦臺面并消毒雙手。試驗用具也應(yīng)該用酒精消毒。點燃酒精燈，將金屬器用具也應(yīng)該用酒精消毒。點燃酒精燈，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。械在其火焰上灼燒，冷卻待用。注意：所有操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過灼燒

25、進(jìn)行。注意：所有操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過灼燒進(jìn)行。金屬器械不能過度灼燒，以防退火。移液管不能金屬器械不能過度灼燒，以防退火。移液管不能灼燒，培養(yǎng)瓶口、塑料材料、橡膠材料過火焰不灼燒，培養(yǎng)瓶口、塑料材料、橡膠材料過火焰不能時間太長。能時間太長。5 5、取流水沖洗（至少、取流水沖洗（至少30min30min）過的外植體，用一定）過的外植體，用一定的消毒劑浸泡消毒，用無菌水沖洗的消毒劑浸泡消毒，用無菌水沖洗3434次，放入無菌次，放入無菌培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無菌的接種器培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無菌的接種器械進(jìn)行分離、切割或其他處理。械進(jìn)行分離、切割或其他處理。6 6、打開培養(yǎng)瓶，瓶

26、口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷、打開培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，灼燒鑷子放回，子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，灼燒鑷子放回，灼燒瓶口，蓋上瓶塞。灼燒瓶口，蓋上瓶塞。7 7、用酒精擦洗工作臺和手。進(jìn)行下一輪操作。、用酒精擦洗工作臺和手。進(jìn)行下一輪操作。注意（注意（1 1）進(jìn)行培養(yǎng)時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必）進(jìn)行培養(yǎng)時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。（太快，以防空氣流動，增加污染機會。（2 2）不能用）不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。取備品更換。 （3 3）為拿取方便，工

27、作臺面上的用品）為拿取方便，工作臺面上的用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。（右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。（4 4）工）工作由始至終要保持一定順序性，組織或細(xì)胞在未做處作由始至終要保持一定順序性，組織或細(xì)胞在未做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口直立可增加落菌機會。即封閉瓶口直立可增加落菌機會。（5 5）吸取營養(yǎng)液、細(xì)胞懸液及其

28、它各種用液時，均）吸取營養(yǎng)液、細(xì)胞懸液及其它各種用液時，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴大污染或?qū)е录?xì)應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染。胞交叉污染。（6 6）工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽，以免唾沫）工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染。把細(xì)菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染。（7 7）手或相對較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上方，）手或相對較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液時如吸管尖碰到瓶口，則應(yīng)將吸瓶口最易污染，加液時如吸管尖碰到瓶口，則應(yīng)將吸管丟掉。管丟掉。接種時在近火焰處打開瓶口，使瓶傾斜，接種時在近火焰處打開瓶

29、口，使瓶傾斜，以免空氣中微生物落入瓶中以免空氣中微生物落入瓶中正正 確確 錯錯 誤誤整個接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動作要整個接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動作要迅速迅速正正 確確 錯錯 誤誤接種過程中盡可能達(dá)到懸空要求防止操作帶來的污染防止操作帶來的污染正正 確確 錯錯 誤誤接種時不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口正正 確確 錯錯 誤誤瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正正 確確 錯錯 誤誤接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生種子和分生組織：培養(yǎng)時通常將其貼放在培養(yǎng)基表種子和分生組織：培養(yǎng)時通常將其貼放在培養(yǎng)基表面，而不是插到培養(yǎng)基內(nèi)部，以免供氧不足面，而不是插

30、到培養(yǎng)基內(nèi)部，以免供氧不足正正 確確 錯錯 誤誤接種莖段：注意形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基內(nèi)，而形接種莖段：注意形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基內(nèi)，而形態(tài)學(xué)上端露于空氣中態(tài)學(xué)上端露于空氣中正正 確確 錯錯 誤誤用于外植體分離的母體植物材料一般有用于外植體分離的母體植物材料一般有3種來源：種來源：一是一是生長在自然環(huán)境下的植物生長在自然環(huán)境下的植物；二是；二是在溫室控制在溫室控制環(huán)境條件下生長的植物環(huán)境條件下生長的植物；三是；三是無菌環(huán)境下已經(jīng)過無菌環(huán)境下已經(jīng)過離體培養(yǎng)的植物離體培養(yǎng)的植物。 四、外植體的選擇與處理技術(shù)四、外植體的選擇與處理技術(shù) 1 1、選擇優(yōu)良的基因型、選擇優(yōu)良的基因型 試驗首先要明確目的。例如，

