幾種測(cè)定生物大分子分子量方法的比較生物學(xué)專(zhuān)業(yè)

1、幾種測(cè)定生物大分子分子量方法的比較摘要：生物大分子是指核酸(多核苷酸)、蛋白質(zhì) (多肽)、碳水化合物(葡聚糖或多糖)和脂類(lèi)等。因?yàn)榉肿恿啃∮?00的單體可以通過(guò)聚合作用形成的大分子。測(cè)定生物大分子分子量方法是生物研究的核心之一，分子量是多肽、蛋白質(zhì)、核酸、酶、多糖以及脂類(lèi)等鑒定中的首要參數(shù)。當(dāng)前醫(yī)學(xué)，藥學(xué)及生物科學(xué)學(xué)科之間交叉滲透為測(cè)定生物大分子分子量提供了更多的契機(jī)，本文對(duì)測(cè)定生物大分子分子量的方法：生物質(zhì)譜法，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠滲透色譜法等技術(shù)的原理及優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行綜述。關(guān)鍵字：生物大分子 分子量測(cè)定 蛋白質(zhì) 多肽 21世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì)，隨著人類(lèi)基因組，水稻基因組等的測(cè)序基本完

2、成，蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)基因組研究也迅速發(fā)展。負(fù)責(zé)生命活動(dòng)的是生物大分子，生物大分子之間的相互作用構(gòu)成了生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，因此，測(cè)定生物大分子的分子量，深入了解生物大分子的結(jié)構(gòu)功能是掌握生命活動(dòng)的關(guān)鍵。生物大分子是細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)和功能單位,也是研究生命現(xiàn)象中的物質(zhì)基礎(chǔ).生物體內(nèi)的分子組成如何?哪些分子才算生物大分子?這些大分子有沒(méi)有分子量的下限?怎么去測(cè)定生物大分子分子量？要想知道這些答案，需要多方位，運(yùn)用多種方法進(jìn)行研究。1. MALDITOF質(zhì)譜技術(shù)對(duì)熱敏感的化合物進(jìn)行快速加熱，可以避免其受熱分解而轉(zhuǎn)入氣相，所以進(jìn)行質(zhì)譜法分析，采用MALDITOF法尤為適用，測(cè)定的化合物相對(duì)分子質(zhì)量 QUOTE 可

3、達(dá)數(shù)十萬(wàn)。MALDIT0F的應(yīng)用范圍廣泛， 包括有機(jī)小分子、有機(jī)高聚物和生物大分子。它在生物大分子領(lǐng)域的應(yīng)用尤為引人注目。 基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)是將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體，當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，致使基質(zhì)和分析物膨脹并進(jìn)入氣相。MALDI所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子，因而質(zhì)譜圖中的離子與多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。TOF的原理是離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同，導(dǎo)致測(cè)定離子的質(zhì)荷比（M/Z）與離子的飛行時(shí)間成正比。MALDI產(chǎn)生的離子常用飛行時(shí)間(timeof-flight，

4、TOF)檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)，理論上講，只要飛行管的長(zhǎng)度足夠，TOF檢測(cè)器可檢測(cè)分子的質(zhì)量數(shù)是沒(méi)有上限的，因此MALDITOF質(zhì)譜很適合對(duì)蛋白質(zhì)、多肽、核酸和多糖等生物大分子分子量進(jìn)行測(cè)量測(cè)。1.1測(cè)定多肽與蛋白質(zhì)分析生物工程產(chǎn)品中多肽與蛋白質(zhì)是最主要的產(chǎn)品類(lèi)型，對(duì)這些生物工程產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制，已成為當(dāng)前一個(gè)很重要的課題。MALDITOF已廣泛用于多肽與蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確測(cè)定及其純度的評(píng)價(jià)。傳統(tǒng)的測(cè)定，純度及肽圖的方法，應(yīng)用凝膠電泳及高效液相色譜，這些方法不僅受多種實(shí)驗(yàn)條件(如色譜柱、流動(dòng)相的選擇等)所限，而且誤差大，往往難以得到令人滿(mǎn)意的結(jié)果，且操作十分復(fù)雜。應(yīng)用MALDITOF對(duì)生物工程產(chǎn)品進(jìn)行準(zhǔn)確的，

