第七章-基因工程菌的發(fā)酵ppt課件(全)

1、第七章 基因工程菌的發(fā)酵 第一節(jié) 基因工程發(fā)酵概述第二節(jié) 基因工程生化產(chǎn)品的分離純化【學(xué)習(xí)目標(biāo)】知識目標(biāo)：能夠陳述基因工程菌的培養(yǎng)方式及發(fā)酵設(shè)備 ；能夠掌握基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)品的分離純化原理及方法 ；能夠掌握基因工程菌生產(chǎn)菌種的保存及管理方法；能力目標(biāo)：掌握基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)流程 ；掌握基因工程菌發(fā)酵過程中表達(dá)系統(tǒng)、培養(yǎng)基、溫度、pH值、溶解氧和誘導(dǎo)條件等因素對發(fā)酵的影響 。3第一節(jié) 基因工程發(fā)酵概述一、基因工程菌的培養(yǎng)方式二、基因工程菌的發(fā)酵設(shè)備三、基因工程菌的發(fā)酵工藝4基因工程（Genetic Engineering）：又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)。所謂基因工程是在分子水平上對基因進(jìn)行操

2、作的復(fù)雜技術(shù)，是將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個(gè)基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的操作。它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)DNA大分子提取出來，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長、繁殖的受體細(xì)胞中，以讓外源物質(zhì)在其中“安家落戶”，進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而獲得新物種的一種嶄新技術(shù)。它克服了遠(yuǎn)緣雜交的不親和障礙。5基因工程基本過程6一、基因工程菌的培養(yǎng)方式1.分批培養(yǎng)2.補(bǔ)料分批培養(yǎng)3.連續(xù)培養(yǎng)4.透析培養(yǎng)5.固定化培養(yǎng)1.分批培養(yǎng)分批培養(yǎng)：將定量的微生物接種到封閉的具有定量培養(yǎng)基的容器中，保

3、持一定的溫度、pH、DO，微生物進(jìn)行生長繁殖。分批培養(yǎng)操作簡單，但因不能控制生長，獲得的菌體密度也有限。2.補(bǔ)料分批培養(yǎng)補(bǔ)料分批培養(yǎng)：在分批發(fā)酵過程中補(bǔ)充培養(yǎng)基，而不從發(fā)酵體系中排出發(fā)酵液，使發(fā)酵液的體積隨著發(fā)酵時(shí)間逐步增加。特點(diǎn)：能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度：一方面，它可以避免在某種營養(yǎng)成分的初始濃度過 高時(shí)影響細(xì)胞的生長代謝以及產(chǎn)物的形成；另一方面，它還能防止某些限制性營養(yǎng)成分在培養(yǎng)過程中被耗盡而影響細(xì)胞的生長和產(chǎn)物的形成。3.連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)：是采用有效的措施讓微生物在某特定的環(huán)境中保持旺盛生長狀態(tài)的培養(yǎng)方法。不斷地流加營養(yǎng)，并不斷地取出發(fā)酵液。其中的微生物可長期保持在對數(shù)期的平衡生

4、長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率。連續(xù)培養(yǎng)可提高發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)效益和自動化水平，此法已成為目前發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展方向。連續(xù)培養(yǎng)如用于發(fā)酵工業(yè)中就稱為連續(xù)發(fā)酵(continuous fermentation）。連續(xù)發(fā)酵與分批發(fā)酵相比有許多優(yōu)點(diǎn)： 自控性，便于利用各種儀表進(jìn)行自動控制； 高效，它使裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵罐等工藝簡化了，縮短了生產(chǎn)時(shí)間和提高了設(shè)備的利用效率； 產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定； 節(jié)約了大量動力、人力、水和蒸汽，使水、汽、電的負(fù)荷減少。但也存在不足之處： 主要是菌種易于退化，使微生物長期處于高速繁殖的條件下，即使自發(fā)突變率很低，也難以避免變異的發(fā)生； 容易污染，在連續(xù)發(fā)酵中，要保持各種設(shè)備無滲漏，

