XXXX年 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(1)ppt課件

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一 DNA重組實(shí)驗(yàn) . 要 求1、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)制止飲食、勿高聲說(shuō)話、隨意走動(dòng)。2、課前預(yù)習(xí)、課中仔細(xì)操作和課后的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。3、妥善保管好每組的實(shí)驗(yàn)器具。4、實(shí)驗(yàn)操作要求人人動(dòng)手。5、每次實(shí)驗(yàn)終了要驗(yàn)加樣槍的準(zhǔn)確性，然后做好值日衛(wèi)生任務(wù)。.第3周DNA重組實(shí)驗(yàn) 第4周原核表達(dá)蛋白的SDS電泳分析 第5周Western Blotting I 第6周Western Blotting II .時(shí)間分配實(shí)驗(yàn)內(nèi)容10:00-10:30酶切加樣10:30-12:3037酶切；原理講述12:30-13:30回收13:30-14:00連接加樣14:00-16:0025連接；休息16: 0-16:3

2、0轉(zhuǎn)化16:30-17:3037孵育培養(yǎng)；倒平皿17:30-18:00涂布. 學(xué)習(xí)DNA的酶切、純化及外源片段與載體的銜接，將T載體上所攜帶的外源DNA酶切片段亞克隆到表達(dá)載體上。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理 限制性內(nèi)切酶可識(shí)別特定位點(diǎn)并切割DNA產(chǎn)生粘性末端或平端的外源片段，經(jīng)DNA的純化處置后用于銜接反響；選擇表達(dá)載體pET28a多克隆位點(diǎn)上相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割；在銜接酶的作用下將外源片段銜接到載體上，實(shí)現(xiàn)外源片段的克隆。.實(shí)驗(yàn)資料： 外源片段DNACHY基因的PCR產(chǎn)物； 載體pET28a-egfp含有綠色熒光蛋白DNA片段； BL21感受態(tài)細(xì)胞鼎國(guó)公司； 培育皿； 37搖床及培育箱。實(shí)驗(yàn)

3、試劑：限制性內(nèi)切酶(EcoRI; XhoI) TaKaRa公司；T4 DNA銜接酶；LB液體培育基和固體培育基；卡那霉素kana:任務(wù)濃度100g/mL；氯仿/異戊醇24:1；無(wú)水乙醇；3M NaAc；70%乙醇；ddH2O。 三、實(shí)驗(yàn)資料與試劑凝乳酶.四、實(shí)驗(yàn)步驟 1載體pET28a-egfp和外源DNA片段的限制性酶切：50l反響體系，用1.5ml tube，冰上操作試劑加樣量DNA5lEcoRI1lXhoI1l10buffer5lddH2O38l37反響1hr。分別取8l外源片段酶切產(chǎn)物和5l pET28a-egfp酶切產(chǎn)物于1.0%凝膠檢測(cè)酶切能否完全；按2-5步純化、回收DNA。2參

4、與ddH2O 200l擴(kuò)展體積，參與等體積氯仿/異戊醇24:1，顛倒混勻，12000 g離心10 min；3汲取上清200l，加3M NaAc 15l和無(wú)水乙醇4 00l，-20放置15分鐘以上；413000rpm 離心10分鐘；5倒去上清，用75乙醇浸洗沉淀，風(fēng)干后外源DNA溶于10l ddH2O1.5 ml tube中， pET28a-egfp溶于10l ddH2O1.5 ml tube中；.6銜接反響15l體系：試劑加樣量CHY10 lpET28a-egfp2.5 l10buffer1.5 lT4 Ligase1 l25 30min7.取1只滅菌的EP離心管，a. 每管參與感受態(tài)懸液50