5、純度及質(zhì)量肽圖進(jìn)行測(cè)定。對(duì)一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證，得到了直觀、準(zhǔn)確(誤差小于02)的結(jié)果。 這方面的報(bào)道不勝枚舉，牛碳酸酐酶、蜂毒素、牛胰島素、肌 紅蛋白、胰蛋白酶原等都已經(jīng)成功測(cè)定，測(cè)定過(guò)程簡(jiǎn)便快速。在生物界，生物分子的非共價(jià)特殊作用是分子識(shí)別的基礎(chǔ)。因此，非共價(jià)復(fù)合物的檢測(cè)在生物學(xué)上是一個(gè)重要的研究課題。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的ESI質(zhì)譜已經(jīng)成功地用于研究蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)一配體復(fù)合物的非共價(jià)結(jié)構(gòu)特征 以及蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)研究。雖然MALDITOF的較高靈敏度 和肼。表征范圍對(duì)于測(cè)定生物大分子物質(zhì)普遍優(yōu)于ESI質(zhì)譜，但是它在檢測(cè)非共價(jià)復(fù)合物的應(yīng)用上卻受到了供試品制備條件的限制。在這一過(guò)程中使用強(qiáng)的酸性

6、基質(zhì)或有機(jī)溶劑，一般不利于非共價(jià)復(fù)合物的形成；而且，由于存在激光的誘導(dǎo)以及基質(zhì)加合物的形成，常常干擾復(fù)合物的檢測(cè)；同時(shí) MALDITOF質(zhì)譜的相對(duì)較低的分辨率使得它不適合于在小分子與大分子亞基單元之間形成復(fù)合物的研究。這些缺點(diǎn)的存在，使其在分析研究非共價(jià)復(fù)合物方面的報(bào)道較少。不過(guò)這一領(lǐng)域的嘗試仍在繼續(xù)。例如：MALDITOF成功檢測(cè)了富勒醇與肌紅蛋白和血紅蛋白之間的強(qiáng)的相互作用，為富勒醇可能潛在的生物活性研究提供了可靠依據(jù)。與題目無(wú)關(guān)內(nèi)容，要倒扣分的哦1.2測(cè)定多糖近年來(lái)，人們對(duì)糖類(lèi)化合物的生理功能有了新的認(rèn)識(shí)，糖類(lèi)化合物繼蛋白質(zhì)、核酸之后，成為生命科學(xué)領(lǐng)域中的又一研究熱點(diǎn)。糖的性質(zhì)與其 QU

7、OTE 大小密切相關(guān)，因此糖 QUOTE 特別是多糖 QUOTE 分布的測(cè)定，在糖類(lèi)化合物的研究和應(yīng)用中有著重要的意義。傳統(tǒng)的多糖 QUOTE 測(cè)定方法，如滲透法、黏度 法、光散射法、凝膠色譜法等，不僅耗樣多、誤差大或受分子形狀的影響，且各方法所測(cè) QUOTE 的性質(zhì)不同，需要幾種方法配合使用很不方便。而糖本身高極性、難揮發(fā)的性質(zhì)以及多糖較高的和 QUOTE 其 QUOTE 的發(fā)散，使糖類(lèi)物質(zhì) QUOTE 的質(zhì)譜表征比較困難。但MALDIToF注意大小寫(xiě)在這一領(lǐng)域顯示出一定潛力和應(yīng)用前景。在測(cè)定多糖 QUOTE 時(shí)，往往得不到高質(zhì)量區(qū) QUOTE ，主要是聚合度低的分子優(yōu)先電離的趨勢(shì)抑制高 Q

8、UOTE ，多余的多糖離子化過(guò) 多余空格程。用凝膠柱處理過(guò)的多糖， QUOTE 分布范圍變小，得到的 MALDI譜圖效果變好。多糖的正、負(fù)離子基質(zhì)輔助激光解吸 電離質(zhì)譜(MAIDIMS)圖譜已無(wú)明顯差別。這意味著寡糖、多 糖的離子化過(guò)程可能不同寡糖在激光解吸電離過(guò)程，離子 的缺標(biāo)點(diǎn)形成主要是中性分子熱蒸發(fā)并隨后形成陽(yáng)離子化的過(guò)程。 隨著 QUOTE 的增加，這種熱力學(xué)解吸過(guò)程越來(lái)越困難。對(duì)高 QUOTE 多糖來(lái)說(shuō)，電離主要是依靠激光解吸電離的集合作用完成的，大量基質(zhì)分子共振吸收激光能量后，通過(guò)集合作用使基質(zhì)和供試品的固體溶液發(fā)生解聚，產(chǎn)生帶有隨機(jī)電荷量的分子簇和團(tuán)粒，并在向真空蒸發(fā)過(guò)程中冷卻，

