凍干黃熱活疫苗制造及檢定規(guī)程

1、凍干黃熱活疫苗制造及檢定規(guī)程本品系用減毒的黃熱病毒17D株接種雞胚，經(jīng)研磨、離心，取上清液凍干制成。專供進(jìn)入或經(jīng)過黃熱流行地區(qū)的人員預(yù)防黃熱之用。1毒種1.1毒種來源減毒黃熱病毒17D株。1.2毒種檢定1.2.1無菌試驗(yàn)按生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行。1.2.2純毒試驗(yàn)用已知黃熱病毒免疫血清做中和試驗(yàn)，證明其為黃熱病毒。1.2.3猴體安全及效力試驗(yàn)取凍干黃熱17D毒種，加無菌生理鹽水恢復(fù)其原液量，接種無黃熱病毒中和抗體之恒河猴10只，每只腦內(nèi)注射0.25ml（50000個(gè)小白鼠LD50）。注射后第2、4、6日各采血1次，分離血清，分別做10倍系列稀釋。以原血清及10-110-3各稀釋度的血清分別腦

2、內(nèi)注射體重1012g小白鼠6只，每只0.03ml，觀察21天，檢查病毒量，LD50均不得超過Log2（4天以內(nèi)死亡的小白鼠不計(jì)算在內(nèi)）。猴子經(jīng)注射后24周，再采血1次，分離血清，做中和抗體測定。10只猴中至少要有9只血清表現(xiàn)陽性中和反應(yīng)。在1個(gè)月的觀察期中，發(fā)現(xiàn)腦炎癥狀或因而死亡者不得超過1只猴。1.3毒種保存原毒種和生產(chǎn)毒種批均應(yīng)凍干后真空封口，保存于-70以下。1.4毒種傳代和生產(chǎn)毒種的制備取毒種3支，啟開安瓿后立即以稀釋液（不應(yīng)含有任何人體蛋白和外源血清或抗體）溶化。待全部溶化后接種于7日齡雞胚卵黃囊，每胚0.2ml。分2組進(jìn)行，每組不得少于10胚，置37.538培育。7080小時(shí)按組收

3、取活存雞胚，每組不得少于4胚。去眼后分組混合研磨，加稀釋液做成懸液，經(jīng)2000r/min離心10分鐘，吸取上清液，在雞胚中傳代，并抽樣按生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行無菌試驗(yàn)。按同法連續(xù)傳遞2代，傳代時(shí)可不等無菌試驗(yàn)結(jié)果，第3代毒種的雞胚收獲后，吸取容器內(nèi)液體做無菌試驗(yàn)（方法同上），并將雞胚凍存于-40以下。將無菌試驗(yàn)陰性之雞胚取出融化。按每胚加入1ml稀釋液研磨，經(jīng)2000r/min離心10分鐘，吸取上清液，加入稀釋液稀釋5倍后置冰浴中待用。同時(shí)做毒力滴定。此代即為生產(chǎn)毒種。2疫苗制造2.1接種雞胚用7日齡雞胚，每胚接種適當(dāng)稀釋度毒種液0.10.2ml于卵黃囊，接種后滴蠟封口。2.2培育接種后37

4、.538培育，7080小時(shí)開始收獲。2.3收獲收獲時(shí)剔去死胚，分組收獲活存雞胚，去眼，裝入大管中，逐管吸取管內(nèi)液體做無菌試驗(yàn)，在操作過程中盛雞胚之大管應(yīng)置冰浴中保冷，收獲完畢置-40凍存。2.4研磨、離心2.4.1研磨剔除灑菌雞胚，將冰凍雞胚大管置冷水中融化，倒入研磨桶內(nèi)，按每胚1ml加入滅菌雙蒸水，用電動(dòng)研磨機(jī)8000r/min研磨3分鐘。2.4.2離心，收取上清液將研磨后的雞胚懸液以減壓虹吸法分裝于500ml瓶中，塞以膠塞，用2000r/min離心30分鐘。離心應(yīng)在25進(jìn)行。收取上清液，每批裝一個(gè)球瓶，換以膠塞，保存在冰浴中。2.5半成品檢定2.5.1無菌試驗(yàn)按生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行2.

5、5.2凍干前病毒滴定吸取球瓶中樣品，作10倍系列稀釋。取10-110-6之病毒液，每個(gè)稀釋度用體重1012g小白鼠6只，每只腦內(nèi)注射0.03ml，接種部位忌用碘酒消毒，觀察21天，計(jì)算LD50。2.6分裝疫苗保存在冰浴中進(jìn)行分裝，每安瓿分裝量為0.5ml（10人份）。分裝后將盛安瓿之金屬盒放入-40-50預(yù)凍2小時(shí)。2.7凍干全部凍干過程為1517小時(shí)，最后5小時(shí)升溫2025，最高不得超過25。凍干后安瓿真空封口。3成品檢定3.1物理檢查外觀為略帶粉紅色的疏松體，水分不應(yīng)超過3%（g/g），加入稀釋液應(yīng)迅速溶解。3.2無菌試驗(yàn)按生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行。3.3猴體安全及效力試驗(yàn)方法及要求見1.

6、2.3項(xiàng)，如生產(chǎn)毒種做過猴體安全及效力試驗(yàn)則疫苗可免做。3.4豚鼠安全試驗(yàn)按原分裝量加入生理鹽水溶解疫苗，用體重300500g豚鼠2只，試驗(yàn)前23天每天量體溫、稱體重。然后每只腹腔注射0.5ml，觀察7天，每天量體溫，應(yīng)無病癥發(fā)生。如2只豚鼠均有顯著反應(yīng)（體溫超過40，體重減輕）或死亡，則該批疫苗應(yīng)廢棄；如有1只豚鼠有癥癥發(fā)生，可再用3只豚鼠重試，重試中如有2只以上豚鼠發(fā)病時(shí)，判為不合格，制品應(yīng)廢棄；如有1只發(fā)病，則再重試，仍有發(fā)病則判為不合格，制品應(yīng)廢棄。3.5病毒滴定同半成品檢定。每只小白鼠腦內(nèi)注射0.03ml。病毒滴度應(yīng)3.66LogLD50。3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)由每批疫苗成品取3安瓿，置372周，滴度下降不應(yīng)超過1Log