臨床免疫學(xué)和免疫檢驗(yàn)2017-全講義

1、第十三章 免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，是指用標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)免疫檢測(cè)方法。第一節(jié) 概述免疫組織化學(xué)的基本過(guò)程包括：抗原的提取與純化；免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合，特異性抗體以及抗體的純化；將標(biāo)志物與抗體結(jié)合形成標(biāo)記抗體；標(biāo)本的處理與志物呈色反應(yīng)；觀察結(jié)果。；抗原抗體免疫學(xué)反應(yīng)以及標(biāo)一、標(biāo)本的處理（一）標(biāo)本的主要來(lái)源組織：應(yīng)取材于病變組織及病變與正常組織交界處，大小適中。減少對(duì)組織標(biāo)本的損傷與擠壓。體液、穿刺液：可直接涂片或經(jīng)離心后取沉淀物涂片。培養(yǎng)細(xì)胞：懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)離心沉淀后做細(xì)胞涂

2、片，蓋玻片上的單層培養(yǎng)細(xì)胞直接固定。（二）標(biāo)本的固定與保存1.標(biāo)本固定的目的：使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，細(xì)胞內(nèi)分解酶反應(yīng)終止，以防止細(xì)胞自溶，保持細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)；保存組織細(xì)胞抗原性；防止標(biāo)本脫落；除去妨礙抗體結(jié)合的類脂，便于保存；抑制組織中細(xì)菌的繁殖，防止組織和在后續(xù)組織中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和成分的改變。標(biāo)本的固定應(yīng)以不損傷細(xì)胞形態(tài)，不干擾固定后抗原的識(shí)別和結(jié)合為原則。2.固定劑的選擇：蛋白質(zhì)類抗原，可用乙醇或甲醇固定；微生物抗原可用或三氯化碳固定；如需除去的蛋白質(zhì)外殼，可使用胰蛋白酶；多糖類抗原用 10%固定或以微火加熱固定；物（乙質(zhì)存在，應(yīng)用透明質(zhì)酸酶等處理除去；類脂質(zhì)豐富的組織進(jìn)行蛋白、多糖抗原檢測(cè)時(shí)

3、，需用醚、等）處理除去類脂。組織標(biāo)本常規(guī)固定液為中性緩沖。3.制片方法的評(píng)價(jià)：冷凍和石蠟切片是免疫組化最常用的制片方法。首選冷凍切片。其操作簡(jiǎn)便，可避免石蠟切片因固定（）、脫水、浸蠟等對(duì)抗原所造成的損失，適用于不穩(wěn)定的抗原。石蠟切片是研究形態(tài)學(xué)的主要制片方法，它不但是觀察組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的理想方法，而且可用在陳舊石蠟包埋材料免疫組化的回顧性。切片薄而有連續(xù)性，可長(zhǎng)期保存。但對(duì)抗原的保存不如冷凍切片。二、抗原的保存與修復(fù)在制片過(guò)程中，由于廣泛的蛋白交聯(lián)可使組織中某些抗原決定簇發(fā)生遮蔽，致使抗原信號(hào)減弱或。因此，使組織抗原決定簇重新，即抗原修復(fù)是免疫組織化學(xué)技術(shù)中的重要步驟。常用的抗原、修復(fù)方法有：酶

4、消化法；鹽酸水解法；微波法；高壓鍋法；煮沸法。三、抗體的處理與保存（一）抗體的選擇：多克隆抗體廣泛用于石蠟包埋的組織切片，假幾率低，但特異性不如單克隆抗體，有時(shí)會(huì)造成抗體的交叉反應(yīng)。單克隆抗體特異性強(qiáng)，但敏感性不夠高。（二）抗體的稀釋：抗原抗體反應(yīng)要求有正確的比例，過(guò)量或不足均不能達(dá)到預(yù)期結(jié)果。故需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索抗體的最佳稀釋度。（三）抗體的保存：保存抗體時(shí)，要注意保持抗體的生物活性，防止抗體蛋白質(zhì)變性，否則會(huì)降低抗體效價(jià)，甚至失效。四、免疫組化的結(jié)果判斷（一）對(duì)照的設(shè)立：設(shè)立對(duì)照的目的在于證明和肯定陽(yáng)性結(jié)果的特異性，主要針對(duì)第一抗體進(jìn)行，常用的對(duì)照有陽(yáng)性對(duì)照和對(duì)照。1.陽(yáng)性對(duì)照 采用已知抗

