6第三章-抗體制藥(二)

1、第三章 抗體制藥（二）3學(xué)時(shí)三、多功能抗體及其制備近年來(lái)，在scFv（單鏈抗體）的基礎(chǔ)上，可以把兩個(gè)或兩個(gè)以上的scFv重組在一起，由此可制備成多價(jià)小分子抗體即微型抗體（簡(jiǎn)稱多價(jià)微抗）。包括雙鏈抗體（diabody），三鏈抗體（triabody），微型抗體（minibody）及四鏈抗體（tetrabody）。2第三章 抗體制藥多功能抗體及其制備雙鏈抗體制備方法：化學(xué)交聯(lián)法、粘性蛋白結(jié)構(gòu)域融合法和接頭長(zhǎng)度控制法。微型抗體：通過(guò)基因工程手段采用不同的接頭把單鏈抗體（VL-VH)的VH結(jié)構(gòu)域與IG的CH3結(jié)構(gòu)域融合，形成VL-VH-CH3的結(jié)構(gòu)。此種抗體合成后通過(guò)CH3結(jié)構(gòu)域形成穩(wěn)定的二聚體形式，發(fā)

2、揮其雙價(jià)微抗的作用。三鏈抗體：在制備單鏈抗體時(shí)，當(dāng)接頭的長(zhǎng)度為2個(gè)或2個(gè)以下氨基酸殘基時(shí)，或者直接把VH結(jié)構(gòu)域N末端與VL結(jié)構(gòu)域C末端相連，通過(guò)非共價(jià)鍵而形成三聚體，稱三鏈抗體。3第三章 抗體制藥 4第三章 抗體制藥抗體融合蛋白抗體的一部分被非抗體序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性，稱之為抗體融合蛋白。根據(jù)構(gòu)建方式的不同，抗體融合蛋白主要分為兩種形式：5第三章 抗體制藥構(gòu)建抗體融合蛋白的原則 將第一個(gè)蛋白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第二個(gè)蛋白基因，即可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因的共表達(dá)?？贵w酶，酶-抗體型融合蛋白，在藥物治療中有廣闊的前景，它可在靶向位置上將前體藥物轉(zhuǎn)化成有效的藥物，從而避免

3、了對(duì)正常組織的損害。6第三章 抗體制藥四、基因工程抗體和抗體工程抗體研究的三大階段： 1890年白喉抗毒素多克隆抗體； 1975年雜交瘤技術(shù)單克隆抗體； 1994年開(kāi)始基因工程抗體基因工程抗體：不用人工免疫動(dòng)物和細(xì)胞融合技術(shù)，完全用基因工程技術(shù)制備人源性抗體，而且還能利用基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)技術(shù)，通過(guò)細(xì)菌發(fā)酵或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、植物大規(guī)模生產(chǎn)抗體。7第三章 抗體制藥 8第三章 抗體制藥噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的基本方法 獲取目的基因抗體庫(kù)技術(shù)的載體淘篩表達(dá)與鑒定9第三章 抗體制藥獲取目的基因和載體獲取目的基因：提取mRNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR獲取抗體某一特定基因區(qū)段，抗體基因的組合形式多為單鏈抗體?？贵w庫(kù)技術(shù)的載體：

4、噬菌體載體具有噬菌體和質(zhì)粒的共同特點(diǎn)。 10第三章 抗體制藥淘篩、表達(dá)與鑒定淘篩：抗原固相化后，對(duì)噬菌粒群的吸附、洗滌和洗脫后再感染擴(kuò)增，與輔助噬菌體超感染獲得大容量次級(jí)文庫(kù)，反復(fù)使目的克隆大量擴(kuò)增。表達(dá)與鑒定：目的克隆經(jīng)過(guò)鑒定后，再導(dǎo)入感受態(tài)菌，進(jìn)行可溶性表達(dá)。 11第三章 抗體制藥噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)12第三章 抗體制藥噬菌體抗體庫(kù)的分類13第三章 抗體制藥噬菌體展示技術(shù)14第三章 抗體制藥 15第三章 抗體制藥噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的特點(diǎn)模擬天然全套抗體庫(kù)避開(kāi)了人工免疫和雜交瘤技術(shù)可獲得高親和力的人源化抗體。16第三章 抗體制藥噬菌體展示技術(shù)最關(guān)鍵的優(yōu)勢(shì)17第三章 抗體制藥噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)1

