藥物分析教學課件：第十六章抗生素類藥物的分析

1、1第十六章 抗生素類藥物的分析 2學習要求掌握：抗生素類藥物的類型、結構、質量和穩(wěn)定性特點、以及分析方法。熟悉：各類抗生素藥物的有關物質來源、特點和檢查方法。 了解：抗生素藥物的體內樣品分析方法和臨床監(jiān)測應用。3第一節(jié) 概述第二節(jié) -內酰胺類抗生素第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 第四節(jié) 四環(huán)素類抗生素第五節(jié) 抗生素類藥物中高分子雜質的檢查 4四環(huán)素牙是怎么形成的?為什么特別強調抗生素的合理用藥?為什么抗生素要做過敏試驗？思考題5抗生素定義 在低濃度下即可對某些生物的生命活動有特異抑制作用的化學物質的總稱。主要由生物發(fā)酵、經(jīng)化學純化、精制和化學修飾等過程，最后制成適當制劑。 抗生素是細菌、放線菌和真菌

2、等微生物的代謝產(chǎn)物，對各種病原微生物有強大的抑制或殺滅作用。6 抗生素(Antibiotics)類藥物是臨床上常用的一類重要藥物，臨床使用的抗生素的主要是生物合成，經(jīng)過發(fā)酵和提純兩步制得；也有少數(shù)是利用化學合成或半合成方法制得。ChP2010共收載抗生素類原料藥及其各種制劑近300個品種。 7一、抗生素藥物的作用特點化學純度較低：同系物多、異構體多、降解物多如四環(huán)素類存在脫水、差向異構體。 頭孢他定 95 0%；頭孢拉定90.0%； 頭孢曲松鈉84.0%活性組分易發(fā)生變異：微生物菌株改變、發(fā)酵條件變化穩(wěn)定性差：結構中含活潑基團 內酰胺環(huán) 鏈霉素結構中的醛基8二、抗生素類藥物的分類 1.根據(jù)產(chǎn)生

3、抗生素的生物來源分類 細菌產(chǎn)生的抗生素、真菌產(chǎn)生的抗生素、放線菌產(chǎn)生的抗生素、高等植物產(chǎn)生的抗生素(穿心蓮內酯、小檗堿）、動物產(chǎn)生的抗生素（抗菌肽)； 2. 根據(jù)抗生素的作用對象分類 抗革蘭氏陽性菌的抗生素、抗革蘭氏陰性菌的抗生素、廣譜抗生素、抗真菌的抗生素、抗腫瘤的抗生素、抗病毒及抗原蟲系昆蟲的抗生素、抗結核分枝桿菌的抗生素； 3. 根據(jù)抗生素的作用機制分類 抑制細胞壁合成的抗生素、影響細胞膜功能的抗生素、抑制和干擾細胞蛋白質合成的抗生素、抑制細胞核酸合成的抗生素、抑制細菌生物能作用的抗生素； 4. 根據(jù)抗生素的化學結構分類 其中以作用對象、化學結構不同進行分類是較常用的，前者對于臨床選用抗

4、生素帶來一定方便，后者有利于抗生素工業(yè)生產(chǎn)和質量分析研究。按照化學結構分類共分為以下九大類。 9 (1) -內酰胺類抗生素 (2) 四環(huán)類抗生素-米諾環(huán)素、多烯四環(huán)素、金霉素 、美他環(huán)素 (3) 氨基糖苷類抗生素 鏈霉素、慶大、妥布、阿米卡星、 (4) 大環(huán)內酯類抗生素 克拉霉素、阿奇霉素、琥乙紅霉素 (5) 多烯大環(huán)類抗生素 兩性霉素B、制霉菌素 (6) 多肽類抗生素-鹽酸萬古霉素、硫酸多粘菌素 (7) 酰胺醇類抗生素-氯霉素、甲砜霉素、 (8) 抗腫瘤類抗生素-絲裂霉素 、多柔比星、柔紅霉素 (9) 其它抗生素 克林霉素、磷霉素、美洛西林鈉等根據(jù)抗生素的化學結構分類 10恩拉霉素A：R=C