5、原陽(yáng)性的標(biāo)本與待檢標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，對(duì)照切片的陽(yáng)性將證明整個(gè)顯色程序的正確。尤其在待檢標(biāo)本呈結(jié)果時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照尤為重要。2.對(duì)照 用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對(duì)照，結(jié)果呈。只有在對(duì)照成立時(shí)，方可判定檢測(cè)結(jié)果。主要目的在于排除假陽(yáng)性。（二）陽(yáng)性結(jié)果：陽(yáng)性細(xì)胞的顯色分布有三種類型：細(xì)胞質(zhì)；細(xì)胞核；細(xì)胞膜表面。免疫組織化學(xué)的呈色深淺可反映抗原存在的數(shù)量，可作為定性、定位和定量的依據(jù)。（三）結(jié)果及抗原不表達(dá)：結(jié)果不能簡(jiǎn)單地認(rèn)為具有否定意義，即使數(shù)細(xì)胞陽(yáng)性（只要是在抗原所在部位）也應(yīng)視為陽(yáng)性表達(dá)。（四）特異性和非特異性顯色的鑒別：特異性反應(yīng)常分布于特定抗原部位，具有結(jié)構(gòu)性，顯色強(qiáng)度不一。非特異性

6、反應(yīng)無(wú)一定的分布規(guī)律，常為切片邊緣、刀痕或部位，壞死或擠壓的細(xì)胞區(qū)域，常成片均勻。非特異性反應(yīng) 由于細(xì)胞內(nèi)抗原含量不同，特異性反應(yīng)的顯色強(qiáng)度不一。如果細(xì)胞之間顯色強(qiáng)度相同或者細(xì)胞和周圍結(jié)締組織無(wú)明顯區(qū)別的，常提示為非特異性反應(yīng)。其他 在過(guò)大的組織塊，中心固定不良也會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色，有時(shí)可見(jiàn)非特異性顯色和特異性顯色同時(shí)存在，過(guò)強(qiáng)的非特異性顯色背景可影響結(jié)果判斷。（五）免疫組化結(jié)果與蘇木素-時(shí)，應(yīng)結(jié)合臨床資料，如、染色（HE）切片結(jié)果：當(dāng)免疫組化結(jié)果與 HE 切片不一致、部位、X 線等影像學(xué)及結(jié)果綜合分析，不能簡(jiǎn)單地用免疫組化檢查結(jié)果HE 切片。五、質(zhì)量控制抗體的質(zhì)量是免疫組化染色技術(shù)成功的關(guān)鍵

7、。使用前應(yīng)了解第一抗體（即特異性抗體）和第二抗體（橋聯(lián)抗體）的特異性和敏感性；通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)決定抗體的最佳稀釋度；在已知陽(yáng)性和的標(biāo)本上觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果的符合情況。試劑的質(zhì)量控制包括合適的稀釋度、稀釋劑、孵育溫度和時(shí)間等。操作過(guò)程質(zhì)量控制1.實(shí)驗(yàn)操作 需嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)化操作步驟進(jìn)行，關(guān)注日間和操作間的變異情況。此外還應(yīng)包括對(duì)試劑的復(fù)溶及試劑的有效性進(jìn)行質(zhì)量控制。直接染色法可選擇空白試驗(yàn)和替代試驗(yàn)；間接法、三步法可采用替代試驗(yàn)和吸收試驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)量控制。2.標(biāo)本的質(zhì)量控制 標(biāo)本的留取、保存、固定和處理對(duì)免疫組化染色。用于質(zhì)量控制的標(biāo)本、操作過(guò)程、染色步驟、包括、陽(yáng)性或自身組織對(duì)照三種類型。質(zhì)控品的設(shè)置可有助于標(biāo)

