復合型PGPR和苜蓿對新墾地土壤培肥效果研究

1、PAGE PAGE 9復合型PGPR和苜蓿對新墾地土壤培肥效果研究韓 光1 張 磊1* 國家高技術研究發(fā)展計劃項目(20060110Z4047)資助 通訊作者，E-mail: HYPERLINK mailto:echozhanglei echozhanglei作者簡介：韓 光（1984 -），男，安徽巢湖人，碩士研究生，主要從事農業(yè)、環(huán)境微生物研究。E-mail: 收稿日期：2010-06-12；收到修改稿日期：2010-09-20 邱 勤1 石 杰2 胡正峰1( 1 西南大學資源環(huán)境學院，重慶 400716)（2 黑龍江省科學院大慶分院，黑龍江大慶163318) 摘 要 研究了利用根際有益微

2、生物和豆科植物相結合培肥新墾地土壤的效果。試驗采用裂區(qū)設計法研究了重慶北碚新墾坡耕地中性土壤上種植紫花苜蓿并接種根瘤菌和其他根際有益微生物（PGPR）（如聯(lián)合固氮菌、解磷菌和解鉀菌等）對土壤養(yǎng)分的影響。結果顯示：接種根瘤菌+其他PGPR的處理對土壤有機質、全氮、全磷、全鉀、有效磷和速效鉀的提高均達到顯著水平，較只接種根瘤菌的處理分別提高33.5%、22.7%、3.8%、11.5%、11.4%和22.3%，較不接種根瘤菌和PGPR的處理分別高42.2%、58.8%、8%、12.6%、37.2%和40.2%，接種根瘤菌+其他PGPR的效果優(yōu)于只接種根瘤菌和不接種的。同時，上述處理對豆科植物苜蓿植株

3、瘤重、株高、根鮮重、地上部鮮重以及植株全氮含量的提高均達到顯著水平，比只接種根瘤菌的處理分別高44.5%、33.2%、77.3%、76.7%和17.7%。將苜蓿和相應的PGPR兩者聯(lián)合使用有更好的土壤改良效果，加速了新墾地貧瘠土壤的培肥過程。關鍵詞 生物培肥；根際有益微生物；紫花苜蓿；根瘤菌；土壤養(yǎng)分中圖分類號 S144；S156.93 文獻標識碼 A隨著人口數(shù)量的激增，人類對農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)作用的頻度和強度越來越大，導致農業(yè)土壤內在的物理化學性質的改變、生物區(qū)系的貧乏和功能的衰退，恢復受損的農業(yè)土壤成為經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展和人類延續(xù)的關鍵。由重慶市移民局公布：三峽工程建成后，庫區(qū)將淹沒土地36 667

4、 hm2，僅重慶市就要淹沒耕地23 560 hm2。重慶市庫區(qū)移民安置量占三峽工程移民安置總量的85%，移民總數(shù)達103.4萬人；規(guī)劃農業(yè)安置移民35.34萬人。為此，國家計劃開墾16 667 hm2荒地安置農村移民。由于三峽庫區(qū)自然地理狀況的因素，大部分新墾地都分布在深丘和低山上，新開墾的“生土”上層厚度不足，土壤有機質少，保水保肥和抗旱能力差，相當部分耕地處于25左右的斜坡上。目前，主要采用無機換有機、有機肥改土熟化、合理間套作熟化、節(jié)水抗旱等技術進行新墾地快速培肥。針對土壤有機質和養(yǎng)分缺乏問題，分離、選育功能各異的根際有益微生物（Plant Growth Promoting Rhizob

5、acteria，簡稱PGPR）及其混合培養(yǎng)物，研制能持久提高新墾地肥力的復合微生物制劑及其微生物培肥方法，對建立三峽庫區(qū)以及全國其他地區(qū)新墾土壤快速培肥、退化農業(yè)土壤質量定向培育和地力調控有重要的作用。根際有益微生物是指自由生活在土壤或附生于植物根際、莖葉的一類可促進植物生長的有益菌類1,2。根際有益細菌能夠促進植物對礦質營養(yǎng)的吸收和利用3，或者產(chǎn)生促進植物生長的代謝物，甚至抑制有害微生物4。對PGPR的研究，已日益成為國際上的熱門課題，有關PGPR的國際專門研討會已舉行了多次，在PGPR促進植物生長、增加作物產(chǎn)量和有效地用于植物病害的生物防治方面積累了大量的事實。20世紀80年代初，美國奧本