9、留下帶電荷的大 QUOTE 供試品離子。這種情況下，正、負(fù)離子生成幾率差不多， 使得多糖的正、負(fù)離子MAlJDTTOF譜比較接近。綜上所述， 糖類(lèi)化合物輔助激光解吸電離的離子化過(guò)程與其 QUOTE 大小 有關(guān)。低 QUOTE 時(shí)，熱力學(xué)過(guò)程占主導(dǎo)地位；高 QUOTE 時(shí)，非熱力學(xué)過(guò)程占主導(dǎo)地位，這兩種過(guò)程的差異，導(dǎo)致了寡糖和多糖正負(fù)離子MALDITOF譜圖的差異。此結(jié)論顯示出MALDI TOF對(duì)多糖的應(yīng)用還需探索。1.3測(cè)定核苷酸核苷酸也是具有極其重要生理功能的大分子物質(zhì)，極性大，熱不穩(wěn)定，與蛋白質(zhì)類(lèi)似，MALDITOF在對(duì)核苷酸的 QUOTE 測(cè)定方面，顯示巨大潛力。用酶解法與MALDITO

10、F分析結(jié)合，可測(cè)定較多堿基的核苷酸的堿基序列。MALDITOF對(duì)固相合成法合成的大分子核苷酸進(jìn)行了測(cè)定準(zhǔn)確表征了其合成的功效。 MALDlTOF與傳統(tǒng)的磁式質(zhì)譜相比，其特點(diǎn)有可實(shí)現(xiàn)納秒量級(jí)的瞬時(shí)記錄，經(jīng)過(guò)多次瞬時(shí)記錄累加得到的質(zhì)譜圖，其信噪比得到了極大的改善。具有高的離子流通率，因而獲得高的靈敏度，僅需約l pmol的供試品即可測(cè)定。 原則上沒(méi)有 QUOTE 范圍限制 質(zhì)譜分析用于蛋白質(zhì)等生物活性分子的研究具有如下優(yōu)點(diǎn)：很高的靈敏度能為亞微克級(jí)試樣提供信息，能最有效地與色譜聯(lián)用，適用于復(fù)雜體系中痕量物質(zhì)的鑒定或結(jié)構(gòu)測(cè)定，同時(shí)具有準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及很好的普適性，提供樣品分子的相對(duì)分子質(zhì)量

11、和豐富的結(jié)構(gòu)信息，可用于大規(guī)模高通量分離分析和檢測(cè)。它以其高靈敏度、低供試 品消耗量、能確立分子式等優(yōu)點(diǎn)，在現(xiàn)代儀器分析中發(fā)揮著 越來(lái)越重要的作用。綜上所述，MALDITOF作為一個(gè)新技術(shù)，它已經(jīng)成為測(cè)定生物大分子的重要方法，尤其是蛋白組的研究中，可以鑒定細(xì)胞有哪些蛋白質(zhì)組，是不可缺少的方法2電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)。電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)(electrospray ionization mass spec trometry，ESIMS)是在毛細(xì)管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場(chǎng)使從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴， 隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷

12、的離子，致使分析物以單電荷或 多電荷離子的形式進(jìn)入氣相。電噴霧離子化的特點(diǎn)是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子，使質(zhì)量電荷比（m/z）降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測(cè)的范圍，因而大大擴(kuò)展了分子量的分析范圍，離子的真實(shí)分子質(zhì)量也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電荷數(shù)算出。 電噴霧電離質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)在于它能方便地與多種分離技術(shù)聯(lián)合使用，如液一不標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)聯(lián)用(LCMS)是將液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合而達(dá)到檢測(cè)大分子物質(zhì)的目的。優(yōu)缺點(diǎn)：（1）對(duì)樣品的消耗少，不會(huì)造成樣品的大量浪費(fèi)（2）對(duì)樣品分子質(zhì)量測(cè)試的靈敏度，分辨力和準(zhǔn)確度都相當(dāng)高（3）能夠方便地與多種分離技術(shù)聯(lián)用，如毛細(xì)管電泳，高效液相色譜等，是解決非揮發(fā)性，熱不穩(wěn)定性，極性強(qiáng)的復(fù)