5、8第三章 抗體制藥單克隆抗體雜交瘤技術(shù)和噬菌體抗體展示技術(shù)比較19第三章 抗體制藥基因工程抗體的表達(dá) 原核生物：大腸桿菌，分 融合表達(dá)和分泌表達(dá)；真核生物：都是分泌表達(dá)，有酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞和真菌。轉(zhuǎn)基因植物： 煙草轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：?jiǎn)位蛩健?0第三章 抗體制藥抗體在體外人源化存在的問(wèn)題操作過(guò)程復(fù)雜成本高抗體的親和力降低抗體不是人體免疫系統(tǒng)自然產(chǎn)生異源抗體與免疫系統(tǒng)的配合21第三章 抗體制藥 最理想的單克隆抗體：100人源化，由人體免疫系統(tǒng)自然產(chǎn)生。全人抗體的理論基礎(chǔ)：癌癥、病毒、細(xì)菌對(duì)機(jī)體而言均為異己物；人體不斷受異己物攻擊，但免疫系統(tǒng)通常有清除能力；免疫系統(tǒng)通過(guò)體液免疫和細(xì)胞免疫

6、對(duì)異己物做出反應(yīng)；體液免疫就是針對(duì)異己物天然地產(chǎn)生抗體。全人抗體面臨的關(guān)鍵問(wèn)題：持續(xù)分泌抗體的人B細(xì)胞、抗體分泌細(xì)胞的保持。22第三章 抗體制藥 23第三章 抗體制藥 24第三章 抗體制藥 25第三章 抗體制藥 26第三章 抗體制藥 27第三章 抗體制藥 28第三章 抗體制藥 29第三章 抗體制藥 30第三章 抗體制藥五、抗體診斷試劑抗原和抗體的特異性結(jié)合在體內(nèi)和體外都可呈現(xiàn)某種反應(yīng)。在體內(nèi)可表現(xiàn)為溶菌、殺菌、促進(jìn)吞噬或中和毒素等作用，可作為藥物用于治療；在體外可發(fā)生凝集或沉淀等反應(yīng)，可用已知抗體來(lái)鑒定抗原，作病原學(xué)的診斷和血型測(cè)定。31第三章 抗體制藥抗體診斷藥物分類 三類： 血清學(xué)鑒定用的

7、抗體類試劑 免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑 導(dǎo)向診斷藥物32第三章 抗體制藥血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑 血清學(xué)鑒定 是指用已知抗體來(lái)鑒定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌的診斷和血型鑒定。常用凝集反應(yīng)。33第三章 抗體制藥鑒定病原菌的抗體試劑用單克隆抗體可以檢測(cè)出多種病毒中非常細(xì)微的株間差異；鑒定細(xì)菌的種型和亞種，這是傳統(tǒng)血清法或動(dòng)物免疫幅所做不到的，而且診斷異常準(zhǔn)確。還可以檢查出某些還尚無(wú)臨床表現(xiàn)的極小腫瘤病灶，檢測(cè)心肌梗死的位置和面積，為有效治療提供方便。34第三章 抗體制藥常用品種和用途 診斷血清 分群血清 分型血清 因子血清 沙門氏菌屬診斷血清志賀氏菌屬診斷血清 病原性大腸埃希氏菌診斷血清3