5、通氣系統(tǒng)不出現(xiàn)任何故障，是極其困難的。因此，“連續(xù)”是有時(shí)間限制的，一般可達(dá)數(shù)月至一年、兩年； 連續(xù)培養(yǎng)中，營養(yǎng)物的利用率低于分批培養(yǎng)。4.透析培養(yǎng)透析培養(yǎng)：是對微生物培養(yǎng)用透析膜包裹，并使外部有新鮮培養(yǎng)液流動著的一種培養(yǎng)方法。特點(diǎn)：微生物可不斷地受到新營養(yǎng)的補(bǔ)給，同時(shí)也不斷地排出老朽廢物，因此可以延長對數(shù)期的增殖，增大靜止期的細(xì)胞數(shù)。通過外液的培養(yǎng)液成分的變化，可使微生物的營養(yǎng)環(huán)境慢慢發(fā)生改變，同時(shí)也可隔著膜培養(yǎng)兩種微生物，通過其產(chǎn)生物來了解它們的相互關(guān)系。5.固定化培養(yǎng)固定化培養(yǎng)：是通過化學(xué)或物理方法，將游離細(xì)胞或酶固定于限定的空間區(qū)域內(nèi)，使其保持活性并可以反復(fù)利用。優(yōu)點(diǎn)：菌體密度高、反應(yīng)

6、速度快、發(fā)酵周期短、產(chǎn)物分離簡單、反應(yīng)過程控制容易、菌體可重復(fù)連續(xù)使用和增加發(fā)酵過程中重組質(zhì)粒穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)。固定化：英文名immobilized; immobilization; 所謂固定化是指用物理或化學(xué)方法使酶成為不溶性衍生物或使細(xì)胞成為不易從載體上流失的形式制成生物反應(yīng)器用以催化生化反應(yīng)、細(xì)胞數(shù)量的增殖等。二、基因工程菌的發(fā)酵設(shè)備1.發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)2.發(fā)酵罐中的反應(yīng)和參數(shù)3.發(fā)酵罐控制系統(tǒng)1.發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)發(fā)酵罐組成：發(fā)酵罐體 攪拌器（高傳質(zhì)作用） 溫控系統(tǒng) 滅菌系統(tǒng) 空氣無菌過濾裝置 殘留氣體處理裝置 參數(shù)測量和控制系統(tǒng)（pH值、O2等） 培養(yǎng)液配制 連續(xù)操作裝置要求：發(fā)酵罐提供菌體生長的最適

7、條件； 培養(yǎng)過程不得污染，保證純菌培養(yǎng)； 培養(yǎng)及消毒過程中不得游離出異物，干擾細(xì)胞代謝活動。2.發(fā)酵罐中的反應(yīng)和參數(shù)反應(yīng)：涉及細(xì)菌遺傳特性有關(guān)的分子水平的反應(yīng)； 與細(xì)菌代謝調(diào)節(jié)有關(guān)的細(xì)胞水平的反應(yīng)； 和熱量、質(zhì)量、動量傳遞特性有關(guān)的工程水平的反應(yīng)。參數(shù)： 常測定：溫度、攪拌速度、pH值、DO值、糖含量、罐壓、效價(jià) NH3-N含量、前體濃度、菌體濃度等。 不常測定：氧化還原電位、黏度、排氣中氧氣和二氧化碳含量等3.發(fā)酵罐控制系統(tǒng)發(fā)酵罐控制系統(tǒng)：傳感器、計(jì)算機(jī)、執(zhí)行器件傳感器： 在線測量的傳感器：測量pH值的發(fā)酵耐高溫電極、測量發(fā)酵罐D(zhuǎn)O值的電極、氧氣分析儀、二氧化碳分析儀等。 需二次傳感技術(shù)的傳