13、雜組分化合物的定性定量的高靈敏度檢測(cè)方法。3.FT Orbitrap（傅立葉變換靜電場(chǎng)軌道阱）一個(gè)質(zhì)譜分成3個(gè)來(lái)說(shuō)，你這算偷工減料嗎？在 1999 年的 ASMS 上，質(zhì)譜學(xué)家 Alexander Makarov 報(bào)告用一種新的質(zhì)量分析器靜電場(chǎng)軌道阱進(jìn)行高分辨和精確質(zhì)量數(shù)測(cè)量。第一臺(tái)Orbitrap質(zhì)譜儀誕生于2001年，在愛(ài)丁堡大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室使用。Orbitrap 是近20多年來(lái)質(zhì)量分析器的突破性技術(shù)。這是一種采用新結(jié)構(gòu) 質(zhì)量分析器和突破性技術(shù)的質(zhì)譜儀器，離子在質(zhì)量分析器里作軌道旋轉(zhuǎn)和振蕩，Orbitrap 質(zhì)譜儀的檢測(cè)方式是通過(guò)離子的旋轉(zhuǎn)振蕩產(chǎn)生的鏡像電流，經(jīng)微分放大后由 FT 變換器轉(zhuǎn)換為

14、各離子的振蕩頻率，最后計(jì)算出分子離子的質(zhì)核比(m/z)。這種通過(guò)頻率來(lái)測(cè)量質(zhì)核比的方式，可以得到超高的分辨率，Orbitrap的質(zhì)量分辨率介于FT ICR（傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜）和TOF（飛行時(shí)間質(zhì)譜)之間,最高分辨率可達(dá)到10 萬(wàn)。繼 2001 年第一臺(tái)商品化的 Orbitrap 誕生后，ThermoFisher在 2005 年 ASMS 上推出在結(jié)構(gòu)、功能上創(chuàng)新擴(kuò)展的第二代高性能 Orbitrap 質(zhì)譜儀，即LTQ Orbitrap，這是把線性離子阱多級(jí)質(zhì)譜和高分辨質(zhì)譜結(jié)合的雜交型質(zhì)譜儀，低、高分辨質(zhì)量分析器在空間上正交排列，具有多種組合掃描模式，可提供詳細(xì)、高質(zhì)量的質(zhì)譜信息，對(duì)一個(gè)

15、化合物的結(jié)構(gòu)作更全面的描述，提高對(duì)復(fù)雜體系結(jié)構(gòu)確證的能力。LTQ Orbitrap 質(zhì)譜性能穩(wěn)定可靠，使用維護(hù)方便，日常消耗低，滿(mǎn)足普通實(shí)驗(yàn)室高標(biāo)準(zhǔn)的分析要求，使之真正成為一個(gè)實(shí)用性強(qiáng)的分析工具。LTQ Orbitrap 自從 2005 年6 月上市后，很快得到質(zhì)譜工作者的接受，并在各重要研究領(lǐng)域被廣泛使用， 主要應(yīng)用范圍涉及生命科學(xué)、藥物研發(fā)、司法檢驗(yàn)和食品安全等領(lǐng)域 ：（1）蛋白組學(xué)研究中蛋白質(zhì)鑒定、翻譯后修飾、尋找生物標(biāo)記物 ;（2）藥物發(fā)現(xiàn) 和開(kāi)發(fā)各階段，代謝產(chǎn)物鑒定，藥物和蛋白質(zhì)的相 互作用 ;（3）代謝組學(xué)和各種差異比較定量和顯著差異成份的結(jié)構(gòu)鑒定等這一段無(wú)關(guān)內(nèi)容可刪除Orbitr

16、ap的工作原理：質(zhì)量分析器形狀如同仿棰體，由仿棰形中心內(nèi)電極和左右 2 個(gè)外仿棰半電極組成。Orbitrap 對(duì)離子的操作步驟分為離子捕獲、旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)、軸向振動(dòng)和鏡像電流檢測(cè)。儀器工作時(shí)，在中心電極逐漸加上直流高壓，在 Orbitrap 內(nèi)產(chǎn)生特殊幾何結(jié)構(gòu)的靜電場(chǎng)。當(dāng)離子進(jìn)入到 Orbitrap 室內(nèi)后，受到中心電場(chǎng)的引力，即開(kāi)始圍繞中心電極作圓周軌 道運(yùn)動(dòng)，m/z 高的離子有較大的軌道半徑。同時(shí)離子受到垂直方向的離心力和水平方向的推力，而沿 中心內(nèi)電極作水平和垂直方向的震蕩。外電極除限制離子的運(yùn)行軌道范圍，同時(shí)檢測(cè)由離子振蕩產(chǎn)生的感應(yīng)電勢(shì)，其中水平震蕩的頻率和分子離子的質(zhì)荷比 (m/z) 的關(guān)