8、5第三章 抗體制藥診斷血清的制備步驟制備細(xì)菌抗原：細(xì)菌接種、培養(yǎng)、收集菌苔、制成菌液；免疫動(dòng)物和制備抗體血清：動(dòng)物有家兔、馬、羊、豚鼠；免疫途徑：靜脈、腹腔、皮下。接種次數(shù)37次，每次間隔34天，末次注射后68天取血樣測(cè)效價(jià)，達(dá)到要求，即可采血，離心分離血清。診斷血清的診斷方法：直接凝集反應(yīng)36第三章 抗體制藥 37第三章 抗體制藥乙型肝炎病毒表面抗原的反向被動(dòng)血凝診斷試劑 38第三章 抗體制藥妊娠診斷試劑 婦女妊娠后，血液和尿液中的HCG（human chorionic gonadotrophin，人絨毛膜促性腺激素）含量增高，在3個(gè)月內(nèi)達(dá)到高峰。此時(shí)檢測(cè)尿液中的HCG，就可確定是否懷孕。3

9、9第三章 抗體制藥抗ABO血型系統(tǒng)血清按照人紅細(xì)胞帶有的A或B種凝集原，可將血型分為A、B、AB和O型4種。ABO血型抗血清的制備：1、人源性ABO 血型抗血清是采集健康獻(xiàn)血人的血液，凝固后，置4 度過(guò)夜，使冷抗體吸附在血塊上一起除掉。2、動(dòng)物源性ABO 血型抗血清是用人血型物質(zhì)A 和B 免疫馬得到的。3、單克隆抗體是應(yīng)用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)抗A 或抗B血清。血型鑒定的方法：玻片直接凝集法。 40第三章 抗體制藥 41第三章 抗體制藥免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑給抗體標(biāo)記放射性核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應(yīng)放大，使常規(guī)不能觀察的反應(yīng)得以顯現(xiàn)，可對(duì)微量抗體進(jìn)行定性定量測(cè)定，靈敏度高。結(jié)

10、合顯微鏡技術(shù)，還可對(duì)抗原物質(zhì)作出組織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的定位測(cè)定。除臨床診斷外，還能為探討發(fā)病機(jī)制提供手段。42第三章 抗體制藥熒光抗體診斷試劑是用熒光色素，如異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明（RB200）、藻紅素（PE）等標(biāo)記抗體蛋白，即成熒光抗體。用熒光抗體浸染含有抗原物質(zhì)的組織切片或細(xì)胞，熒光抗體就與抗原結(jié)合，在顯微鏡下成為發(fā)光的可視物，從而達(dá)到診斷和定位的目的。43第三章 抗體制藥免疫酶抗體診斷試劑用酶標(biāo)記抗體來(lái)檢測(cè)抗原，有免疫酶染法和酶免疫測(cè)定。目前有： HBsAg酶標(biāo)診斷試劑、HBeAg酶標(biāo)診斷試劑、HAVAg（甲型肝炎病毒抗原） 酶標(biāo)診斷試劑、測(cè)定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶標(biāo)抗體

11、診斷試劑、甲胎蛋白（AFP）酶標(biāo)抗體診斷試劑、癌胚抗原（CEA）的酶標(biāo)抗體診斷試劑。44第三章 抗體制藥放射免疫用抗體診斷試劑 放射免疫技術(shù)是將放射性核素分析的高度靈敏性與抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái)建立的檢測(cè)技術(shù)。能測(cè)出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物質(zhì)。45第三章 抗體制藥導(dǎo)向診斷藥物以抗體為載體的導(dǎo)向診斷藥物的研究比導(dǎo)向治療更接近臨床應(yīng)用階段。放射性免疫顯像的優(yōu)點(diǎn)：在體內(nèi)有確切定位腫瘤的作用；在體內(nèi)可檢出0.5 厘米大小的病灶；小分子抗體容易到達(dá)腫瘤部位；抗體在腫瘤部位可保留6-9 日；能觀察抗體在血中的半衰期和可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。46第三章 抗體制藥六、抗體治療藥物以抗體為載