8、本試劑質(zhì)量等問(wèn)題引起的誤差。有時(shí)需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行前處理，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的干擾。技術(shù)設(shè)備、儀器和器具的質(zhì)量控制 需定期對(duì)相關(guān)設(shè)備、儀器（含基本實(shí)驗(yàn)液體）和器具進(jìn)行校準(zhǔn)。操作相關(guān)工具如吸管、試管、加樣槍等需進(jìn)行，以減少對(duì)抗體污染的機(jī)會(huì)。第二節(jié) 免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)是采用熒光素標(biāo)記的已知抗體（或抗原）作為探針，檢測(cè)待測(cè)組織、細(xì)胞標(biāo)本中的靶抗原（或抗體），形成的抗原抗體復(fù)合物上帶有熒光素，在熒光顯微鏡下，可以分辨出抗原（或抗體）的所在位置及其性質(zhì)，并可利用熒光定量技術(shù)計(jì)算其含量，以達(dá)到對(duì)抗原（或抗體）物質(zhì)定位、定性和定量測(cè)定的目的。組織處理免疫熒光組化技術(shù)主要靠觀察標(biāo)本的熒光

9、抗體染色結(jié)果作為抗原的鑒定和定位，因此標(biāo)本的制作十分重要。在制作標(biāo)本過(guò)程中應(yīng)力求保持抗原的完整性，并在染色、洗滌和包埋過(guò)程中不發(fā)生溶解和變性，也不擴(kuò)散至鄰近細(xì)胞或組織間隙中。標(biāo)本要求盡量薄些，以利抗原抗體接觸和鏡檢。標(biāo)本中干擾抗原抗體反應(yīng)的物質(zhì)要充分洗去，有傳染性的標(biāo)本要注意安全。（一）標(biāo)本的類型：基質(zhì)標(biāo)本是指固定在玻片上用作抗原的組織、細(xì)胞和微生物等，包括：1.涂片和印片：血液、細(xì)菌培養(yǎng)物、腦脊液、體腔滲出液和細(xì)胞懸液等均可簡(jiǎn)單地涂抹在玻片上，干燥固定后就可用于熒光抗體染色。腦脊液、臟器（肝、脾、淋鮮切面壓印于玻片上做成印片，經(jīng)固定后再染色。等）、細(xì)菌菌落或尸體病變組織可把新2.組織切片：最

10、常用。包括：冷凍切片：首選的制片方法。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，組織的抗原性保存好，自發(fā)熒光較少，特異熒光強(qiáng)，同時(shí)適用于不穩(wěn)定的抗原；缺點(diǎn)：組織結(jié)構(gòu)欠清晰；石蠟切片：形態(tài)學(xué)的主要制片方法，它不但是觀察組織結(jié)構(gòu)的理想方法，而且可進(jìn)行回顧性。其優(yōu)點(diǎn)是組織細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)顯現(xiàn)清楚，但對(duì)抗原的保存量不如冷凍切片，并有組織自發(fā)熒光和非特異性熒光，需加酶消化處理。3.細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)本：細(xì)胞在玻片上培養(yǎng)，形成單層，固定后用作抗核抗體等檢測(cè)的抗原片。還可使細(xì)胞單層生長(zhǎng)在玻片上，再用或患者標(biāo)本，然后固定，用熒光抗體染色法檢測(cè)。4.活細(xì)胞染色：檢查淋巴細(xì)胞表面抗原以及免疫球蛋白受體、癌細(xì)胞表面抗原、血清中抗癌細(xì)胞抗體等，均可用活

11、細(xì)胞熒光抗體染色法。當(dāng)同時(shí)觀察細(xì)胞表面兩種抗原的分布和相互關(guān)系時(shí)，可行染色。（二）標(biāo)本的保存標(biāo)記標(biāo)本在固定干燥后，最好立即進(jìn)行熒光抗體染色及鏡檢。如必須保存時(shí)，則應(yīng)保持干燥，置 4以下保存。一般細(xì)菌涂片或組織切片經(jīng)固定后可保存 1 個(gè)月以上。但和某些組織抗原標(biāo)本抗原性喪失很快，數(shù)天后就失去其抗原性，需在-20以下保存。第三節(jié) 酶免疫組織化學(xué)技術(shù)酶免疫組化技術(shù)是在一定條件下，應(yīng)用酶標(biāo)抗體（抗原）與組織或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原（抗體）發(fā)生反應(yīng)，催化底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，通過(guò)顯微鏡識(shí)別標(biāo)本中抗原（抗體）的分布位置和性質(zhì)，也可通過(guò)圖像分析技術(shù)達(dá)到定量的目的。一、組織處理主要用于標(biāo)本中抗原（抗體）的定位和定性檢測(cè)