17、系可由以下數(shù)學(xué)公式 QUOTE = QUOTE 后半截是啥意思？來(lái)描述，可見(jiàn)軸向頻率 QUOTE 與離子的初始狀態(tài)是無(wú)關(guān)的,這種不相關(guān)性造就 Orbitrap 具有高分辨率和高質(zhì)量準(zhǔn)確度的特性。從 Orbitrap 的每個(gè)外電極輸出的時(shí)域信號(hào)經(jīng)過(guò)微分放大器放大后由快速傅立葉轉(zhuǎn)換變成頻域譜，頻域譜再進(jìn)而轉(zhuǎn)換為質(zhì)譜，然后在 Xcalibur 質(zhì)譜軟件中處理輸出.質(zhì)譜方法是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)，質(zhì)譜數(shù)據(jù)可提供蛋白質(zhì)的分子量、氨基酸序列、翻譯后修飾及位點(diǎn)、差異蛋白比較等信。LTQ Orbitrap Velos 可對(duì)蛋白質(zhì)酶切后的眾多肽段的精確分子量和二級(jí)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定，再經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，得到蛋白質(zhì)組

18、的高通量鑒定。Orbitrap 質(zhì)量分析器使得代謝組學(xué)的整體研究手段得以進(jìn)一步簡(jiǎn)化。例如，LTQ Orbitrap 的分辨率使得色譜分離過(guò)程大大精簡(jiǎn)。生物樣品可以被直接引入測(cè)定。這種方法的有效性已經(jīng)在基質(zhì)效應(yīng)、線性相關(guān)和定量精密度方面被逐一格式不對(duì)，語(yǔ)句不通。 Orbitrap 是近 25 年來(lái)質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)量分析器的一個(gè)重大突破，雙分壓線性阱技術(shù)使離子阱的質(zhì)譜性能又一次得到的提高，二者的組合 LTQ Orbitrap Velos 使得在一個(gè)質(zhì)譜平臺(tái)上兼?zhèn)漕I(lǐng)先的高分辨和多級(jí)質(zhì)譜測(cè)量能力，并第一次實(shí)現(xiàn)低分辨和高分辨平行檢測(cè)功能。而操作特點(diǎn)包括運(yùn)行穩(wěn)定可靠，使用維護(hù)方便，運(yùn)行消耗低。是一種可被用于復(fù)雜

19、研究體系和常規(guī)挑戰(zhàn)分析檢測(cè)的高端質(zhì)譜儀器，在蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等前沿研究領(lǐng)域是不可缺少的主要工具，也是非目標(biāo)成份篩選、化合物結(jié)構(gòu)確證和復(fù)雜樣品定量最先進(jìn)的分析方大量無(wú)關(guān)內(nèi)容，關(guān)于分子量測(cè)定沒(méi)有明確提到4.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳方法可對(duì)蛋白質(zhì)的組分進(jìn)行分離，并可精確測(cè)得蛋白質(zhì)的分子量，常用的方法為SDSPAGE不連續(xù)系統(tǒng)。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理：聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺和N， QUOTE -亞甲基雙丙烯酰胺經(jīng)共聚合而成，此聚合過(guò)程是由四甲基乙二胺和過(guò)硫酸胺激發(fā)的，被激活的單體和未被激活的單體開(kāi)始了多聚鏈的延伸，正在延伸的多聚鏈也可以隨機(jī)地接上雙丙烯

20、酰胺，使得多聚鏈交叉互連成為網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，最終多聚鏈聚合成凝膠狀。在一定條件下，蛋白質(zhì)，多肽在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和核酸在聚丙烯酰胺凝膠電泳 及瓊脂糖凝膠電泳中，其分子量與電泳遷移率符合的關(guān)系在精確測(cè)定與計(jì)算相對(duì)遷移率時(shí)，要求分別測(cè)定樣品區(qū)帶中心及指標(biāo)劑染料區(qū)帶中心(通常插入銅絲作為標(biāo)記)與凝膠頂端(聚丙烯酰胺凝膠電泳)或點(diǎn)樣孔(瓊脂糖凝膠電泳)空行為啥？間的距 QUOTE 這句沒(méi)完啊，怎么換下一句了？SDS是十二烷基硫酸鈉的簡(jiǎn)稱(chēng)，它是一種陰離子表面活性劑，加入到電泳系統(tǒng)中能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上（在一定條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合比為1.4gSDS/1g蛋