5、H3 恩拉霉素B：R=C2H511 本章主要討論-內酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類抗生素物理化學性質鑒別反應雜質檢查含量測定方法與原理。關于生物學方法(如異常毒性、熱原、降壓物質、無菌、生物效價測定法等)，根據(jù)專業(yè)要求，在此不贅述(需要進一步了解，參考ChP2010二部附錄)。 12 在長期的抗生素選擇之后出現(xiàn)的對相應抗生素產(chǎn)生耐受能力的微生物，統(tǒng)稱耐藥菌。所謂細菌耐藥性(bacterial resistance)又稱抗藥性，是指細菌產(chǎn)生的對抗菌藥不敏感的現(xiàn)象，是細菌自身生存過程的一種特殊表現(xiàn)形式。 1. 耐藥性的種類 2. 耐藥的機制三、抗生素類藥物的細菌耐藥性13 抗生素類藥物的質量控制方法

6、與一般化學藥品一樣，通過鑒別、檢查、含量(效價)測定三個主要方面來判斷其質量的優(yōu)劣。由于抗生素類藥物的特點，其分析方法可分為理化方法和生物學法兩大類。 四、抗生素藥物的質量分析14抗生素類藥物的鑒別試驗主要為理化方法，常用方法有： 1. 官能團的顯色反應 如-內酰胺環(huán)的羥肟酸鐵反應；鏈霉素的麥芽酚反應、坂口反應。對于抗生素鹽類，通常鑒別酸根或金屬離子或有機堿。 2. 光譜法 包括紅外光譜與紫外吸收光譜的鑒別?？股氐募t外光譜分析時需注意，由于抗生素存在多晶現(xiàn)象，有時對照品與供試品圖譜或對照圖譜不一致，最好用相同溶劑同時重結晶供試品和對照品，使處于相同晶型情況下再進行測定，若多晶效應是由于研磨和

7、壓片過程中的晶相轉變所致，則應采用溶液法試驗。 3. 色譜法 包括TLC和HPLC法，采用對照品或標準品對照法。 4. 生物學法 是檢查抗生素滅活前后的抑菌能力，并與已知含量的對照品對照后進行鑒別，此法已很少應用。 (一) 鑒別試驗15 1. 影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的檢查項目 結晶性、酸堿度、水分或干燥失重等； 2. 控制有機和無機雜質的檢查項目 溶液的澄清度與顏色、有關物質、殘留溶劑、熾灼殘渣、重金屬等； 3. 與臨床安全性密切相關的檢查項目 異常毒性、熱源或細菌內毒素、降壓物質、無菌等； 4. 其他檢查項目 對于多組分抗生素還要進行組分分析等(如硫酸慶大霉素的“慶大霉素C組分的測定”)。此外，有些

8、抗生素還規(guī)定 “懸浮時間與抽針試驗”(如注射用普魯卡因青霉素)、 “聚合物”(如-內酰胺類抗生素)、“雜質吸光度”(如四環(huán)素類抗生素)等。 (二) 檢查16 1. 微生物檢定法 本法系在適宜條件下，根據(jù)量反應平行線原理設計，通過檢測抗生素對微生物的抑制作用，計算抗生素活性(效價)的方法。測定方法可分為管碟法和濁度法：管碟法是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內的擴散作用，比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測定供試品效價的一種方法。濁度法是利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對試驗菌生長的抑制作用，通過測定培養(yǎng)后細菌濁度值的大小，比較標準品與供試品對試驗菌生長抑制的程度，以測定供試品效價的一種方法

9、。 (三) 含量或效價測定17（三）含量測定1、微生物檢定法定義：以抗生素對微生物的殺傷或抑菌程度為指標來衡量抗生素效價。測定方法：分為稀釋法、比濁法和管碟瓊脂擴散法。優(yōu)點：靈敏度高、需用量少，測定結果較直觀。測定原理與臨床應用一致，適用范圍廣。是抗生素測定的基本方法。缺點：操作步驟多，測定時間長，誤差大。常用于多組分或結構復雜抗生素。18管碟法抗生素效價測量-實驗 1.1 實驗器材的選擇1.2 實驗器材的清洗2.1 樣品與標準品溶液的配制 2.2 培養(yǎng)基與緩沖液的配制 3.1 加注底層培養(yǎng)基3.2 加注培養(yǎng)基菌層 4. 放置小鋼管 5. 滴加抗生素溶液 6. 雙碟中菌株的培養(yǎng) 7. 抑菌圈測

