雙向電泳蛋白樣品的制備

1、雙向電泳樣本制備 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-16631一、蛋白質(zhì)提取原則：二、樣本裂解方式：三、2D蛋白裂解液組成及作用： 1：裂解液組成及作用 2：常見(jiàn)裂解液四、蛋白質(zhì)提取步驟：五、蛋白質(zhì)樣本制備實(shí)例： 1：動(dòng)物組織樣本制備 2：植物組織樣本制備六、樣本制備試劑：雙向電泳樣品制備： 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-166321: 蛋白質(zhì)制備主要目的： (1)：細(xì)胞，組織的破碎裂解 (2)：蛋白質(zhì)溶解以及破壞蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子之間，蛋白質(zhì)與 非蛋白質(zhì)之間的共價(jià)與非共價(jià)相互作用2: 蛋白質(zhì)制備主要遵循的原則： (1)：盡可能溶解全部蛋白質(zhì)，打斷蛋白質(zhì)之間的共價(jià)結(jié)合，使

2、蛋白質(zhì)以分離的多肽形式存在。 (2)：避免蛋白質(zhì)的修飾作用與蛋白質(zhì)的降解作用。 (3)：避免脂類、核酸、鹽等物質(zhì)的干擾作用。 (4): 去除高豐度蛋白對(duì)低分度蛋白的掩蓋作用。 (5): 防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白質(zhì)的聚集和沉淀。 (6)：蛋白質(zhì)樣品與第一向電泳的相容性。一、雙向電泳樣本制備原則 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-16633破碎的方法適用材料原理滲透裂解 血細(xì)胞組織培養(yǎng)細(xì)胞 將細(xì)胞懸浮在低滲透液中裂解細(xì)胞。凍融裂解 細(xì)菌細(xì)胞組織培養(yǎng)細(xì)胞 利用液氮將細(xì)胞迅速凍結(jié)后再融化。如果需要，可反復(fù)進(jìn)行。去垢劑裂解 組織培養(yǎng)細(xì)胞 去污劑能溶解細(xì)胞的細(xì)胞膜從而破壞細(xì)胞。注：如果使用了諸如S

3、DS這樣的離子型去污劑，為了確保不干擾IEF，可將裂解的樣品在含有過(guò)量的非離子或兼性去污劑的溶液中稀釋或利用沉淀法, 除去SDS。酶裂解 植物組織細(xì)菌細(xì)胞真菌細(xì)胞 在等滲透液溶液中用酶處理細(xì)胞。如溶菌酶用于細(xì)菌細(xì)胞；纖維素酶和果膠酶用于植物細(xì)胞）。二、雙向電泳樣本裂解方式溫和裂解方式4破碎方法適用材料原理超聲波法：細(xì)胞懸浮液 通過(guò)超聲波發(fā)生器產(chǎn)生的超聲波剪切力將細(xì)胞破碎，但必須注意減少熱量的產(chǎn)生和泡沫的形成。高壓法： 帶細(xì)胞壁的微生物在高壓情況下通過(guò)小孔對(duì)細(xì)胞施加壓力產(chǎn)生的剪切力破碎細(xì)胞研磨法： 固體組織微生物利用研杵手工將它們破碎機(jī)械勻槳法： 固體組織 可用手動(dòng)勻漿器或電動(dòng)勻漿器能來(lái)破碎細(xì)胞

4、懸浮液或較柔軟的組織。滾珠粉碎法：細(xì)胞懸浮液微生物 旋轉(zhuǎn)玻璃球的摩擦作用能破壞細(xì)胞壁，并釋放細(xì)胞的內(nèi)含物。二、雙向電泳樣本裂解方式劇烈裂解方式 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-16635 組成種類 作用 變性劑脲、硫脲、兩者的混合物 破壞氫鍵等次級(jí)鍵，使肽鏈鏈伸展，暴露疏水中心去垢劑 非離子去垢劑、兩性離子去垢劑、陰離子去垢劑破壞蛋白質(zhì)分子間的疏水相互作用。 還原劑-巰基乙醇，二硫蘇糖醇（DTT）, TBP 斷裂蛋白質(zhì)中的二硫鍵，以利于肽鏈的分離蛋白酶抑制劑PMSF,AEBSF,EDTA,多肽蛋白酶抑制劑，磷酸酶酶抑制劑抑制蛋白酶活性三、雙向電泳樣本制備裂解液組成及作用 輝駿生物：

