苯酚降解菌的分離

1、湖水污泥微生物中苯酚降解菌的分離與特性測定1實驗意義 苯酚是染料、農(nóng)藥、醫(yī)藥等行業(yè)的重要生產(chǎn)原料和中間體,是工業(yè)廢水中的常見污染物之一。由于它具有較強的生物毒性,許多國家已將其列入重點污染物名單之中,并且采取各種措施來消除環(huán)境中的苯酚污染。而且它的水體污染很難去除。 所以在這些措施中,生物修復是一種低成本的環(huán)境友好型污染消除方式,它的關(guān)鍵是獲得具有苯酚降解功能的微生物。2實驗?zāi)康恼莆諒耐寥乐蟹蛛x苯酚降解菌的方法掌握梯度平板法分離純化細菌的方法掌握革蘭染色的方法3實驗原理 取湖水污泥，在黑暗環(huán)境下的細菌富集，將細菌在不斷增加苯酚濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，得到苯酚耐受菌或者降解菌。 分離出細菌，在苯酚培

2、養(yǎng)液中培養(yǎng)進行4-氨基安替比林分光光度法測定，比較苯酚的前后含量確定其是不是降解菌。 特性測定本實驗只做革蘭染色 具體細菌種屬的鑒定通過核酸進行4實驗材料1、耐酚培養(yǎng)基 ( g/L ) :酵母膏5.00g,蛋白胨10.00g,NaCl10.00g，蒸餾水1L，PH7.0瓊脂16g，121滅菌20min。2、苯酚無機鹽培養(yǎng)( PMM,g/L ) :NH3 NO3 1.00,KH2 PO4 1.50,K HPO4 0.50,NaCl0.50,MgSO4 7H2O 0.10,pH7.07.2,苯酚作為碳源,濃度根據(jù)需要添加,固體培養(yǎng)基加2.0%的瓊脂.5實驗材料3、苯酚培養(yǎng)液：苯酚25-75mg，尿

3、素0.1g，微量元素10ml，蒸餾水90ml，PH7.0-7.2，121滅菌20min。4、革蘭染色所需試劑 結(jié)晶紫、碘液、95%乙醇、復紅、香柏油 PH計，溫度計，黑布，接種環(huán)，酒精燈，顯微鏡6實驗方法一、細菌的富集和分離 1、從校園小河污泥中取污泥，稱取5.00g加到50ml含有25mg/L苯酚的PMM培養(yǎng)基中。2、于30,.220r/min搖床5d培養(yǎng)后，分別添加3次苯酚無機培養(yǎng)液。隔3天后第一次添加PMM培養(yǎng)液，使苯酚終濃度分別增加至100mg/l；隔3天后第二次添加PMM培養(yǎng)液，使苯酚終濃度分別增加至200mg/l；第三次隔3天后，添加PMM培養(yǎng)液，使苯酚終濃度分別增加至300mg/

4、l 。3、最后取培養(yǎng)液進行系列稀釋后涂布于苯酚濃度為300mg/L的PMM固體培養(yǎng)基平板上，30培養(yǎng)3d后挑取形態(tài)上有差異的單菌落,。以上所有培養(yǎng)均用黑布遮蓋。7實驗方法2降酚菌的分離純化：1、梯度平板法制備梯度平板：12ml不含苯酚的無菌耐酚培養(yǎng)基傾斜于一直徑9cm的培養(yǎng)皿中，立即將此培養(yǎng)基協(xié)防形成斜面，并剛好遮住底。待凝固后，平放，再加入12ml含苯酚固體培養(yǎng)，完全遮住下層。稀釋涂布分離：樣品液稀釋：將富集的培養(yǎng)基做10倍系列稀釋（至10-3）8實驗方法樣品涂液步平板：用無菌1ml移液管分別吸取上述10-3、10-2、10-1和原液依次滴加于相應(yīng)的平板上，并用無菌涂布棒從平板中央均勻向四周

5、涂布。細菌培養(yǎng)：30恒溫箱培養(yǎng)2天降酚菌的純化：用無菌接種環(huán)挑取高濃度區(qū)的菌落接種到PMM培養(yǎng)基上，30恒溫培養(yǎng)3天9實驗方法3.最優(yōu)降解苯酚細菌鑒定革蘭染色顯微鏡下觀察 用接種針挑取少許幼齡培養(yǎng)物，涂布在干凈玻片上的一滴無菌水中，風干固定。 用結(jié)晶紫的混合液染色1-2min后，用水洗。 碘液作用1min，水洗，吸干。 用95%的乙醇溶液脫色，流滴至洗脫液至無色(約30s)。 用復紅液復染約2-3min，水洗，風干，用油鏡觀察。10注意事項1實驗人員必須較為清晰的明白實驗方法后才可進行實驗2取污泥最好在水流緩的地方，污泥位置稍微深一點的，細菌才多，機會才打3用到苯酚時，使用手套、口罩防止中毒。11預期結(jié)果經(jīng)過幾天培養(yǎng)后培養(yǎng)液變渾濁在涂布分離中能觀察到單細胞菌落革蘭染色可能為紅色也可能為藍色12本實驗的困難實驗技術(shù)不成熟，甚至不會，可能實驗結(jié)果沒有是由于實驗技術(shù)的原因，所以組員要自己課下學習。實驗的未知性：目前分離的苯酚降解菌都是在苯酚污染的環(huán)境中的分離出來的，學校湖中的污泥不確定是否會分離出目的菌。苯酚的毒性13Thanks