12、。該技術(shù)染色標(biāo)本可長(zhǎng)期保存，可用普通光鏡觀察結(jié)果，可觀察組織細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，尤其是非標(biāo)記抗體酶免疫組化法的敏感性更優(yōu)于熒光免疫技術(shù)。酶免疫組化技術(shù)可分為酶標(biāo)記抗體免疫組化技術(shù)和非標(biāo)記抗體酶免疫組化技術(shù)兩種類型。二、酶標(biāo)記抗體免疫組化染色（一）直接法：將酶直接標(biāo)記在特異性抗體上，與組織細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的抗原進(jìn)行特異性反應(yīng)，形成抗原-抗體-酶復(fù)合物，最后用酶底物顯色。直接法的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)便及特異性強(qiáng)，缺點(diǎn)是敏感性低，體種類有限。的抗（二）間接法：將酶標(biāo)記在第二抗體上，先將第一抗體（特異性抗體）與相應(yīng)的組織抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，再用第二抗體（酶標(biāo)記的抗體）與復(fù)合物中的特異性抗體結(jié)合，形成抗

13、原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。間接法的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)敏感性高，原或抗體。缺點(diǎn)是特異性不如直接法，而且操作較為繁瑣。一種酶標(biāo)二抗可用于檢測(cè)多種抗三、非標(biāo)記抗體免疫酶組化染色酶不是標(biāo)記在抗體上，而是首先用酶免疫動(dòng)物，效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗酶抗體，通過(guò)免疫學(xué)反應(yīng)將抗酶抗體與組織抗原聯(lián)系在一起。該方法避免了酶標(biāo)記時(shí)對(duì)抗體的損傷，同時(shí)也提高了方法的敏感性。（一）酶：抗酶抗體作為第三抗體，通過(guò)橋抗體（第二抗體），將特異性識(shí)別組織抗原的第一抗體與第三抗體連接起來(lái)，形成酶聯(lián)的抗原-抗體復(fù)合物，加底物顯色。酶較酶標(biāo)法的敏感性有所提高，但操作分四步，較為復(fù)雜。在酶中，如果抗酶抗體與酶結(jié)合弱，在操作中酶

14、常被沖洗掉；如果酶標(biāo)記在非特異性抗體上就會(huì)存在背景問(wèn)題；如果抗酶抗體的非特異性成分與橋抗體結(jié)合，就會(huì)與抗酶抗體競(jìng)爭(zhēng)橋抗體結(jié)合位點(diǎn)，影響方法的敏感性。（二）PAP 法：PAP 法是在酶基礎(chǔ)上的改良。PAP 法首先將酶的第三抗體（抗酶抗體）與酶組成可溶性復(fù)合物（PAP 復(fù)合物）。該復(fù)合物由 2 個(gè)抗酶抗體和 3 個(gè)過(guò)氧化物酶分子組成，呈五角形結(jié)構(gòu)，非常穩(wěn)定。通過(guò)橋抗體（第二抗體），將特異性識(shí)別組織抗原的第一抗體與 PAP 復(fù)合物的抗酶抗體連接起來(lái)，此時(shí)要求特異性第一抗體與第三抗體的動(dòng)物種屬相同。與酶相比，PAP 法操作簡(jiǎn)便，分三步。PAP 復(fù)合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，避免了酶中標(biāo)記易脫落的弊端；敏感性高；背景

15、淡，因?yàn)榧词箻蚩贵w存在有非特異性抗體的可能，但因其與第一抗體并非同種屬，故不能與抗酶抗體結(jié)合。并且，如果抗酶抗體中存在著非抗酶抗體，當(dāng)其與橋抗體或組織成分結(jié)合時(shí)，由于其不能與酶結(jié)合，也不會(huì)產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。（三）雙橋 PAP 法：在 PAP 法中通過(guò)兩次連接橋抗體和 PAP 復(fù)合物而建立起來(lái)的，通過(guò)雙橋可結(jié)合更多的 PAP 復(fù)合物于抗原分子上，以增強(qiáng)敏感性。這種放大方式重復(fù)使用橋抗體，使橋抗體與 PAP 復(fù)合物中抗酶抗體的未充分飽和 Fc 段結(jié)合，或橋抗體與特異性第一抗體尚未飽和的 Fc 段結(jié)合。（四）堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶法（APAAP 法） 辣根過(guò)氧化物酶（HRP）是免疫組化的首選用酶，但