31、蔬菜、作物等的試驗首先要明確目的。例如，蔬菜、作物等的脫毒快繁，是為了脫去病毒，提高產(chǎn)量和質(zhì)量，脫毒快繁，是為了脫去病毒，提高產(chǎn)量和質(zhì)量，就應(yīng)選擇當(dāng)?shù)卦耘啻_認(rèn)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種作為脫就應(yīng)選擇當(dāng)?shù)卦耘啻_認(rèn)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種作為脫毒的材料，并且品種一定要可靠?；ɑ?、觀賞植毒的材料，并且品種一定要可靠?；ɑ?、觀賞植物的快繁，也應(yīng)選擇有價值的植物。物的快繁，也應(yīng)選擇有價值的植物。 2 2、取材、取材 從生長旺盛、健壯、無病蟲害的植株上取材。從生長旺盛、健壯、無病蟲害的植株上取材。母柱代謝旺盛期切取的外植體再生能力強，試驗?zāi)钢x旺盛期切取的外植體再生能力強，試驗容易成功。容易成功。 （一）、外植體的選擇（

32、一）、外植體的選擇3 3、外植體大小選擇、外植體大小選擇 因外植體不同而不同。如利用莖尖培養(yǎng)，因外植體不同而不同。如利用莖尖培養(yǎng)，莖尖大小對脫毒效果非常明顯。再如幼胚培養(yǎng)，莖尖大小對脫毒效果非常明顯。再如幼胚培養(yǎng)，胚齡也非常重要。（以后具體講）胚齡也非常重要。（以后具體講） 4 4、選擇外植體的時期、選擇外植體的時期 外植體的生長動態(tài)往往與該物種的生長規(guī)律外植體的生長動態(tài)往往與該物種的生長規(guī)律（生物鐘）有關(guān)。因此，最好在植物生長的最適（生物鐘）有關(guān)。因此，最好在植物生長的最適宜時期取材培養(yǎng)。會得到較好的結(jié)果。宜時期取材培養(yǎng)。會得到較好的結(jié)果。 1 1、取材母株的預(yù)處理取材母株的預(yù)處理 人工管理

33、，促進(jìn)母株生長旺盛、代謝活躍，從其人工管理，促進(jìn)母株生長旺盛、代謝活躍，從其上取材培養(yǎng)，容易成功。上取材培養(yǎng)，容易成功。 2 2、外植體休眠的處理外植體休眠的處理 有些植物的種子、幼胚、或芽，存在休眠。為了有些植物的種子、幼胚、或芽，存在休眠。為了打破休眠，可利用低溫處理，或赤霉素等化學(xué)物質(zhì)打破休眠，可利用低溫處理，或赤霉素等化學(xué)物質(zhì)處理。因植物不同處理溫度和時間有所不同。處理。因植物不同處理溫度和時間有所不同。 （二）、外植體的處理（二）、外植體的處理3 3、 組織內(nèi)生菌的處理組織內(nèi)生菌的處理 （1 1）加入抗生素，注意抗生素的用量，）加入抗生素，注意抗生素的用量，高濃度容易造成培養(yǎng)物的死亡

34、高濃度容易造成培養(yǎng)物的死亡 （2 2）取生長期旺盛的生長點部位作為）取生長期旺盛的生長點部位作為起始培養(yǎng)的外植體。起始培養(yǎng)的外植體。 （3 3）取被內(nèi)生菌污染的培養(yǎng)物的）取被內(nèi)生菌污染的培養(yǎng)物的 莖尖莖尖不停的轉(zhuǎn)接。不停的轉(zhuǎn)接。3.3.培養(yǎng)基的成分及其配制培養(yǎng)基的成分及其配制一、培養(yǎng)基的成分及其作用一、培養(yǎng)基的成分及其作用（一）（一）無機營養(yǎng)物質(zhì)無機營養(yǎng)物質(zhì) 培養(yǎng)的植物組織、器官、細(xì)胞或者原生質(zhì)體需培養(yǎng)的植物組織、器官、細(xì)胞或者原生質(zhì)體需要連續(xù)的供給某些無機化學(xué)物質(zhì)，除了要連續(xù)的供給某些無機化學(xué)物質(zhì)，除了C C、H H、O O之之外，需要量比較多的元素叫大量元素，需要量比較外，需要量比較多的元

