微生物遺傳育種實驗-PowerPointPresent

1、微生物遺傳育種實驗-氨基酸營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選1一、目的要求了解營養(yǎng)缺陷型突變株選育的原理。學(xué)習(xí)并掌握細菌氨基酸營養(yǎng)缺陷型的誘變、篩選與鑒定方法。 2二、基本原理營養(yǎng)缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素或化學(xué)因素處理，使編碼合成代謝途徑中某些酶的基因突變，喪失了合成某些代謝產(chǎn)物(如氨基酸、核酸堿基、維生素)的能力，必須在基本培養(yǎng)基中補充該種營養(yǎng)成分，才能正常生長的一類突變株。這類菌株可以通過降低或消除末端產(chǎn)物濃度，在代謝控制中解除反饋抑制或阻遏，而使代謝途徑中間產(chǎn)物或分支合成途徑中末端產(chǎn)物積累。在氨基酸、核苷酸生產(chǎn)中已廣泛使用營養(yǎng)缺陷型菌株。3三、實驗材料1）菌種：細菌12992）培養(yǎng)基：

2、細菌完全培養(yǎng)基； 細菌基本培養(yǎng)基 無氮基本培養(yǎng)基；2 倍氮源基本培養(yǎng)基3）儀器： 臺式離心機、恒溫培養(yǎng)箱、電爐等 4四、實驗步驟（一）培養(yǎng)基制備、細菌對數(shù)期培養(yǎng) 1.配制培養(yǎng)基：每組的配量 肉湯培養(yǎng)基：100ML 取10ML分裝2支小試管，包扎，滅菌。 完全培養(yǎng)基：在剩余的90ML肉湯培養(yǎng)基中加入瓊脂，裝入 三角瓶中，包扎，滅菌。 無氮培養(yǎng)基：100ML 取10ML分裝2支大試管，包扎，滅菌。 2倍氮培養(yǎng)基：在剩余的90ML無氮培養(yǎng)基中加入0.2% （NH4）2 SO4 ，裝入三角瓶中，包扎，滅菌。 生理鹽水：100ML注：配方見微生物實驗講義69頁。 5 2.做對數(shù)期培養(yǎng)： 取一支肉湯培養(yǎng)基

3、，接入1299，于30度下培養(yǎng)24小時。（二）制備菌懸液、紫外線誘變 1.離心洗滌菌體： 將對數(shù)期培養(yǎng)的菌液，進行2500轉(zhuǎn)/分離心5分，倒掉上清夜，加入5ML生理鹽水振蕩混勻后，再進行一次離心。 2.配制菌液和誘變 ：菌液：在離心后的菌體中加入生理鹽水，振蕩混勻后，倒入無菌平皿中，加入生理鹽水，使總液量達到10ML。誘變：在30厘米處，用15W紫外燈照射菌液40秒后，置于暗處2小時。中間培養(yǎng)：取誘變后的菌液1ML，加入5ML肉湯培養(yǎng)基中，32度培養(yǎng)。6（三）淘汰野生型菌株1.無氮、二倍氮培養(yǎng)： 將菌液離心洗滌后，加入5ML無氮培養(yǎng)基中，饑餓培養(yǎng)2小時后，加入2氮培養(yǎng)基中再培養(yǎng)2小時，恢復(fù)野生

4、型的生長。2.青霉素殺死野生型： 加入200U/ML的青霉素1ML，于30度下培養(yǎng)。7（四）涂CM平皿、培養(yǎng)突變型 1.倒CM平板： 融化完全培養(yǎng)基，倒2個平板。 2.稀釋和涂CM平皿： 將培養(yǎng)液進行10-1、10-2稀釋剃度，各吸取0.1ML分別接入2個平板，進行培養(yǎng)。8（五）檢出缺陷型 1.倒CM、MM平板： 融化CM、MM培養(yǎng)基，各制備一個平板。 在平板下貼好畫有20個小格的紙。2.用逐個檢出法檢測 用牙簽挑取20個長勢 良好的菌落，先接在 MM培養(yǎng)基的一個位 點上，再接CM培養(yǎng) 基的相應(yīng)位點上。 32度培養(yǎng)48小時。 9（六）測定生長譜1.制備MM平板在培養(yǎng)皿底部劃分5個區(qū)域，做好標記 2.將可能是營養(yǎng)缺陷型的菌株，制備菌懸液，接種于平板上。3.在相應(yīng)的區(qū)域加入不同的氨基酸組，進