16、有些組織細(xì)胞含內(nèi)源性過(guò)氧化物酶限制了 HRP 的廣泛應(yīng)用，盡管用甲醇過(guò)氧化氫進(jìn)行處理可以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，但同時(shí)也會(huì)影響抗原的顯示。APAAP 法就是用堿性磷酸酶代替 HRP 建立的堿性磷酸酶（AP）-抗堿性磷酸酶（AAP）法，即簡(jiǎn)稱 APAAP。其技術(shù)要點(diǎn)與 PAP 法相似。四、酶免疫組化染色中常用的酶及顯色底物酶免疫組化技術(shù)中最常用的酶是辣根過(guò)氧化物酶，常用的供氫體有二氨基聯(lián)苯胺（DAB），反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色；氨基乙基卡巴唑（AEC），反應(yīng)產(chǎn)物呈橘紅色；4-氯-1-萘酚，反應(yīng)產(chǎn)物為灰藍(lán)色。對(duì)含有豐富內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的組織切片（如淋巴組織和腫瘤組織），則首選 AP 標(biāo)記的免疫組化方法。理

17、論上 AP 最為敏感，但 HRP 比 AP 染色結(jié)果保存時(shí)間長(zhǎng)。第四節(jié) 親和組織化學(xué)染色利用兩種物質(zhì)之間高度親和性的特點(diǎn)，進(jìn)行定位、定性或定量分析。廣義的親和組織化學(xué)包括：抗原與抗體、植物凝集素與糖類、生物素與親和素、SPA 與 IgG、陽(yáng)離子與陰離子、配體與受體等。此類方法具有高敏感性、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)，可對(duì)抗原定性、定位或定量分析，具有準(zhǔn)確、清晰等優(yōu)點(diǎn)。一、生物素-親和素法生物素即維生素H，是一種堿性蛋白。親和素是由 4 個(gè)相同亞基組成的大分子糖蛋白，具有 4 個(gè)與生物素親和力極高的結(jié)合位點(diǎn)。能夠彼此牢固結(jié)合而不影響彼此的生物學(xué)活性。此外，它們都具有與其他示蹤劑結(jié)合的能力。常用的技術(shù)類型有：

18、（一）親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物技術(shù)（ABC）原理：將親和素與酶標(biāo)生物素結(jié)合，形成可溶性親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）。當(dāng)其與檢測(cè)反應(yīng)體系中的生物素化抗體（直接法）或生物素化第二抗體（間接法）相遇時(shí)，ABC 中未飽和的親和素結(jié)合部位即可與抗體上的生物素結(jié)合，使抗原抗體反應(yīng)體系與 ABC 標(biāo)記體系連成一體進(jìn)行檢測(cè)。ABC 法的優(yōu)點(diǎn)：生物素與親和素的結(jié)合十分牢固，并且 1 個(gè)分子親和素有 4 個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，可以分別和生物素化的抗體和酶結(jié)合，l 個(gè)過(guò)氧化物酶或免疫球蛋白分子又可結(jié)合多個(gè)生物素分子，從而形成網(wǎng)絡(luò)狀復(fù)合物。敏感性高、親和力強(qiáng)、特異性高、第一抗體和第二抗體工作濃度低、

19、操作時(shí)間短、可以多重標(biāo)記等。（二）橋聯(lián)親和素-生物素技術(shù)（BRAB 技術(shù)）以游離的親和素作為橋聯(lián)劑，將檢測(cè)反應(yīng)體系中抗原、生物素化抗體復(fù)合物與標(biāo)記生物素（如酶標(biāo)生物素）聯(lián)結(jié)起來(lái)，達(dá)到檢測(cè)反應(yīng)分子的目的。（三）標(biāo)記親和素-生物素技術(shù)（LAB 技術(shù)）以標(biāo)記親和素直接與免疫復(fù)合物中的生物素化抗體連接進(jìn)行檢測(cè)。該法具有相當(dāng)高的靈敏度，由于省略了加標(biāo)記生物素步驟，操作較 BRAB 法簡(jiǎn)便。間接 LAB 法采用的是生物素化的第二抗體，可以進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度。二、葡萄球菌 A 蛋白法葡萄球菌蛋白 A（SPA）是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)，由于它獨(dú)特的免疫學(xué)特性，目前已成為免疫學(xué)上一種極為有用的