35、素叫大量元素，需要量比較少的元素叫微量營養(yǎng)元素。少的元素叫微量營養(yǎng)元素。培養(yǎng)基的大量元素使用量一般在每升幾十至幾千培養(yǎng)基的大量元素使用量一般在每升幾十至幾千毫克。大量元素包括毫克。大量元素包括N, P, K, Ca, Mg, SN, P, K, Ca, Mg, S。培養(yǎng)基中加入量最多的是培養(yǎng)基中加入量最多的是N N，N N一般以硝酸鹽或氨一般以硝酸鹽或氨鹽，或者兩者結(jié)合的鹽提供鹽，或者兩者結(jié)合的鹽提供大量元素大量元素微量元素的用量一般每升不高于幾十毫克。植物所微量元素的用量一般每升不高于幾十毫克。植物所需的微量元素有需的微量元素有FeFe、CuCu、ZnZn、B B、 MoMo、MnMn、Co

36、Co，ClCl其他一些化學(xué)藥品常帶有微量元素雜質(zhì)，因此要注其他一些化學(xué)藥品常帶有微量元素雜質(zhì)，因此要注意微量元素的用量不能過多，多會引起生長抑制等意微量元素的用量不能過多，多會引起生長抑制等毒害現(xiàn)象。毒害現(xiàn)象。微量元素微量元素（二）（二）. .有機化合物有機化合物有機物質(zhì)包括維生素類物質(zhì)、氨基酸類物質(zhì)、糖類物有機物質(zhì)包括維生素類物質(zhì)、氨基酸類物質(zhì)、糖類物質(zhì)和一些其它的有機添加物質(zhì)和一些其它的有機添加物1、維生素類物質(zhì)、維生素類物質(zhì) 維生素類物質(zhì)在酶系統(tǒng)中有催化功能。維生素類物質(zhì)在酶系統(tǒng)中有催化功能。 硫胺素（硫胺素（VB1）與愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有關(guān)，可）與愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有關(guān)，可能是

37、所有植物組織培養(yǎng)初期需要的維生素，而鹽酸能是所有植物組織培養(yǎng)初期需要的維生素，而鹽酸吡哆醇（吡哆醇（VB6）促進(jìn)根的生長，煙酸（）促進(jìn)根的生長，煙酸（VB3，又稱，又稱維生素維生素PP）促進(jìn)胚的發(fā)育。有的配方中還使用了泛）促進(jìn)胚的發(fā)育。有的配方中還使用了泛酸鈣（酸鈣（VB5）、生物素（）、生物素（VH）、鈷胺素（）、鈷胺素（VB12）、）、葉酸（葉酸（VBc），），Vc等。等。 2、AA類物質(zhì)類物質(zhì)絕大多數(shù)絕大多數(shù)AA適量時對培養(yǎng)效果都有正象效應(yīng)。常用適量時對培養(yǎng)效果都有正象效應(yīng)。常用的有的有Gly、Asn、Gln。在植物組織培養(yǎng)中，有時也。在植物組織培養(yǎng)中，有時也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。用

38、水解乳蛋白和水解酪蛋白。3 3、糖類、糖類糖在培養(yǎng)基的作用：糖在培養(yǎng)基的作用：1 1）、為細(xì)胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架）、為細(xì)胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架 2 2）、為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物和能量）、為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物和能量 3 3）、維持滲透壓）、維持滲透壓蔗糖是廣泛應(yīng)用的一種碳源。葡萄糖和麥芽糖也是常蔗糖是廣泛應(yīng)用的一種碳源。葡萄糖和麥芽糖也是常用的碳源。用的碳源。4、其它有機物質(zhì)、其它有機物質(zhì)1）肌醇（環(huán)己六醇）肌醇（環(huán)己六醇） 肌醇可以形成果膠物質(zhì)，是細(xì)胞壁的構(gòu)建物質(zhì)肌醇可以形成果膠物質(zhì)，是細(xì)胞壁的構(gòu)建物質(zhì)另外還可以形成植酸，與陽離子結(jié)合或形成磷脂，另外還可以形成植酸，與陽離子結(jié)合或形

