211210 RT-LAMP MasterMix（熒光染料法）使用手冊v1

1、天凈沙系列CAT#:211210-50低溫運(yùn)輸，-20保存RT-LAMP MasterMix（熒光染料法）使用手冊V1.0江蘇天凈沙基因診斷技術(shù)有限公司網(wǎng)址： HYPERLINK ；電話：400-6005850；電郵：order產(chǎn)品及特點(diǎn)RT-LAMP MasterMix（熒光染料法）含有熒光RT-LAMP擴(kuò)增所需的所有成分，可以用于實(shí)時熒光（但非定量）RT-LAMP等溫擴(kuò)增。RT-LAMP即Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification（逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增），它利用4條模板專一的特異引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和具有鏈置換能力的

2、Bst DNA 聚合酶，在等溫條件下(65左右) 3060分鐘完成逆轉(zhuǎn)錄和LAMP擴(kuò)增。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標(biāo)上能媲美甚至優(yōu)于定性RT-PCR技術(shù)。目前已成功應(yīng)用于生物的快速檢測，廣泛用于各個領(lǐng)域。本試劑盒具有下列特點(diǎn)：即開即用，含有LAMP專用的熒光染料，可以進(jìn)行實(shí)時熒光檢測（需要熒光PCR儀），但不建議用于定量分析。高特異性，精心優(yōu)化的配方，非特異擴(kuò)增比自配的試劑更低。高擴(kuò)增效率，一般比RT-PCR靈敏一個數(shù)量級。65左右同時完成逆轉(zhuǎn)錄和等溫擴(kuò)增，一步式操作。本試劑盒足夠50次20uL體系的實(shí)時熒光RT-LAMP擴(kuò)增。提供擴(kuò)增對照，便于在遇到困難時分析原因。20uL體系最多

3、可以使用13uL樣本，減少漏檢。本產(chǎn)品只能用于科研，不能用于臨床。規(guī)格及成分本試劑盒使用5孔盒包裝成份編號規(guī)格包裝材料RT-LAMP MasterMix（熒光染料法，待加酶） 211210a200uL0.5mL白蓋管逆轉(zhuǎn)錄酶-擴(kuò)增酶混合液211208b100uL0.5mL紅蓋管LAMP陽性對照模板-引物混合物22040250uL0.5mL藍(lán)蓋管使用手冊211210sc1份無運(yùn)輸及保存低溫運(yùn)輸，-20保存，有效期一年。自備試劑RNA模板、RT-LAMP引物使用方法制備模板RNA：用于選用合適的方法制備模板RNA。如果有N個樣品，最好設(shè)置N+2個樣品制備，多出的兩個一個是樣品制備陽性對照，一個是樣

4、品制備陰性對照。配制20RT-LAMP引物混合液。先加超純水將合成的HPLC級別的下列引物干粉稀釋到下表所標(biāo)注的母液濃度，然后在一新的離心管中按表中所列體積加入各種引物母液和超純水，最后得到0.1mL的20RT-LAMP引物混合液，此混合液足夠100次20uL體系的RT-LAMP擴(kuò)增。如果需要配制的20RT-LAMP引物混合液體積異于0.1mL，則各成分的用量請按比例調(diào)整。引物混合液可以在-20放置2年。引物名稱母液濃度加母液量在20LAMP引物混合液中的濃度FIP引物100 uM32uL32 uMBIP引物100 uM32 uL32 uMF3引物100 uM4 uL4 uMB3引物100 u

5、M4 uL4 uMLoop F100 uM8 uL8 uMLoop B100 uM8 uL8 uM超純水12 uL終體積0.1mL注：如果沒有Loop引物，則用水替代。在冰上融化RT-LAMP MasterMix（熒光染料法，待加酶），混勻，稍離心。第一次使用時，請將100uL逆轉(zhuǎn)錄酶-擴(kuò)增酶混合液全部加入到RT-LAMP MasterMix中并輕柔顛倒混勻1分鐘，然后再使用。如果有N個樣品，則在N+2個反應(yīng)管中加入以下組份，多出的一管是RT-LAMP擴(kuò)增陽性對照（PC），一管是RT-LAMP擴(kuò)增陰性對照（NC）：成份N+2個樣品管RT-LAMP擴(kuò)增PCRT-LAMP擴(kuò)增NCRT-LAMP M

6、asterMix（含熒光染料，加酶后）6 uL6 uL6 uL自備20RT-LAMP引物混合液1 uL 不加1 uLLAMP陽性對照模板-引物混合物不加4 uL不加自備模板RNA1-13uL不加不加補(bǔ)自備超純水到20 uL20 uL20 uL混勻，放熒光定量PCR儀器上65保溫90分鐘，每分鐘采集一次SYBR通道的熒光信號。結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)有效性判定。如果兩個陽性對照能夠得到標(biāo)準(zhǔn)的S型擴(kuò)增曲線而兩個陰性對照都沒有擴(kuò)增，則實(shí)驗(yàn)有效，才有必要對樣品進(jìn)行分析。如果陽性對照沒有出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，則說明試劑盒可能失效，實(shí)驗(yàn)無效。如果陰性對照有S型擴(kuò)增曲線，則說明LAMP引物設(shè)計得不好，有非特異擴(kuò)增，需要重新優(yōu)化引物。也可能是環(huán)境或試劑有污染，實(shí)驗(yàn)無效。遇到實(shí)驗(yàn)無效的情況，請跟廠家客戶聯(lián)系，分析原因后再恢復(fù)實(shí)驗(yàn)。如果實(shí)驗(yàn)有效，則分析樣品。凡是有S擴(kuò)增曲線的，