5、免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-166361、變性劑： (1) 作用：改變或破壞氫鍵等次級(jí)鍵的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)的肽鏈伸展 開(kāi)來(lái)，充分暴露疏水中心。 (2) 分類：脲，硫脲，或兩者的混合物可以增加蛋白質(zhì)的溶解性，特 別是膜蛋白。必須避免將含有尿素的溶液加熱到30度以上， 因?yàn)檫@樣會(huì)使其水解為氰酸鹽，修飾蛋白質(zhì)，改變蛋白質(zhì)的 電荷。 三、雙向電泳樣本制備裂解液組成及作用 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-166372、去垢劑： (1) 作用：破壞蛋白質(zhì)分子間的疏水相互作用。 (2) 種類： a: 非離子去垢劑：triton X-100, NP-40 b: 兩性離子去垢劑： CHAPS,CHAP

6、SO SB3-10(不溶于濃度高于5mol/L的脲中） ASB(具有比CHAPS更強(qiáng)的膜蛋白溶解力） c: 陰離子去垢劑：SDS（小于0.25%，同時(shí)確保其他去垢劑與SDS的比例至少為8：1） 三、雙向電泳樣本制備裂解液組成及作用 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-166383、還原劑： (1) 作用：斷裂蛋白質(zhì)中的二硫鍵，以利于肽鏈的分離。 (2) 分類: -巰基乙醇，二硫蘇糖醇（DTT）,二硫赤蘚糖（DTE） a: 其中DTT帶有電荷，在等點(diǎn)聚焦時(shí)，常常會(huì)遷移到PH范圍 以外，從而使某些蛋白質(zhì)的二硫鍵重新配對(duì)，使溶解度降低而重新沉淀下來(lái)。使用濃度范圍10100 mmol/L. b:

7、 采用非離子還原劑三丁基膦TBP可以大大增加蛋白質(zhì)的溶解性，并利于蛋白從第一向轉(zhuǎn)移到第二向。但是TBP在水溶液中的不穩(wěn)定性和不溶性，使其在第一向IEF中維持蛋白質(zhì)還原狀態(tài)是相對(duì)無(wú)效的。因此在IEF時(shí)建議最好使用巰基還原劑。三、雙向電泳樣本制備裂解液組成及作用 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-16639種類作用PMSF不可逆地抑制絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶EDTA，EGTA 可逆的蛋白酶抑制劑（如亮抑蛋白酶肽，胃蛋白酶抑制劑）多肽蛋白酶抑制劑 逆的蛋白酶抑制劑（如亮抑蛋白酶肽，胃蛋白酶抑制劑）磷酸酶抑制劑抑制磷酸酶活性Benzamidine抑制絲氨酸蛋白酶。4、蛋白酶抑制劑的種類及作用：三

8、、雙向電泳樣本制備裂解液組成及作用 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-166310 1、 提取前準(zhǔn)備： （1）: 提取總蛋白，亞細(xì)胞蛋白； （2）: 裂解細(xì)胞的方式選擇； （3）: 裂解液的選擇。 2、 加入裂解液，冰上放置一段時(shí)間。 3、 離心去沉淀，收集上清蛋白。 4、 用于二維電泳時(shí)，考慮是否有必要除去干擾物質(zhì)，如核酸， 脂類，鹽等。三、雙向電泳樣本制備簡(jiǎn)要實(shí)驗(yàn)步驟 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-166311五、雙向電泳樣本制備實(shí)例動(dòng)物樣本 （1）將組織切細(xì)后置于研缽中，迅速加入液氮進(jìn)行研磨，直至組織變成粉末，均勻而沒(méi)有明顯顆粒即可。 （2）在研缽中加入800LB（使