8、感器：酶電極、微生物電極、免疫敏感電極、電化學(xué)電極、光學(xué)生物傳感器及熱敏、離子敏場效應(yīng)管等（測量時(shí)，需將發(fā)酵液引出罐外測定，可采用罐外流通式測量和流動注射法（FIA）測量等技術(shù)）。三、基因工程菌的發(fā)酵工藝1.基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基組成2.基因工程菌的發(fā)酵條件控制基因工程菌的基本流程 基因工程菌搖瓶培養(yǎng)初步確定工程菌的生長條件發(fā)酵罐放大培養(yǎng)確定最佳工藝參數(shù) 用于制藥的基因工程菌屬于化能異養(yǎng)、好氧型微生物，在有氧的條件下，氧化培養(yǎng)基中的碳源、有機(jī)或無機(jī)氮源提供能量（APP），進(jìn)行發(fā)酵生長和繁殖。1.基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基組成（1）碳源：是基因工程菌生長的第一營養(yǎng)物質(zhì)，其作用在于為正常生理活動和過程提供

9、能量來源，也為細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的合成提供骨架?；蚬こ叹l(fā)酵的物質(zhì)：碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子和選擇劑等?？衫玫奶荚矗禾穷?、有機(jī)酸、脂類和蛋白質(zhì)類。 常用的碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。大腸桿菌利用的碳源：蛋白胨、酵母粉等；酵母菌能利用的碳源：葡萄糖、半乳糖等單糖物質(zhì)；絲狀菌利用的碳源：單糖、淀粉等。（2）氮源常用的氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、氨水等。 氮源為基因工程菌生長提供氮素的來源，用于合成氨基酸、蛋白質(zhì)、核苷、核酸及其他含氮物質(zhì)。 缺乏氮源細(xì)胞無法生長。 酪蛋白水解物有利于產(chǎn)物的合成和分泌。培養(yǎng)基中的色氨酸對trp啟動子控制的基因表達(dá)有影響。（3）

10、無機(jī)鹽 無機(jī)鹽：磷、硫、鉀、鈣、鎂、鈉等大量元素；鐵、銅、鋅、錳等微量元素，為基因工程菌生長提供必需的礦物質(zhì)，對代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用。無機(jī)磷在許多初級代謝的酶促反應(yīng)中是一個(gè)效應(yīng)因子，在生物大分子的合成、糖代謝、細(xì)胞呼吸及ATP 濃度的控制中，過量的無機(jī)磷會刺激葡萄糖的利用、菌體生產(chǎn)和氧消耗過程。 啟動子只有在低磷酸鹽時(shí)才被啟動，因此，必須控制磷酸鹽濃度，使細(xì)菌生長到一定濃度，磷酸鹽被消耗至低濃度時(shí)，目的蛋白才被表達(dá)。 起始磷酸鹽濃度應(yīng)控制在0.015mol/L左右，濃度低影響細(xì)菌生產(chǎn)，濃度高則導(dǎo)致外源基因不表達(dá)。4.生長因子生長因子是指細(xì)胞生長所必需的微量有機(jī)物，不起碳源和氮源作用。生長因子

11、：維生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪等，在胞內(nèi)起輔酶和輔基等作用，參與電子、基團(tuán)等的轉(zhuǎn)移。由于蛋白胨等天然成分含有各種生長因子，因此，一般在基因工程菌培養(yǎng)基中不單獨(dú)添加。（5）選擇劑、誘導(dǎo)物基因工程菌具有營養(yǎng)缺陷或攜帶選擇性標(biāo)記基因，這種特性保證了基因工程菌的純正性質(zhì)粒的穩(wěn)定性。選擇性標(biāo)記有兩類：營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)標(biāo)記和抗生素抗性選擇標(biāo)記?；蚬こ檀竽c桿菌、芽孢桿菌、鏈霉素、真菌等含抗生素抗性基因，常用卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、博來霉素等作為選擇劑?；蚬こ探湍妇Ｓ冒被釥I養(yǎng)缺陷型，如亮氨酸、賴氨酸、色氨酸等。對于誘導(dǎo)表達(dá)型的基因工程菌，在細(xì)胞生長到一定階段，必須添加誘導(dǎo)物，以解除目標(biāo)