6、大學植病系Kloepper等用某些熒光假單胞菌株處理種子，蘿卜增產(chǎn)144、馬鈴薯增產(chǎn)100、甜菜增產(chǎn)20803；加拿大的Philom Bios公司生產(chǎn)的解磷菌劑、固氮菌劑和解磷固氮混合菌劑，主要應用于小麥、油菜、豌豆等作物，可使作物平均增產(chǎn)10%15%5；2005年，李志新等6用兩種PGPR菌劑（TU-100、YUMI）處理油菜, 具有明顯的生防效果，使油菜菌核病的發(fā)病率下降48.7%54%。但關于PGPR的作用機制，則因菌種、植株和環(huán)境不同而異7，因而國內外有關PGPR的研究主要集中于其生物防治病害和促進植物生長、增加作物產(chǎn)量的機制，對于多種PGPR混合使用和PGPR與植物聯(lián)合使用來培肥新墾

7、土壤、改良植株性狀的則報道較少，且多是單一或較少PGPR菌株混合對植株性狀或土壤性狀影響的研究。然而，PGPR的作用并不是單一的，接種大量優(yōu)勢有益細菌于農作物根際之所以有促進生長作用應是PGPR綜合作用的結果8。也正由于這個原因，不少商家以PGPR為招牌，在缺乏研究根據(jù)的情況下，在微生物接種劑商品中搭配菌種，一定程度上造成市場的混亂，爭議較多9。因此，有必要進行PGPR搭配效果的研究。高振生等10種植紫花苜蓿時接種根瘤菌，使苜蓿干草產(chǎn)量提高了50.0%93.2%；施振云等11使用聯(lián)合固氮菌劑接種于田間水稻，并使水稻每公頃增產(chǎn)213.2543.3 kg，增產(chǎn)率為2.9%6.9%；胡小加等12用巨

8、大芽孢桿菌拌種，使油菜的植株干重、全氮和全鉀分別增加4.1 %、13.9 %和2.3 % , 全磷增加18.4 %；Chabot等13研究表明解磷菌的溶磷作用是中低肥力土壤上促進植物生長最重要的機制之一；蔣先軍等14研究發(fā)現(xiàn)硅酸鹽細菌除能將礦物中的鉀分解出來，從磷灰石中取得磷素營養(yǎng)外，還能從空氣中固定氮素，并有增強作物抗病的能力；吳建峰等15研究表明土壤中鉀細菌和磷細菌能將難溶性鹽轉化成可溶性鹽，將土壤礦物無效態(tài)的鉀和磷釋放出來，提高土壤中的有效養(yǎng)分，直接或間接地影響土壤養(yǎng)分循環(huán)的速率?；谏鲜鲅芯浚疚倪x取了根瘤菌、聯(lián)合固氮菌、巨大芽孢桿菌和硅酸鹽細菌4種菌株做為組合研究其配合效應。紫花苜蓿

9、(Medicago sativa L.)是多年生豆科草本植物，是一種適口性好、營養(yǎng)價值和可開發(fā)價值很高的牧草16-17，并具有水土保持和改良退化土壤的生態(tài)功能。根系強大，與根瘤菌共生固氮體系效率高，可以提高土壤氮素供應。因此，本項研究通過施用PGPR對紫花苜蓿的農藝性狀和土壤養(yǎng)分的影響進行比較，以此來探討施用PGPR與紫花苜蓿農藝性狀及土壤肥力性質變化的相關性。1 材料與方法1.1 試驗材料1.1.1 供試植株 紫花苜蓿為美國引進品種“三得利”，購自甘肅省草原總站草業(yè)中心（發(fā)芽率85.4%）。1.1.2 供試菌株 苜蓿根瘤菌(菌株代號91522)（由本實驗室分離，能在pH4.87.0的YMA固