39、成磷脂，參與細(xì)胞膜的組成。利于胚和芽的形成參與細(xì)胞膜的組成。利于胚和芽的形成2）天然有機物天然有機物一些天然的有機物如椰乳、番茄提取物、酵母提一些天然的有機物如椰乳、番茄提取物、酵母提取物、馬鈴薯煮汁也常用于植物組織培養(yǎng)，并表取物、馬鈴薯煮汁也常用于植物組織培養(yǎng)，并表現(xiàn)出了良好的促進(jìn)作用?，F(xiàn)出了良好的促進(jìn)作用。n植物激素是在植物體內(nèi)合成的，對植物植物激素是在植物體內(nèi)合成的，對植物生長發(fā)育有顯著調(diào)節(jié)作用的微量有機物，生長發(fā)育有顯著調(diào)節(jié)作用的微量有機物，而而植物生長調(diào)節(jié)植物生長調(diào)節(jié)劑是外源的調(diào)節(jié)植物生劑是外源的調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的物質(zhì)。長發(fā)育的物質(zhì)。n無機元素和有機營養(yǎng)構(gòu)成的培養(yǎng)基僅保無機元素和有機

40、營養(yǎng)構(gòu)成的培養(yǎng)基僅保證培養(yǎng)物的生存與最低生理活動，只有證培養(yǎng)物的生存與最低生理活動，只有加入植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，才能誘導(dǎo)細(xì)胞加入植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，才能誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化。分裂、脫分化和再分化。（三）、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（三）、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 1 1、生長素類：、生長素類：1 1）吲哚類：）吲哚類：IAAIAA（吲哚乙酸）、（吲哚乙酸）、 IBAIBA（吲哚丁酸）（吲哚丁酸） 、IPAIPA（吲哚丙酸）（吲哚丙酸）2 2）萘酸類：）萘酸類： NAANAA（萘乙酸）（萘乙酸）3 3）苯氧羧酸類：）苯氧羧酸類：2,4-D2,4-D（2,4-2,4-二氯苯氧乙酸）、二氯苯氧乙酸）、2,4,5-

41、T2,4,5-T（ 2,4,5-2,4,5-三氯苯氧乙酸）、三氯苯氧乙酸）、 2,4,5-T2,4,5-TP P（ 2,4,5-2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。三氯苯氧丙酸）等。其中吲哚乙酸在植物體內(nèi)普遍存在，是生理活性最其中吲哚乙酸在植物體內(nèi)普遍存在，是生理活性最強的生長素。強的生長素。 生長素的生理作用生長素的生理作用1 1、促進(jìn)細(xì)胞生長和細(xì)胞分裂、促進(jìn)細(xì)胞生長和細(xì)胞分裂2 2、誘導(dǎo)受傷組織表面細(xì)胞恢復(fù)分裂能力、誘導(dǎo)受傷組織表面細(xì)胞恢復(fù)分裂能力3 3、形成愈傷組織，促進(jìn)生根、形成愈傷組織，促進(jìn)生根4 4、與一定量的細(xì)胞分裂素配合共同誘導(dǎo)不定、與一定量的細(xì)胞分裂素配合共同誘導(dǎo)不定芽的分化、側(cè)芽

42、的萌發(fā)與生長、胚狀體的誘芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)與生長、胚狀體的誘導(dǎo)。導(dǎo)。A A：NAA 0mg/LNAA 0mg/L，芽（少），根（無），芽（少），根（無） B B：NAA 0.1mg/LNAA 0.1mg/L，芽（少），根（無），愈傷組織（少量），芽（少），根（無），愈傷組織（少量） C C：NAA 5.0mg/LNAA 5.0mg/L，芽（少），根（多），愈傷組織（一定量，芽（少），根（多），愈傷組織（一定量A B C2、細(xì)胞分裂素、細(xì)胞分裂素n是一類腺嘌呤衍生物。主要有激動素（是一類腺嘌呤衍生物。主要有激動素（ 6-6-糠糠基氨基嘌呤基氨基嘌呤KTKT）、）、6-6-芐基氨基嘌呤（芐基氨基