21、白質(zhì)），使各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而使其電泳遷移率只取決于分子大小這一因素，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)和遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可求得未知物的分子量。SDS 電泳法是實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用最普遍的方法,分為還原電泳和非還原電泳,非還原電泳中二硫鍵未打開(kāi),還原電泳中二硫鍵被還原,蛋白質(zhì)分子能充分伸展, 兩者相比 ,還原電泳的測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確。優(yōu)缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)成本較低，樣品用量少，時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，儀器設(shè)備也相對(duì)很簡(jiǎn)單，一套電泳裝置即可，分辨率高。但是精確程度相對(duì)較低，好的電泳圖譜需要一定的技術(shù)，5. 凝膠滲透色譜（GPC）GPC 是一種用溶劑作流

22、動(dòng)相，多孔性填料或凝膠作為分離介質(zhì)的柱色譜，主要根據(jù)溶液中分子體積 ( 或稱(chēng)分子的流體力學(xué)體積 ) 大小的不同作為分離基礎(chǔ)，使被分離樣品按分子量大小先后流出色譜柱。凝膠床由多孔溶脹凝膠組成，當(dāng)樣品通過(guò)色譜柱時(shí)，物質(zhì)在柱中受到固定相的阻滯作用，分子量大的不能滲入凝膠顆粒，只能沿溶脹凝膠顆粒間的孔隙隨溶劑流動(dòng)，受到的阻滯作用小，移動(dòng)速度快，流程短而先流出色譜柱；分子量小的將滲入凝膠顆粒，受到的阻滯作用大，移動(dòng)流速慢，流程長(zhǎng)而較后流出色譜。優(yōu)缺點(diǎn)：這個(gè)優(yōu)缺點(diǎn)是跟上面幾種方法比較嗎？那就不太準(zhǔn)確了哦。這部分太少。建議把后兩種先說(shuō)，最后說(shuō)質(zhì)譜法凝膠滲透色譜法分離速度快，分析時(shí)間短，重復(fù)性好，進(jìn)樣量少，自

23、動(dòng)化程度高，但設(shè)備投入大，價(jià)格較高。總結(jié)MALDlTOF具有很高的靈敏度能為亞微克級(jí)試樣提供信息，能最有效地與色譜聯(lián)用，準(zhǔn)確度高分子量范圍大，掃描速度快，儀器結(jié)構(gòu)，簡(jiǎn)單分辨率低的特點(diǎn)。但是TOF 的實(shí)際操作分辨率 (30000) 和其它性能是這些高分辨質(zhì)譜中相對(duì)較低的，且測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性受操作條件影響大，主要表現(xiàn)為需要恒定的環(huán)境溫度，樣品分析時(shí)要添加內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)校正,相對(duì)麻煩。相比Orbitrap的這種儀器，儀器比較大型，搬運(yùn)比較困難，維護(hù)成本高。除了MALDlTOF，的優(yōu)點(diǎn)，Orbitrap還具備體積比較小，方便攜帶使用，多功能，易操作，矯正周期長(zhǎng)，基本一個(gè)月矯正一次，但是其昂貴的價(jià)格、高額的運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)，Orbitrap使得這種高端質(zhì)譜儀難以在各領(lǐng)域，尤其被作為常規(guī)分析儀器被推廣，一直是為少數(shù)專(zhuān)家所掌握和用于研究性實(shí)驗(yàn)室的高端應(yīng)用。電噴霧質(zhì)譜法是目前測(cè)定蛋白質(zhì)分子量最準(zhǔn)確的方法之一 。 比如牛胰蛋白酶的實(shí)際分子量是23290Da , 質(zhì)譜的測(cè)定結(jié)果為 23293Da , 系統(tǒng)誤差在 0 .02 %以?xún)?nèi), 但是質(zhì)譜儀價(jià)格昂貴，對(duì)于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)無(wú)法購(gòu)買(mǎi)使用。 SDS 電泳法是實(shí)驗(yàn)