10、體培養(yǎng)基上正常生長）18、巨大芽孢桿菌（Bacillus megatherium，中國菌保中心菌株號ACCC 10008）、聯(lián)合固氮菌（Associative-nitrogen-fixing Bacterium）19和硅酸鹽細菌（Bacillus mucilaginosus，膠質芽孢桿菌，西南大學微生物研究中心提供）。1.1.3 配方 植物營養(yǎng)液：采用Fahraeus無氮營養(yǎng)液。根瘤菌培養(yǎng)基（液）：采用改進的YMA培養(yǎng)基：甘露醇，10 g；酵母浸出粉，5 g；NaCl，0.1 g；MgSO47H2O，0.2 g；K2HPO4，0.5 g；1 000 ml水。固氮菌培養(yǎng)基（液）：葡萄糖，10 g

11、；NaCl，0.2 g；KH2PO4，0.2 g；CaSO42H2O，0.1 g；MgSO4，0.2 g；CaCO3，5 g；1 000 ml水。硅酸鹽細菌培養(yǎng)基（液）：蔗糖，5 g；Na2HPO4，2 g；MgSO47H2O，0.5 g；FeCl3，0.005 g；CaCO3，0.1 g；1 000 ml水；pH 7.07.5。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（液）：牛肉膏，3.0 g；蛋白胨，10.0 g；NaCl，5.0 g；1 000 ml水；pH 6.27.4。1.1.4 試驗地概況 試驗地位于西南大學后山，為新墾坡耕地，坡度約為25。土壤為紫色土，土壤養(yǎng)分情況如表1。表1 新墾土樣化學肥力指標T

12、able 1 Chemical properties of the newly reclaimed soil 項目ItempH有機質OM全氮TN全磷TP全鉀TK堿解氮Alkalytic N有效磷Available P速效鉀Available K(g kg-1)(mg kg-1)含量Content6.89.680.520.252.5354.012.3156.55正常范圍Normal range10500.54.00.31.01040202005301000014000指標Level偏低Lower中等偏低Slight low偏低Lower極低Extremely low中等Middle偏低Lower

13、極低Extremely low1.2 試驗方法1.2.1 根瘤菌株的準備 取生長于斜面的一支供試菌株，用5 ml無菌水洗下菌體，取1 ml接種于100 ml中性YMA培養(yǎng)液中，28下置恒溫振蕩器中培養(yǎng)2024 h，調節(jié)其OD600值約為1.0后，經(jīng)4 000 r min-1離心10 min，收集菌體，重新懸浮于新鮮YMA液體培養(yǎng)基中，加1%羧甲基纖維素納溶液作為黏著劑10，用于拌種。1.2.2 除根瘤菌外的其他PGPR菌（注：為書寫方便，以下簡稱PGPR處理）的準備 分別取生長于斜面的4種供試菌株，分別用5 ml無菌水洗下菌體，各取1 ml接種于對應的培養(yǎng)液中，后續(xù)步驟同根瘤菌株的準備。1.2

14、.3 紫花苜蓿種子的制備 挑選均勻飽滿健壯的苜蓿種子，于5060水中浸泡0.5 h，撈出。白天放在陽光下暴曬，夜間轉至陰涼處，并加水保持種子濕潤，當大部分種子略有膨脹時用根瘤菌、PGPR拌種播種。1.2.4 土樣處理與土壤性狀測定方法 本次試驗土樣分兩次采集，時間分別為2008年9月（播種時）和2009年6月（收獲時），采樣深度為510 cm，多點（56個）取樣混合均勻，將采回的濕土及時進行處理，在室內沿自然結構將土塊分成約1 cm的小土塊，除去植物殘體、小石塊以及蚯蚓等動物，土壤樣品經(jīng)風干、磨細過篩（1 mm、0.25 mm土壤篩）， 用于測定土壤有機質（稀釋熱-重鉻酸鉀容量法:K2Cr2O