43、嘌呤（6-BA6-BA）和）和玉米素（玉米素（ZTZT）等。其中最常用的是）等。其中最常用的是6 6芐基氨芐基氨基嘌呤?；堰?。n功能：功能：1 1、促進(jìn)細(xì)胞的分裂和分化、促進(jìn)細(xì)胞的分裂和分化2 2、誘導(dǎo)芽的分化、誘導(dǎo)芽的分化3 3、促進(jìn)側(cè)芽的萌發(fā)和生長、促進(jìn)側(cè)芽的萌發(fā)和生長4 4、抑制衰老、抑制衰老A BA A：BA(0mg/L) BA(0mg/L) ，芽（減少），根（增多）愈傷組織（一定量），芽（減少），根（增多）愈傷組織（一定量）B B：BA(0.1mg/L)BA(0.1mg/L)，芽（適量），根（適量）愈傷組織（一定量），芽（適量），根（適量）愈傷組織（一定量）控制植物細(xì)胞分化控制植物

44、細(xì)胞分化n分裂素分裂素/ /生長素的比例是控制芽和根形成生長素的比例是控制芽和根形成的一個重要條件的一個重要條件n比例高時比例高時產(chǎn)生芽產(chǎn)生芽, ,比例低時比例低時產(chǎn)生產(chǎn)生根根生理作用：生理作用：1 1、誘導(dǎo)莖的細(xì)胞伸長，對矮生型植物恢復(fù)成高、誘導(dǎo)莖的細(xì)胞伸長，對矮生型植物恢復(fù)成高生型特別有效，對根無效生型特別有效，對根無效2 2、對形成層的細(xì)胞分化有影響，往往同生長素、對形成層的細(xì)胞分化有影響，往往同生長素有協(xié)同作用。有協(xié)同作用。IAA/GAIAA/GA比值高有利于木質(zhì)部的分化，比值高有利于木質(zhì)部的分化，比值低有利于韌皮部的分化。比值低有利于韌皮部的分化。3 3、破除種子、鱗莖、塊莖休眠，使

45、之提前萌發(fā)。、破除種子、鱗莖、塊莖休眠，使之提前萌發(fā)。4 4、對生長素和細(xì)胞分裂素的活性有增效作用、對生長素和細(xì)胞分裂素的活性有增效作用注：不耐熱，應(yīng)采用過濾滅菌加入注：不耐熱，應(yīng)采用過濾滅菌加入3 3、赤霉素（、赤霉素（GAGA3 3）生理作用生理作用：1 1、抑制蛋白質(zhì)的合成、抑制蛋白質(zhì)的合成2 2、抵消和抑制生長素、細(xì)胞分裂素、抵消和抑制生長素、細(xì)胞分裂素、GAGA的作的作用用3 3、誘導(dǎo)休眠、促進(jìn)衰老和脫落、誘導(dǎo)休眠、促進(jìn)衰老和脫落 4 4、脫落酸（、脫落酸（ABAABA）以上四種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，前兩類用的多，后兩類只以上四種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，前兩類用的多，后兩類只是補充，對某些植物有利、對

46、某些植物不僅沒有利，是補充，對某些植物有利、對某些植物不僅沒有利，還有害，實際工作中要具體分析。還有害，實際工作中要具體分析。生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在生物體內(nèi)存在甚微，濃度很低，一生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在生物體內(nèi)存在甚微，濃度很低，一般用般用ppm表示表示 1ppm=1mg/L1 1、固化劑、固化劑 瓊脂、瓊脂糖（用于原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)及某些瓊脂、瓊脂糖（用于原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)及某些作物的花藥培養(yǎng)）作物的花藥培養(yǎng)） 瓊脂的用量一般在瓊脂的用量一般在4-10g/L4-10g/L，所購回的瓊脂要先，所購回的瓊脂要先試一下它的凝固力，一般只要能穩(wěn)定的凝固就不要試一下它的凝固力，一般只要能穩(wěn)定的凝固就不要多加。瓊脂以顏色