5、 ul及銜接產(chǎn)物或質(zhì)粒50-100ng 15ul 無(wú)菌操作；b. 混勻不可以振蕩，冰浴 30 min；c. 取出放入42C水浴中熱休克90秒，不要搖動(dòng)試管，迅速放入冰中，冰浴5min。d. 向每管中參與無(wú)抗生素的LB液體培育基400ul，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反響液?；靹蚝?，于37C100150rpm溫暖搖振培育 60min，使細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)形狀，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因kanar。 .8.制備含有適當(dāng)抗生素的LB培育基平板。9.挑選培育：取轉(zhuǎn)化反響液200 l，均勻涂布于含有Amp抗性的LB培育基平板上。將涂布好的平皿置37C平放20 min，然后倒置培育12-16 h。期間應(yīng)留意察看，當(dāng)菌

6、落生長(zhǎng)良好，而相鄰菌落尚未相互重疊時(shí)，即停頓培育。假設(shè)發(fā)現(xiàn)菌落太多或太少時(shí)，應(yīng)改動(dòng)轉(zhuǎn)化反響液的用量，重新涂布培育。 .1. 運(yùn)用酶時(shí)應(yīng)盡量減少其分開冰箱的時(shí)間，以免活性降低。酶通常保管在50%的甘油中，實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)將反響液中甘油濃度控制在1/10以下，否那么，酶活性將受影響。2. 吸頭、離心管應(yīng)高壓滅菌，每次吸頭用畢應(yīng)改換，不要相互污染試劑。3. 加試劑前，應(yīng)短促離心10秒鐘，然后再翻開管蓋，以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面。4. 防止雜菌和雜DNA的污染。整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)展，所用器皿，如離心管，移液槍頭等應(yīng)是新的，并經(jīng)高壓滅菌處置。5. 離心操作一定要在低溫下進(jìn)展，所用

7、的水、Eppendorf管都要在冰上預(yù)冷，不能分開冰浴，否那么細(xì)胞轉(zhuǎn)化率將會(huì)降低。6. 37振蕩培育時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否那么會(huì)出現(xiàn)很多的衛(wèi)星菌落和細(xì)微的菌膜干擾。7. 平板涂布重組體時(shí)，應(yīng)防止反復(fù)來(lái)回涂布，由于感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞壁有了變化，過(guò)多的機(jī)械擠壓涂布會(huì)使細(xì)胞破裂、死亡，影響轉(zhuǎn)化效率。8. 涂布后培育時(shí)間不宜超越24h，否那么會(huì)出現(xiàn)衛(wèi)星菌落。五、本卷須知.實(shí)驗(yàn)設(shè)定二組，1、宿主菌涂布；2、轉(zhuǎn)化銜接產(chǎn)物的受體菌涂布。最后比較培育好的平皿，可以看到： 含抗菌素培育皿上的受體對(duì)照組并沒(méi)有長(zhǎng)出菌落，證明受體菌對(duì)抗菌素是敏感的，并證明在本實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有發(fā)生抗藥性突變。 轉(zhuǎn)化銜接產(chǎn)物的受體菌在含抗菌素的培育皿

8、中也長(zhǎng)出了菌落，這不是受體菌的抗藥性的自發(fā)突變株，一定是質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入細(xì)菌后的轉(zhuǎn)化體，這是由于帶抗藥性的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入細(xì)菌后，使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生抗藥性這一遺傳特性的結(jié)果。六、結(jié)果察看及分析的原那么. 由于此實(shí)驗(yàn)過(guò)程涉及多個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，如酶切、銜接、感受態(tài)細(xì)胞、轉(zhuǎn)化等各方面的效率，因此在實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一些問(wèn)題。如：1.酶切時(shí)所加的DNA溶液體積不能太大，否那么DNA溶液中其他成分會(huì)干擾酶反響。2.DNA濃度過(guò)低時(shí)可適當(dāng)濃縮后再酶切，濃度過(guò)高能夠酶切不完全可以適當(dāng)稀釋酶切。3.反響液中參與過(guò)量的酶是不適宜的，除思索本錢外，酶液中的微量雜質(zhì)能夠干擾隨后的反響，假設(shè)底物DNA較多可以延伸酶反響時(shí)間。七、常見問(wèn)題分析及處置.1.限制性酶切反響及