15、7-H2SO4）、土壤堿解氮（堿解擴散法）、有效磷（Olsen法即NaHCO3法）、全鉀和速效鉀（火焰光度法）、全氮（半微量開氏蒸餾法）、全磷（鉬藍比色法：660 nm比色）20，土樣不用時應保存在4冰箱中。植株全氮采用半微量凱氏定氮法測定21。1.2.5 試驗設計 （1）試驗處理。將試驗地采用裂區(qū)設計法分成12個小區(qū)。試驗設4個處理水平：種植紫花苜蓿不接種（M）、種植紫花苜蓿接種根瘤菌（M+R）、種植紫花苜蓿接種根瘤菌和其他PGPR（M+R+PGPR）、不種植紫花苜蓿不接種（W）。每個小區(qū)面積為7.2 m2，每處理重復3次，隨機排列。（2）田間管理。2008年9月16日播種，將Fahraeu

16、s無氮植物營養(yǎng)液均勻澆入各個小區(qū)，每個小區(qū)澆營養(yǎng)液20 L。栽培期間除雜草，施打農藥。（3）收獲及處理。2009年6月20日收獲，統(tǒng)計每個小區(qū)成苗數(shù)，由于各處理水平不同，各小區(qū)紫花苜蓿的生長情況有較大差異，直接表現(xiàn)為成苗數(shù)不同。經(jīng)統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)成苗數(shù)最多的小區(qū)可達到約612株/小區(qū)，最少的約為203株/小區(qū)。為了便于找出不同處理對紫花苜蓿各農藝現(xiàn)狀的影響，計算成苗系數(shù)，其公式如下：成苗系數(shù)=每小區(qū)成苗數(shù)/最大生長苗數(shù)每小區(qū)隨機采植株20株，測定植株高、上部鮮重、根鮮重、根瘤重和植株全氮。以每小區(qū)成苗數(shù)比最大生長苗數(shù)得到每個小區(qū)成苗系數(shù)，各測定指標乘以成苗系數(shù)后進行統(tǒng)計分析。1.3 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)采用

17、SPSS16.0、Excel數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析。2 結果與分析2.1 接種PGPR對土壤養(yǎng)分的影響表2 不同接種處理對土壤養(yǎng)分的影響Table 2 Effects of inoculation treatments on soil nutrients處理代號Treatment code有機質(g kg-1)OM全氮(g kg-1)Total N全磷(g kg-1)Total P全鉀(g kg-1)Total K堿解氮(mg kg-1)Alkalytic N有效磷(mg kg-1)Available P速效鉀(mg kg-1)Available KM10.74b0.51c0.25b1.90

18、b49.47b1.99c55.56cM+R11.44b0.66b0.26b1.92b67.01a2.45b63.72bM+R+PGPR15.27a0.81a0.27a2.14a67.78a2.73a77.92aW9.71c0.53c0.25b1.86b53.25b2.29b57.83cF值F value60.74*31.65*7.68*7.00*40.09*35.33*46.85*注：同一列數(shù)據(jù)后不同字母表示在5%水平差異顯著，下同；* 和 * 分別表示在5%和1%水平差異顯著，下同 Note: The different letters following the data in same

19、column mean significant difference at 5% level, and the same below; * and * denote significant difference at 5% and 1% level, respectively, and the same below表2分別比較了4種處理對土壤養(yǎng)分的影響。從各測定指標來看，M+R+PGPR處理，即種植紫花苜蓿接種根瘤菌和PGPR處理，對除堿解氮外的土壤化學指標的影響與M、M+R處理（即只種植苜蓿處理和種植并接種其根瘤菌處理）相比差異顯著，M+R+PGPR處理顯著提高了土壤全氮、全磷、全鉀的含量；

20、土壤全氮的增值中來自PGPR菌的貢獻為0.15 g kg-1；比較M、M+R兩個處理，種植紫花苜蓿并接種根瘤菌處理在土壤全氮、堿解氮、有效磷和速效鉀等指標顯著高于只種植苜蓿處理，然而全磷、全鉀并無顯著差異；根瘤菌對全氮提高的貢獻為0.15 g kg-1，對土壤堿解氮提高的貢獻約18 mg kg-1；M處理和W處理，即只種植苜蓿處理與不種植不接種處理對土壤養(yǎng)分的影響無顯著性差異，且養(yǎng)分含量一直維持在較低水平。總體來看，接種根瘤菌和PGPR能夠顯著提高其有機質、全氮、全磷、全鉀、有效磷和速效鉀的含量，較只接種根瘤菌而不接種PGPR的處理分別高33.5%、22.7%、3.8%、11.5%、11.4%