47、淺、透明度好、潔凈的為上品。多加。瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。2 2、懸浮劑、懸浮劑FicollFicoll（聚蔗糖）（聚蔗糖） （四）固化劑和懸浮劑（四）固化劑和懸浮劑培養(yǎng)基的種類（根據(jù)無機鹽的濃度）：培養(yǎng)基的種類（根據(jù)無機鹽的濃度）：1、高無機鹽含量培養(yǎng)基、高無機鹽含量培養(yǎng)基 鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽含量較高，微量元素種類鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽含量較高，微量元素種類齊全，比例適當(dāng)，離子平衡性好，具有較強的緩齊全，比例適當(dāng)，離子平衡性好，具有較強的緩沖性，養(yǎng)分?jǐn)?shù)量及比例比較合適，廣泛用于植物沖性，養(yǎng)分?jǐn)?shù)量及比例比較合適，廣泛用于植物的器官、花藥、細(xì)胞及原生質(zhì)體的培養(yǎng)。主要有的器官、花藥、細(xì)胞

48、及原生質(zhì)體的培養(yǎng)。主要有MS、LS、BL、BM、ER培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。二、培養(yǎng)基的配方及培養(yǎng)基的選擇二、培養(yǎng)基的配方及培養(yǎng)基的選擇2、高硝態(tài)氮培養(yǎng)基、高硝態(tài)氮培養(yǎng)基 硝酸鉀含量高，氨態(tài)氮的含量低，含有較高硝酸鉀含量高，氨態(tài)氮的含量低，含有較高的的VB1。主要適合與木本植物、十字花科植物和。主要適合與木本植物、十字花科植物和單子葉植物的組織和花藥培養(yǎng)。主要有單子葉植物的組織和花藥培養(yǎng)。主要有B5、N6、SH培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。3、中等無機鹽含量培養(yǎng)基、中等無機鹽含量培養(yǎng)基大量元素約為大量元素約為MS培養(yǎng)基的一半，微量元素種類減少，培養(yǎng)基的一半，微量元素種類減少，但含量較但含量較MS的高，維生素種類比的

49、高，維生素種類比MS多，如增加了多，如增加了生物素、葉酸等。適合于花藥培養(yǎng)，主要有生物素、葉酸等。適合于花藥培養(yǎng)，主要有Nitch，NT、H、Miller培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。4、低無機鹽含量培養(yǎng)基、低無機鹽含量培養(yǎng)基大量元素含量大幅度降低而且種類減少，有機含量大量元素含量大幅度降低而且種類減少，有機含量相對也很低。多數(shù)用于生根培養(yǎng)基，主要有相對也很低。多數(shù)用于生根培養(yǎng)基，主要有White、Heller、WS、HE、HB。初代培養(yǎng)基初代培養(yǎng)基：用來第一次接種外植體的培養(yǎng)基：用來第一次接種外植體的培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)基：用來接種繼初代培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。：用來接種繼初代培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。 根據(jù)培養(yǎng)物的培

50、養(yǎng)過程，培養(yǎng)基分為：根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程，培養(yǎng)基分為：根據(jù)其作用不同，培養(yǎng)基分為：根據(jù)其作用不同，培養(yǎng)基分為：誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基4、根據(jù)其營養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為基本培根據(jù)其營養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基。養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基基本培養(yǎng)基（就是通常稱呼的培養(yǎng)基）主要有（就是通常稱呼的培養(yǎng)基）主要有MSMS、WhiteWhite、 N6N6、B5 B5 、改良、改良MSMS、HellerHeller、NitshNitsh、SHSH、 MillerMiller等。等。完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基就是基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗就是基本培養(yǎng)

51、基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他復(fù)雜有機物質(zhì)等。其他復(fù)雜有機物質(zhì)等。MS+6-BA0.5+KT0.5+NAA0.5+Su3%+Ag0.7%MS+6-BA0.5+KT0.5+NAA0.5+Su3%+Ag0.7%1 1. .無機營養(yǎng)成分無機營養(yǎng)成分：一般在現(xiàn)有培養(yǎng)基配方中選擇?？梢詤⒖迹阂话阍诂F(xiàn)有培養(yǎng)基配方中選擇?？梢詤⒖记叭说慕?jīng)驗，例如：前人的經(jīng)驗，例如：MSMS是廣譜性培養(yǎng)基，是廣譜性培養(yǎng)基，N6N6用于單子葉植物用于單子葉植物的培養(yǎng)。豆科多用的培養(yǎng)。豆科多用B5B5培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。2 2、植物生長調(diào)節(jié)劑植物生長調(diào)節(jié)劑