12、體的導(dǎo)向治療藥物研究已有20多年的歷史，已制備出百余種單克隆抗體，鑒定出數(shù)十種與腫瘤有關(guān)的抗原，受試病人超過(guò)數(shù)千例。但治療用的制劑尚沒(méi)有一種達(dá)到商品化的程度。在治療藥物中，單克隆抗體與毒素的偶聯(lián)物治療淋巴瘤效果最佳，但有效率僅30。目前的客觀現(xiàn)實(shí)：研究進(jìn)展迅速，但未達(dá)到常規(guī)治療的應(yīng)用階段。原因：抗體相對(duì)分子量大，穿透力低，不能達(dá)到靶部位或攝取量低；鼠源性抗體的排斥反應(yīng)。47第三章 抗體制藥放射性核素標(biāo)記的抗體治療藥物抗體作為放射性核素的導(dǎo)向載體。操作簡(jiǎn)單、用量小，且能觀察到藥物在體內(nèi)的分布和藥物動(dòng)力學(xué)。放射性標(biāo)記的抗體有較大的殺傷范圍，有利于克服腫瘤表面抗原的異質(zhì)性，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷也不依賴抗

13、原抗體結(jié)合后的吸收作用，由于分子量小，容易穿透到達(dá)腫瘤部位。 48第三章 抗體制藥抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物 常用抗癌藥 氨甲喋呤、阿霉素、絲裂霉素、環(huán)磷酰胺等，以人血清白蛋白為中間載體，可明顯提高每分子抗體所攜帶的氨甲喋呤量，使體外細(xì)胞毒性提高倍?？贵w類藥物的逆轉(zhuǎn)耐藥性 腫瘤細(xì)胞對(duì)抗原藥物可產(chǎn)生多藥耐藥性。 49第三章 抗體制藥抗體類藥物逆轉(zhuǎn)耐藥性腫瘤細(xì)胞對(duì)抗原藥物可產(chǎn)生多藥耐藥性（MDR）。MDR是由基因調(diào)控的，其編碼蛋白稱為P糖蛋白，其中P170是與腫瘤耐藥相關(guān)的主要蛋白，由Mdr1基因編碼，1280氨基酸殘基，分子量170K。認(rèn)為P蛋白是ATP酶依賴性藥泵，藥物進(jìn)入細(xì)胞后與P蛋白結(jié)合，利用

14、ATP水解釋放的能量將藥物泵出胞外，使胞內(nèi)藥物蓄積減少，因而產(chǎn)生耐藥性。50第三章 抗體制藥毒素偶聯(lián)的抗體藥物 免疫毒素及其換代制品 毒素和抗體的交聯(lián)物稱為免疫毒素。第一代免疫毒素是包含有A、B 鏈的完整的毒素和抗體的交聯(lián)物，應(yīng)用有限，第二代免疫毒素利用抗體或抗體片段與毒素作用，在體內(nèi)有一定的抗腫瘤作用；第三代免疫毒素重組免疫毒素，特異性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，滲透性好，免疫原性低，可大量制備。51第三章 抗體制藥免疫毒素的制備 來(lái)源：主要是細(xì)菌毒素和植物毒素。載體種類：小分子抗體FV和SCFV；細(xì)胞生長(zhǎng)因子可與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合；激素，可識(shí)別細(xì)胞表面的受體；CD4可識(shí)別HIV表達(dá)的糖蛋白。先克隆出細(xì)胞

15、基因，再利用基因重組技術(shù)去除毒素中非特異性結(jié)合部位基因，經(jīng)過(guò)改造的毒素基因再與載體基因的互補(bǔ)DNA 重組，轉(zhuǎn)入受體菌中表達(dá)，形成融合蛋白，再經(jīng)純化可得到重組的免疫毒素。52第三章 抗體制藥免疫毒素的臨床應(yīng)用 可用于治療腫瘤、自身免疫病、并能克服組織移植排斥反應(yīng)。可單獨(dú)給藥也可包裹在脂質(zhì)體及其他微粒中給藥，在胞漿物質(zhì)代謝中發(fā)揮作用。對(duì)分子量小，滲透力強(qiáng)、效果好。 53第三章 抗體制藥單克隆抗體生產(chǎn)工藝實(shí)例 抗HBsAg的單克隆抗體生產(chǎn)工藝抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)單克隆抗體是專一性識(shí)別HBsAg 的單一抗體，能與HBsAg 產(chǎn)生免疫反應(yīng)。 臨床上用于檢測(cè)乙型肝炎病毒的感染并用于生產(chǎn)預(yù)防乙肝