21、和22.3%，較不接種根瘤菌不接種PGPR的處理分別高42.2%、58.8%、8%、12.6%、37.2%和40.2%，足見根瘤菌和其他PGPR菌對土壤性質的重要作用。通過F值檢測（表2）可看出，研究所設處理對全磷、全鉀的影響均達到了顯著水平（p0.05），對其他各指標則達到極顯著水平（p0.01）。2.2 接種PGPR對紫花苜蓿農藝性狀的影響PGPR不僅對上述土壤養(yǎng)分變化影響顯著，而且對紫花苜蓿的農藝性狀也產(chǎn)生了明顯的影響。紫花苜蓿不僅是上好的豆科飼料作物，還是在我國各地廣泛種植的豆科綠肥，其多年生根系兼具水土保持功能。為此，本研究針對根瘤菌和其他PGPR對紫花苜蓿農藝性狀的影響作了研究。表

22、3 接種PGPR對紫花苜蓿各農藝性狀的影響Table 3 Effects of inoculating PGPR on alfalfa agronomic properties處理代號Treatment code瘤鮮重Fresh nodule weight(mg plant-1)株高Plant height(cm plant-1)根鮮重Fresh root weight(mg plant-1)地上部鮮重Fresh shoot weight(mg plant-1)植株全氮含量Plant total N(%)M0.011c68.59b8.77c53.77c3.103cM+R0.227b85.13b

23、28.77b119.97b3.303bM+R+PGPR0.328a113.43a51.00a211.97a3.887aF值F value150.1*14.44*140.7*306.3*25.57*表3分別比較了三種處理（M、M+R、M+R+PGPR）對紫花苜蓿瘤鮮重、株高、根鮮重、地上部鮮重、干重、地上部干重和全氮含量的影響。從各測定指標來看，同時接種根瘤菌和PGPR處理（M+R+PGPR）的效果均優(yōu)于不接種PGPR只接種根瘤菌（M+R）的效果，在瘤鮮重、株高、根鮮重、地上部鮮重和植株全氮含量方面，較不接種PGPR的處理分別高44.5%、33.2%、77.3%、76.7%和17.7%，較不接種

24、根瘤菌不接種PGPR的處理分別提高2 882%、65.4%、482%、294%和25.3%。同時接種根瘤菌和PGPR處理的苜蓿瘤重、株高、根鮮重、地上部鮮重和植株全氮等在各處理中均達到最大。表3還表明接種根瘤菌對紫花苜蓿各農藝性狀的影響顯著優(yōu)于不接種的，其結果與石杰等22種植紫花苜蓿并接種根瘤菌所得出的結論相一致。通過F值檢測（表3）顯示，三種處理（M、M+R、M+R+PGPR）對紫花苜蓿瘤重、株高、根鮮重、植株地上部鮮重和全氮含量的影響均達到了極顯著水平（p0.01）。2.3 瘤重與紫花苜蓿其他農藝性狀的相關關系分析有效根瘤的形成是促進紫花苜蓿生長和共生系統(tǒng)高效固氮的關鍵，瘤重是根瘤形成的有

25、效檢測形式。通過相關分析，檢測了瘤重與苜蓿其他農藝性狀的相關關系，相關系數(shù)如表4所示。表4結果顯示，瘤重與植株上部鮮重、根鮮重和株高呈極顯著相關關系(p0.01)，與植株全氮含量呈顯著正相關關系(p0.05)，說明良好的結瘤性能能夠提高紫花苜蓿的產(chǎn)量和品質。表4 瘤鮮重與紫花苜蓿株高、根鮮重、地上部鮮重和植株全氮含量的相關關系Table 4 Correlations between fresh nodule weight and fresh aboveground biomass weight, fresh root weight, plant height and total nitroge