52、：必須進(jìn)行篩選試驗?？傮w原則：必須進(jìn)行篩選試驗?？傮w原則- -當(dāng)誘導(dǎo)當(dāng)誘導(dǎo)愈傷組織形成時，細(xì)胞分裂素和生長素相對平衡；誘導(dǎo)芽分愈傷組織形成時，細(xì)胞分裂素和生長素相對平衡；誘導(dǎo)芽分化時，細(xì)胞分裂素水平應(yīng)高于生長素，誘導(dǎo)根則要低?；瘯r，細(xì)胞分裂素水平應(yīng)高于生長素，誘導(dǎo)根則要低。3 3、有機成分有機成分要根據(jù)培養(yǎng)類型考慮，如進(jìn)行器官和組織培養(yǎng)，要根據(jù)培養(yǎng)類型考慮，如進(jìn)行器官和組織培養(yǎng)，一般不加復(fù)雜有機成分，而進(jìn)行細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)則要加。一般不加復(fù)雜有機成分，而進(jìn)行細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)則要加。培養(yǎng)基的篩選：培養(yǎng)基的篩選： （一）、貯備液（母液）的配制（一）、貯備液（母液）的配制 為什么要配制母液？為什

53、么要配制母液？ 1 1）、方便）、方便 2 2）、準(zhǔn)確（有些成分量太?。?、準(zhǔn)確（有些成分量太?。?三、培養(yǎng)基的配三、培養(yǎng)基的配制制1 1、大量元素母液的配制、大量元素母液的配制各成分按照表各成分按照表1 1培養(yǎng)基濃度含量擴大培養(yǎng)基濃度含量擴大1010倍，按順序逐倍，按順序逐步混合。后用蒸餾水定容到步混合。后用蒸餾水定容到1000ml1000ml的容量瓶中，即為的容量瓶中，即為1010倍的大量元素母液。到入細(xì)口瓶，貼好標(biāo)簽保存于倍的大量元素母液。到入細(xì)口瓶，貼好標(biāo)簽保存于冰箱中。配制培養(yǎng)基時，每配冰箱中。配制培養(yǎng)基時，每配1L1L培養(yǎng)基取此液培養(yǎng)基取此液100ml100ml。 注意：注意：(1)

54、 (1) 某些無機成分如某些無機成分如CaCa2+2+、SOSO4 42 2一一、Mg Mg 2 2十十和和H H2 2POPO4 4一一等在一起可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀物。為避免此等在一起可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀物。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，母液配制時要用純度高的重蒸餾水溶解，藥現(xiàn)象發(fā)生，母液配制時要用純度高的重蒸餾水溶解，藥品采用等級較高的分析純，各種化學(xué)藥品必須先以少量品采用等級較高的分析純，各種化學(xué)藥品必須先以少量重蒸餾水使其充分溶解后才能混合，混合時應(yīng)注意先后重蒸餾水使其充分溶解后才能混合，混合時應(yīng)注意先后順序。特別應(yīng)將順序。特別應(yīng)將CaCa2+2+、SOSO4 42 2一一、Mg Mg

55、 2 2十十和和H H2 2POPO4 4一一等離子錯等離子錯開混合，速度宜慢，邊攪拌邊混合。開混合，速度宜慢，邊攪拌邊混合。(2)CaCl(2)CaCl2 22H2H2 2O O要在最后單獨加入，在溶解要在最后單獨加入，在溶解CaClCaCl2 22H2H2 2O O時，時，蒸餾水需加熱沸騰，除去水中的蒸餾水需加熱沸騰，除去水中的COCO2 2，以防沉淀。另外，以防沉淀。另外，CaClCaCl2 22H2H2 2O O放入沸水中易沸騰，操作時要防止其溢出。放入沸水中易沸騰，操作時要防止其溢出。、微量元素母液的配制、微量元素母液的配制MSMS培養(yǎng)基的微量元素?zé)o機鹽由培養(yǎng)基的微量元素?zé)o機鹽由7