16、的免疫制劑。目前生產(chǎn)抗HBsAg的單克隆抗體技術(shù)有基因工程與細(xì)胞工程。54第三章 抗體制藥 免疫大鼠脾淋巴細(xì)胞與大鼠骨髓瘤的IR983F 細(xì)胞融合技術(shù)制造抗HBsAg單克隆抗體的工藝。55第三章 抗體制藥工藝流程 大鼠骨髓瘤細(xì)胞免疫大鼠脾淋巴細(xì)胞融合混合物雜種細(xì)胞混合物雜交瘤克隆系細(xì)胞種質(zhì)培養(yǎng)液粗制McAb層析液濃縮液 McAb精品56第三章 抗體制藥工藝過(guò)程 培養(yǎng)基 大鼠骨髓瘤IR983 F 細(xì)胞系的培養(yǎng)基為改良的DMEM培養(yǎng)甚。是使Eagle培養(yǎng)基中15 種氨基酸濃度增加l 倍，8 種維生素濃度增加3 倍而成，用于細(xì)胞培養(yǎng)，提高了細(xì)胞生長(zhǎng)效果。 其中尚需10%滅活小牛血清，1%非必需氨基酸

17、，0.1molL 丙酮酸鈉，1%谷氨酰胺及50mgmI 慶大霉素；雜交瘤細(xì)胞篩選系統(tǒng)用含HAT 的DMEM 培養(yǎng)基。 57第三章 抗體制藥 飼養(yǎng)細(xì)胞制備： 在細(xì)胞融合前23 天，取健康大鼠處死，向腹腔內(nèi)注入10mlDMEM 培養(yǎng)液輕壓腹腔使細(xì)胞懸浮，打開(kāi)腹壁皮膚，暴露腹膜，提起腹膜中心，插入注射針頭，吸出全部細(xì)胞懸液，500g 離心5min，用pH7.4，0.1molL 磷酸緩沖液洗滌2-3 次，收集細(xì)胞，用含10小牛血清、100Uml 青霉素和鏈霉素及HAT 的DMEM 培養(yǎng)液制成106 細(xì)胞ml 懸浮液，使用24 孔板時(shí)，每孔加0.1ml，當(dāng)使用96 孔板時(shí)，則制成2x105 細(xì)胞ml 的

18、懸浮液，每孔加0.1m!，然后置37的CO，培養(yǎng)箱中溫育，備用。 58第三章 抗體制藥 親本細(xì)胞準(zhǔn)備： 取對(duì)8氮鳥(niǎo)嘌呤抗性的Louc 大鼠非分泌型漿細(xì)胞瘤IR983F 細(xì)胞，用常規(guī)方法制成細(xì)胞懸浮液，按1.5x105 細(xì)胞 ml 接種量接種于DMEM 培養(yǎng)液中，于37CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，經(jīng)常規(guī)消化分散法用DMEM 培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸浮液，即為待融合用骨髓瘤細(xì)胞親本，備用。 另取HBsAg 用pH7.4，0.1molL 磷酸緩沖液溶解并稀釋成20gml 的溶液，加等體積福氏完全佐劑充分乳化后，取2ml 注入Louc 大鼠腹腔，2 周后進(jìn)行第2 次免疫，3 個(gè)月后于融合前34 天進(jìn)行加