20、工具。葡萄球菌 A 蛋白技術(shù)是根據(jù) SPA 能與多種動(dòng)物 IgG 的 Fc 段結(jié)合的原理，用 SPA 標(biāo)志物（酶、熒光素、放射性物質(zhì)等）顯示抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。SPA 常用 HRP 標(biāo)記，可應(yīng)用于間接法。SPA 法的染色程序基本同酶標(biāo)抗體法，僅第二抗體改用 SPA-HRP。三、凝集素法凝集素（lectin）是一類從各種植物、無(wú)脊椎動(dòng)物和較高等動(dòng)物組織中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白質(zhì)。它可使紅細(xì)胞凝集，故稱凝集素。因此凝集素可以作為一種探針來(lái)胞膜的微小化合物結(jié)構(gòu)，從而探索細(xì)胞的生物學(xué)結(jié)構(gòu)和演變過(guò)程。細(xì)胞上的糖基，特別是細(xì)凝集素受體是存在于細(xì)胞膜上的糖蛋白和糖脂中的寡糖，其在胚胎不同發(fā)

21、育階段、細(xì)胞成熟過(guò)程及代謝改變、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等過(guò)程中都有不同程度的改變。其在腫瘤中對(duì)腫瘤細(xì)胞的以及良的分化都可以進(jìn)行標(biāo)記，凝集素是腫瘤細(xì)胞膜糖分子變化的一種理想工具。直接法：將標(biāo)志物直接結(jié)合在凝集素上，使其與組織細(xì)胞相應(yīng)的糖蛋白或糖脂相結(jié)合；間接法：先將凝集素與組織細(xì)胞膜糖基結(jié)合，然后再用標(biāo)記的抗凝集素抗體（即用凝集素免疫動(dòng)物抗凝集素抗體）與結(jié)合在細(xì)胞上的凝集素反應(yīng)。間接法還有糖-凝集素-糖法，該方法是利用生物細(xì)胞膜的特殊糖基與凝集素結(jié)合后，再用標(biāo)記的已知糖基與其反應(yīng)，形成一個(gè)“三明治樣”結(jié)合物。四、鏈和素-生物素法鏈和素（SA）是從鏈霉菌培養(yǎng)物提取的一種純蛋白，有 4 個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，并且

22、具有高度的親和力。利用生物素結(jié)合的第二抗體與酶標(biāo)記的鏈（LSAB）。和素蛋白就了酶標(biāo)鏈和素-生物素方法LSAB 法是近年發(fā)展迅速的一種理想的親合組織化學(xué)染色技術(shù)。具有以下特點(diǎn)：1.敏感性高 由于酶直接標(biāo)記鏈和素，它與生物素結(jié)合的所有位點(diǎn)都呈游離狀態(tài)，與 ABC 法相比，可結(jié)合的生物素化的第二抗體，因此放大效應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò) ABC 法。同時(shí)鏈和素分子量小，易于穿透組織、細(xì)胞，也可增強(qiáng)其敏感性。2.低背景鏈和素的等電點(diǎn)為 66.5，而親和素的等電點(diǎn)為 10，因此 LSAB 法所帶正電荷比ABC 復(fù)合物少得多，從而與組織內(nèi)結(jié)締組織的負(fù)電荷靜電吸引少，明顯減少非特異，染色背景清晰。3.第一抗體工作濃度低