56、7種化合物（除種化合物（除FeFe）組成。）組成。微量元素用量較少，特別是微量元素用量較少，特別是 CuSOCuSO4 45H5H2 2O O、 CoClCoCl2 26H6H2 2O O ，因此在配制中分微量因此在配制中分微量、配制。按照表配制。按照表2 2，表，表3 3配方，配方，用感量為用感量為0.0001g0.0001g的分析天平稱量，其它同大量元素。的分析天平稱量，其它同大量元素。配制培養(yǎng)基時，每配制配制培養(yǎng)基時，每配制1L1L培養(yǎng)基，取微量培養(yǎng)基，取微量10ml10ml，微，微量量mlml3 3、鐵鹽母液的配制、鐵鹽母液的配制鐵鹽不是都需要單獨配成母液，如檸檬酸鐵，只需和鐵鹽不是都

57、需要單獨配成母液，如檸檬酸鐵，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的鐵鹽是硫酸大量元素一起配成母液即可。目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨配成母亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨配成母液。這種螯合物使用起來方便，又比較穩(wěn)定，不易發(fā)液。這種螯合物使用起來方便，又比較穩(wěn)定，不易發(fā)生沉淀。配制方法同上，直接用蒸餾水加熱攪拌溶解。生沉淀。配制方法同上，直接用蒸餾水加熱攪拌溶解。配制培養(yǎng)基時，配制配制培養(yǎng)基時，配制1L1L取此液取此液10ml10ml。在配制鐵鹽時，如果加熱攪拌時間過短，會造成在配制鐵鹽時，如果加熱攪拌時間過短，會造成Fe Fe S 0S 04 4和和

58、NaNa2 2EDTAEDTA鰲合不徹底，此時若將其冷藏，鰲合不徹底，此時若將其冷藏，F(xiàn)e S Fe S 0 04 4會結(jié)晶析出。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，配制鐵鹽母液會結(jié)晶析出。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，配制鐵鹽母液時，時，F(xiàn)e S 0Fe S 04 4和和NaNa2 2EDTAEDTA應(yīng)分別加熱溶解后混合，并應(yīng)分別加熱溶解后混合，并置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色( (約加熱約加熱20 - 30 min)20 - 30 min)，調(diào)，調(diào)pHpH值至值至5 .55 .5，室溫放置冷卻后，室溫放置冷卻后，再冷藏。再冷藏。4 4、有機母液的配制、有機母液的配制MSMS

59、培養(yǎng)基的有機成分有甘氨酸、肌醇、煙酸、鹽酸硫培養(yǎng)基的有機成分有甘氨酸、肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆素。培養(yǎng)基中的有機成分原則上應(yīng)分胺素和鹽酸吡哆素。培養(yǎng)基中的有機成分原則上應(yīng)分別單獨配制。配制直接用蒸餾水溶解，注意稱量時用別單獨配制。配制直接用蒸餾水溶解，注意稱量時用電子分析天平。并貯存在棕色無菌瓶中電子分析天平。并貯存在棕色無菌瓶中 。配制生物素、葉酸，用稀氨水溶解，然后定容。配制生物素、葉酸，用稀氨水溶解，然后定容。一般植物生長調(diào)節(jié)劑母液的配制的終濃度以一般植物生長調(diào)節(jié)劑母液的配制的終濃度以0.5mg/ml0.5mg/ml為好，需要注意的是：為好，需要注意的是：（）配制生長素類，例如（

60、）配制生長素類，例如IAAIAA、NAANAA、2.4-D2.4-D、IBAIBA，應(yīng)先用少量應(yīng)先用少量95%95%乙醇或無水乙醇充分溶解，或者用乙醇或無水乙醇充分溶解，或者用1mol/L1mol/L的的NaOHNaOH溶解，然后用蒸餾水定容到一定的濃度。溶解，然后用蒸餾水定容到一定的濃度。以后者效果好。以后者效果好。（）細(xì)胞分裂素，例如（）細(xì)胞分裂素，例如KTKT，應(yīng)先用少量，應(yīng)先用少量95%95%乙醇或乙醇或無水乙醇加無水乙醇加3434滴滴1mol/L1mol/L的鹽酸溶解，或直接用的鹽酸溶解，或直接用1mol/L HCl1mol/L HCl溶解，再用蒸餾水定容。溶解，再用蒸餾水定容。（）