19、強(qiáng)免疫 。59第三章 抗體制藥 于細(xì)胞融合前處死大鼠，用碘酒棉球及酒精棉球先后對(duì)右上腹部消毒，剖開(kāi)腹部，用無(wú)菌剪刀與鑷子取出脾臟，用pH7.4，0.1molL 磷酸緩沖液洗去血液，在無(wú)菌燒杯或培養(yǎng)皿中切成1mm3 小塊，再用磷酸緩沖液洗滌34 次，直至澄清，傾去洗滌液，加入組織塊56 倍體積(質(zhì)量體積)的0.25%胰蛋白酶溶液(pH7.67.8)于37 度保溫，消化20 一40min，每10min 輕搖消化瓶1 次，直至組織塊松軟為止，傾去胰蛋白酶溶液，再用上述磷酸緩沖液洗滌35 次，然后加入少量磷酸緩沖液用10ml 吸管吹打分散，至大部分組織塊分散為細(xì)胞，用兩層無(wú)菌紗布過(guò)濾，未分散的組織塊再

20、加少量磷酸緩沖液吹打和分散，合并細(xì)胞濾液，離心收集細(xì)胞并用磷酸緩沖液洗滌23 次，然后用無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)液稀釋制成細(xì)胞懸浮液，即為免疫大鼠脾淋巴細(xì)胞親本，備用。60第三章 抗體制藥 固定化抗大鼠K 輕鏈單抗的制備： 載體也為Sepharose 4B，其活化方法與制備固定化t-PA 相同。取30g 活化的Sepharose 4B 懸浮于100ml，pH10.2，0.025mol/L 硼酸緩沖液中，另取1g 抗大鼠K 輕鏈的McAb(MARK-1)溶于25ml 硼酸緩沖液，然后加至上述已活化的Sepharose 4B 懸浮物中，于10 度攪拌反應(yīng)1620h，將其裝柱(直徑2cm*50cm)并

21、用10 倍柱床體積(體積體積)的上述硼酸緩沖液以56mlmin 流速洗滌柱床，收集流出液，測(cè)A280 并根據(jù)流出液計(jì)算偶聯(lián)效率然后依次用5 倍柱床體積(體積體積)的pH10，0.1mol/L 乙醇胺溶液及pH8.0，0.1molL 硼酸緩沖液充分洗滌最后用pH7.4，0.1mo/L 磷酸緩沖液洗至流出液A280 小于0.01，即得抗HBsAg McAb 的親和吸附劑，將其轉(zhuǎn)移至含0.01NNaN3 的pH7.4，0.1mol 磷酸緩沖液中，于4貯存，備用。61第三章 抗體制藥 細(xì)胞融合： 取107 個(gè)IR983 F 細(xì)胞與108 個(gè)免疫大鼠脾淋巴細(xì)胞于50mi 離心管中，混勻，在4 度下，15

22、00rmin 離心810min，用巴斯德吸管小心吸去上清液，輕彈管底，使沉淀的細(xì)胞松動(dòng)，于37 度水浴中保溫，并于lmin 內(nèi)輕輕滴加0.8ml 50%PEG4000，同時(shí)用吸管尖輕輕攪動(dòng)6090s，然后于2min 內(nèi)緩慢滴加20mlDMEM 培養(yǎng)液，1500rmin 離心810min，吸去上清液，然后再用含20%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液稀釋至50ml，制成細(xì)胞懸浮液，得細(xì)胞融合混合物。 62第三章 抗體制藥 雜交瘤細(xì)胞篩選： 篩選產(chǎn)生抗HBsAg 單抗的雜交瘤細(xì)胞的方法是用AUSAB 酶免疫試劑盒測(cè)定表達(dá)抗體的細(xì)胞，即將包被了人HBsAg 的聚苯乙烯珠與待測(cè)雜交瘤培養(yǎng)上清培育，然后用磷酸緩沖液洗滌34 次，加入用生物素偶聯(lián)的HBsAg 培育后洗滌，再加過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素培育，