23、與 ABC 法相比，其第一抗體的工作濃度更低，不僅節(jié)約了抗體，也明顯降低了顯色背景。4.操作簡(jiǎn)便 ABC 法的流程大約需近 100 分鐘，而 LSAB 法加微波技術(shù)僅需 35 分鐘，對(duì)于快速實(shí)用非常第五節(jié) 免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)免疫電子顯微鏡（immunoelectron microscope ,IEM）技術(shù)是利用高電子密度的顆粒性標(biāo)志物（如膠體金、鐵蛋白等）標(biāo)記抗體，或用經(jīng)免疫組織/細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)能產(chǎn)生高電子密度產(chǎn)物者如辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體，在電子顯微鏡下對(duì)抗原抗體反應(yīng)中的高電子密度標(biāo)記的抗原（抗體）進(jìn)行亞細(xì)胞水平定位的技術(shù)。 IEM 較之免疫組織化學(xué)在光鏡下的定位更為精確，可定位至細(xì)胞膜、細(xì)胞器

24、，在探索病因、發(fā)病機(jī)制、組織發(fā)生等方面有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)標(biāo)本免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)標(biāo)本的要求：的要求是既要保存良好的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，又要注意保持組織的抗原性，因此在組織固定與取材時(shí)選用固定劑不宜過(guò)強(qiáng)，在取材方面，免疫電鏡技術(shù)較光鏡免疫化學(xué)技術(shù)要求更迅速、精細(xì)。在免疫染色方面，又分為包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三種。一、免疫膠體金染色法：以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，既可用于透射電鏡（TEM）又可用于掃描電鏡（SEM），其最大的優(yōu)點(diǎn)就是可以通過(guò)應(yīng)用不同大小的顆粒或結(jié)合酶標(biāo)進(jìn)行雙重或多重標(biāo)記。在電鏡水平，膠體金技術(shù)還可與其他技術(shù)結(jié)合，更充分地展示了它廣泛的應(yīng)用范圍。如膠體金技術(shù)與冷凍蝕

25、刻技術(shù)結(jié)合，可對(duì)細(xì)胞膜不同膜蛋白顆?；蚣?xì)胞膜表面的其他成分進(jìn)行精細(xì)定位；與熒光技術(shù)結(jié)合，可將熒光素和膠體金同時(shí)結(jié)合于某種生物大分子，制成探針，同時(shí)進(jìn)行熒光顯微鏡和電鏡定位，使定位方便、準(zhǔn)確，提高了工作效率；與分子雜交技術(shù)相結(jié)合，產(chǎn)生了電鏡原位雜交技術(shù)，在超微結(jié)構(gòu)水平上精確定位位點(diǎn)，為深入物體功能提供了有利的工具。二、免疫膠體鐵細(xì)胞化學(xué)染色法：膠體鐵是一種陽(yáng)離子膠體，將抗體分子標(biāo)記上膠體鐵，通過(guò)普魯士藍(lán)反應(yīng)呈色，可用在電鏡和光鏡水平上的抗原（抗體）定位。三、酶免疫電鏡技術(shù)：是利用酶的高效率催化作用，對(duì)其底物的反應(yīng)形成不同的電子密度，借助于電子顯微鏡觀察，通過(guò)對(duì)酶的定位，對(duì)抗原（抗體）進(jìn)行定位。第

26、六節(jié) 免疫組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用一、熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用（一）在自身免疫性疾病中的應(yīng)用：自身免疫性疾病患者，檢測(cè)組織中的自身抗體。補(bǔ)體熒光法等可檢測(cè)免疫復(fù)合物沉積在組織礎(chǔ)與程度極有幫助。細(xì)胞上的位置，對(duì)于了解腎小球性腎炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病變和病變基（二）細(xì)菌和的快速鑒定：在細(xì)菌學(xué)方面，可用于雙球菌、百日咳桿菌、螺旋體等的快速。免疫熒光技術(shù)在領(lǐng)域應(yīng)用更為廣泛，可用于和抗原在細(xì)胞內(nèi)的定位，也可用于（三）、纖毛蟲(chóng)、過(guò)程的。的檢測(cè)與：免疫熒光技術(shù)在方面應(yīng)用極廣，可用于瘧原蟲(chóng)、利效果、鉤蟲(chóng)、絳蟲(chóng)、蠕蟲(chóng)等的工作。近來(lái)在血吸蟲(chóng)及瘧原蟲(chóng)方面較多，肯定。血吸蟲(chóng)抗原是用尾蚴和成蟲(chóng)，瘧疾抗原采用的是的或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的血清。二、酶免疫組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用1.提高病理準(zhǔn)確性2.癌蛋白的臨床應(yīng)用對(duì)腫瘤細(xì)胞增