26、n項目Item株高Plant height根鮮重Fresh root weight地上部鮮重Fresh shoot weight植株全氮含量Plant total N瘤鮮重Fresh nodule weight0.885*0.940*0.948*0.795*3 討論與結論三峽水庫新開墾耕地壤質差，肥力低，加劇人地、人糧矛盾，制約經(jīng)濟發(fā)展。目前，主要采用無機換有機、有機肥改土熟化、合理間套作熟化、節(jié)水抗旱等技術進行新墾地快速培肥。隨著社會對環(huán)境保護的日益重視和生態(tài)農業(yè)的發(fā)展，PGPR作為微生物肥料必然會有相應的發(fā)展，為新興的“綠色產(chǎn)業(yè)”在農業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮其應有的經(jīng)濟價值、社會價值和生態(tài)價值。例如，

27、呂軍等23在新墾地上套種牧草，土壤有機質和有效氮、有效磷分別較不套種牧草的新墾地高41.7%、87.5%和11.6%。逄煥成等24用含鉀細菌和芽孢桿菌的菌劑處理土壤，使土壤有機質、堿解氮、有效磷和速效鉀分別提高了55.9%、50.2%、71.4%和28.9%。與前人成果相比，本研究利用根瘤菌和其他PGPR與紫花苜蓿的聯(lián)合使用，在一年的時間內使新墾貧瘠土壤有機質、全氮、全磷、全鉀、有效磷和速效鉀的含量比只種植苜蓿分別提高了42.2%、58.8%、8%、12.6%、37.2%和40.2%，同時，還使苜蓿在瘤鮮重、株高、根鮮重、地上部鮮重和植株全氮含量方面分別較種植苜蓿提高了2 882%、65.4%

28、、482%、294%和25.3%。此外，本研究雖只進行一年時間，但根據(jù)王彥榮等25經(jīng)過9年連續(xù)施用有益微生物菌群處理試驗區(qū)土壤，土壤改良效果和作物品質一直保持相對穩(wěn)定，推知本試驗的研究效果亦能維持數(shù)年之久。本研究中，種植紫花苜蓿、種植紫花苜蓿并接種苜蓿根瘤菌、種植紫花苜蓿并接種苜蓿根瘤菌和PGPR較不種植紫花苜蓿對土壤化學性質的提高呈現(xiàn)依次升高的趨勢。本研究結果顯示，接種PGPR可使紫花苜蓿明顯增產(chǎn)；PGPR與紫花苜蓿聯(lián)合使用，能夠較明顯地改良土壤部分化學性質，其結論與Summer等26所得出短期的生物化學處理不會明顯改變土壤化學性質的結論不完全一致。從本試驗的結果來看，苜蓿植株、PGPR、土

29、壤性質三者關系相當密切。首先，在對苜蓿接種根瘤菌的基礎上接種PGPR菌可使固氮效果成倍提高。說明PGPR促進了根瘤菌的固氮作用，抑或其中的聯(lián)合固氮菌也參與了生物固氮作用，因此對土壤全氮的含量做出了貢獻。其次，接種PGPR促使難溶性磷、鉀鹽轉化成可溶性磷、鉀鹽，從而提高了土壤的磷、鉀供應，這也證實了前人有關土壤微生物能夠改良土壤性狀的論點27。第三，與只接種根瘤菌相比，同時接種根瘤菌和PGPR的效果顯著優(yōu)于前者，更進一步驗證了接種PGPR改善根際土壤化學性質促進植物生長的作用。最后，已有大量研究證明PGPR能夠改善土壤結構、修復受損土壤28-30，而紫花苜蓿具有水土保持、土壤改良、地力培肥、植物

30、修復等多重生態(tài)功能，將二者聯(lián)合使用加速了新墾地貧瘠土壤的培肥過程。綜上所述，紫花苜蓿并接種包括根瘤菌在內的PGPR，較只接種根瘤菌更有利于提高紫花苜蓿的產(chǎn)量、品質、固氮能力以及改良土壤性狀。這對紫花苜蓿大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化種植及新墾貧瘠土壤性狀的改良將有著積極全面的推進作用。此外，PGPR與紫花苜蓿的聯(lián)合作用機制尚不明確，該措施長期應用于三峽庫區(qū)以及其他地區(qū)新墾或退化農業(yè)土壤的效果有待在更大尺度面積上試驗研究。參考文獻Malik K A, Bilal R. Association of nitrogen-fixing plant growth promoting rhizobateria (PGPR

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