12、基因的抑制狀態(tài)，活化基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成產(chǎn)物。第二節(jié) 基因工程生化產(chǎn)品的分離純化一、細(xì)胞破碎二、去除雜質(zhì)三、產(chǎn)物的分離純化四、分離純化方法的選擇建立分離純化的依據(jù)1.含目的產(chǎn)物的起始物料的特點(diǎn)2.物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)3.目的產(chǎn)物的特性4.產(chǎn)品的質(zhì)量要求基因工程菌生化產(chǎn)品的分離與傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化相比，具有以下特點(diǎn)：1.產(chǎn)物大多在細(xì)胞內(nèi)，提取前要破碎細(xì)胞；2.產(chǎn)物濃度低，雜質(zhì)多，提純難度大；3.產(chǎn)物是大分子蛋白質(zhì)，易失活。一、細(xì)胞破碎 細(xì)胞破碎技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)，是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。 結(jié)合重

13、組DNA技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)上的重大進(jìn)展，以前認(rèn)為很難獲得的蛋白質(zhì)現(xiàn)在可以大規(guī)模生產(chǎn)。細(xì)胞破碎方法（按是否使用外加作用力）二、去除雜質(zhì) 在純化過程中，非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)不應(yīng)忽視，需要特別注意3種可能存在的非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)，它們是DNA、熱原質(zhì)和病毒。1.去除DNA DNA在pH值為4.0以上呈陰離子形式，可用陰離子交換劑吸附除去，但目的蛋白pI值應(yīng)在6.0以上。 如果蛋白質(zhì)為強(qiáng)酸性，可選擇條件使其吸附在陽離子交換劑上，而不讓DNA吸附上去。 利用親和色譜吸附蛋白質(zhì)，而DNA不被吸附，也可分離。2.去除熱原質(zhì) 熱原質(zhì)（pyrogen）即菌體中細(xì)胞壁的脂多糖，大多是革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的。注入人或動物體內(nèi)能引

14、起發(fā)熱反應(yīng)，故名熱原質(zhì)。 相對分子質(zhì)量小的多肽或蛋白質(zhì)中的熱原質(zhì)可用超濾或反滲透的方法去除，但對大分子蛋白質(zhì)無效。 脂多糖是陰離子物質(zhì)，可用陰離子交換色譜去除。 脂多糖中脂質(zhì)是疏水性的，可用疏水色譜法去除。 用親和色譜法去除，配基有多粘菌素B、變形細(xì)胞溶解物或廣譜的抗體。 3.去除病毒 成品中必須檢查是否含病毒，因?yàn)椴∪说拿庖吣芰Φ?，易受病毒感染?病毒的最大來源是由宿主細(xì)胞帶入。 色譜分離一般能將病毒去除。 必要時(shí)，可用紫外線照射使病毒失活，或用過濾法將病毒去除。 三、產(chǎn)物的分離純化 工程菌或工程細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞破碎和固液分離后，目的產(chǎn)物仍與大量雜質(zhì)混合在一起，這類雜質(zhì)可能有病毒、熱原質(zhì)、氧化產(chǎn)物、核酸、多聚體、雜蛋白、與目的物類似的異構(gòu)體等。 分離純化主要依賴色譜分離方法。該法優(yōu)點(diǎn)：多種多樣的分離機(jī)制、設(shè)備簡單、便于自動化控制和分離過程中無發(fā)熱等有害效應(yīng)。色譜技術(shù)主要有離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過濾色譜、高壓液相色譜等。 基因工程產(chǎn)品制備過程中常用的分離純化方法四、分離純化方法的選擇分離純化應(yīng)遵循的基本原則：1.具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性；2.盡可能減少組成工藝的步驟；3.各技術(shù)和步驟之間能相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)，工藝與設(shè)備能相互適應(yīng)；4.