9、用前加入1 PMSF），充分溶解（收集）粉末后轉(zhuǎn)移至1.5mLEP管中，4，12000r/min，離心20min，收集上清液。 （3）超聲處理，破碎核酸。每個(gè)EP管超聲3次，每次58下，然后進(jìn)行離心，4，12000r/min，離心20min，收集上清液。 （4）將上清液分裝成3管，每管約250L，每管再加入1mL丙酮-20沉淀過(guò)夜。沉淀完的蛋白質(zhì)于4，12000r/min，離心20min，倒去上清液后，平放于干凈的紙巾上自然干燥，即可得到處理后的蛋白質(zhì)團(tuán)塊，-80保存?zhèn)溆谩?(5)在干燥后的蛋白質(zhì)團(tuán)塊中加入相應(yīng)量的RB（具體加入量視蛋白團(tuán)塊大小而定），用槍頭將蛋白質(zhì)團(tuán)塊戳小后反復(fù)吹打直至蛋白質(zhì)

10、完全溶解。對(duì)于太過(guò)干燥的蛋白質(zhì)團(tuán)塊（呈透明狀），可用50L移液器調(diào)至10L刻度處，吸上一點(diǎn)RB封住槍頭，然后反復(fù)的將蛋白質(zhì)團(tuán)塊戳小，再用超聲儀處理，直至看不到明顯的蛋白質(zhì)團(tuán)塊為止。4，12000r/min，離心20min，吸出上清液，轉(zhuǎn)移至新的EP管中。 12五、雙向電泳樣本制備實(shí)例植物樣本 （1）植物樣本置于研缽中，迅速加入液氮進(jìn)行研磨，直至組織變成粉末，均勻而沒(méi)有明顯顆粒即可，在研缽中加入一小勺PVPP（用于吸附植物組織破碎后釋放出的酚類物質(zhì)），用藥勺將粉末轉(zhuǎn)移至50mL離心管中。 （2）在50mL離心管中加入8mL提取液混勻，再加入8mLTris飽和酚，充分振蕩后放置于冰上，每隔5min

11、振蕩一次，總共6次，45000r/min，離30min，此時(shí)溶液會(huì)分層，下層為水相，上層為酚相，吸出上層液體，轉(zhuǎn)移到15mL離心管中。 （3）加入與酚相同體積的提取液，充分振蕩后放置于冰上，每隔5min振蕩一次，總共6次，4，5000r/min，離心30min，吸出上層酚相，轉(zhuǎn)移至新的15mL離心管中。重復(fù)一次苯酚抽提。 （4）加入最后得到的酚的5倍體積的醋酸銨甲醇溶液對(duì)蛋白進(jìn)行沉淀，充分振蕩后置于冰上保溫每隔5min振蕩一次，總共6次，于-20沉淀過(guò)夜。 （5）對(duì)沉淀過(guò)夜的蛋白質(zhì)4，5000r/min，離心30min，倒掉上清液，加入5mL甲醇對(duì)蛋白進(jìn)行洗滌，反復(fù)吹打均勻后，4，5000r/

12、min，離心30min。重復(fù)一次。13五、雙向電泳樣本制備實(shí)例：（6）加入4mL丙酮對(duì)蛋白進(jìn)行洗滌，反復(fù)吹打均勻后，4，5000r/min，離心30min。重復(fù)一次操作。加入3mL丙酮，吹打均勻后將蛋白質(zhì)平均分到3支1.5mLEP管中，4，12000r/min，離心20min。倒去上清液后，平放于干凈的紙巾上自然干燥，即可得到處理后的蛋白質(zhì)團(tuán)塊，-80保存?zhèn)溆谩?(7)在干燥后的蛋白質(zhì)團(tuán)塊中加入相應(yīng)量的RB（具體加入量視蛋白團(tuán)塊大小而定），用槍頭將蛋白質(zhì)團(tuán)塊戳小后反復(fù)吹打直至蛋白質(zhì)完全溶解。對(duì)于太過(guò)干燥的蛋白質(zhì)團(tuán)塊（呈透明狀），可用50L移液器調(diào)至10L刻度處，吸上一點(diǎn)RB封住槍頭，然后反復(fù)的將蛋白質(zhì)團(tuán)塊戳小，再用超聲儀處理，直至看不到明顯的蛋白質(zhì)團(tuán)塊為止。4，12000r/min，離心20min，吸出上清液，轉(zhuǎn)移至新的EP管中。 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-166314六、雙向電泳樣本制備試劑Alklysis buffer(LB)ReagentFinal concentrationTris20mMThiourea (FW 76.12)2MUrea (FW 60.06)7MCHAPs (FW 64.89)2%(W/V)Phenol extraction buff