10、量 19管碟法又稱管碟瓊脂擴散法 是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內的擴散作用，比較標準品與供試品二者對接種的試驗菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測定供試品效價的一種方法。在一定范圍內，抗生素溶液的對數(shù)濃度（劑量）與抑菌圈面積或直徑成正比，根據(jù)抑菌圈的大小計算出抗生素溶液的濃度。 20T2S1S2T1管碟法21Size of Cylinder CupT2S1S2T1管碟法222、理化方法根據(jù)抗生素的分子結構特點，利用其特有的化學或物理化學性質及反應而進行的。優(yōu)點：對于提純的產(chǎn)品以及化學結構已確定的抗生素，能較迅速、準確地測定其效價，具較高專屬性。缺點：對含有同樣官能團雜質的供試品不適用。不一定代表生物效價。23

11、3、抗生素活性表示方法以效價表示，即指每毫升或每毫克中含有某種抗生素的有效成分的多少。用u/mL或g/mg表示。舉例1：1mg青霉素鈉定為1670單位,則1mg青霉素鉀的效價 1670X356.4/372.5=1598u/mg(青霉素/青霉素鈉):1670=(青霉素/青霉素鉀):X舉例2：青霉素V鉀24 微生物檢定法的優(yōu)點是靈敏度高、需用量小，測定結果較直觀；測定原理與臨床應用的要求一致，更能確定抗生素的醫(yī)療價值；而且適用范圍廣，較純的精制品、純度較差的制品、已知的或新發(fā)現(xiàn)的抗生素均能應用；對同一類型的抗生素不需分離，可一次測定其總效價，是抗生素藥物效價測定的最基本的方法。但其存在著操作步驟多

12、，測定時間長，誤差大等缺點，隨著抗生素類藥物的發(fā)展和分析方法的進步，理化方法逐漸取代了生物學法，但對于分子結構復雜、多組分的抗生素，生物學法仍然是首選的效價測定方法。 25 2. 理化方法 是根據(jù)抗生素的分子結構特點，利用其特有的化學或物理化學性質及反應而進行的。對于提純的產(chǎn)品以及化學結構已確定的抗生素，能較迅速、準確地測定其效價，并具有較高的專屬性。但本法也存在不足：如化學法通常是利用抗生素化學結構上官能團的特殊化學反應，對含有具同樣官能團雜質的供試品就不適用，或需采取適當方法加以校正。而且當該法是利用某一類型抗生素的共同結構部分的反應時，所測得的結果，往往只能代表藥物的總含量，并不一定能代

13、表抗生素的生物效價。因此，通常在以理化方法測定抗生素含量時，不但要求方法正確可靠、具有專屬性、操作簡單、省時、試劑易得、樣品用量少，而且要求測定結果必須與生物效價吻合。目前世界各國藥典所收載的抗生素的理化方法主要是HPLC法，如-內酰胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內酯類等抗生素大多采用HPLC法測定含量。 26 3. 抗生素活性表示方法 抗生素的活性以效價單位表示，即指每毫升或每毫克中含有某種抗生素的有效成分的多少。效價是以抗菌效能(活性部分)作為衡量的標準，因此，效價的高低是衡量抗生素質量的相對標準。效價用單位(U)或微克(g)表示。各種抗生素的效價基準是人們?yōu)榱松a(chǎn)科研方便而規(guī)定的，如1mg青霉素鈉

14、定為1670 U；1mg慶大霉素定為590 U；1mg硫酸卡那霉素定為670 U。一種抗生素有一個效價基準，同一種抗生素的各種鹽類的效價可根據(jù)其分子量與標準鹽類進行換算。例1mg青霉素鉀的單位(U)=1670356.4/372.5=1598 U/mg。以上為抗生素的理論效價，實際樣品往往低于該理論效價。 27第二節(jié) -內酰胺類抗生素 本類抗生素包括青霉素類和頭孢菌素類，它們的分子結構中均含有-內酰胺環(huán)，因此統(tǒng)稱為-內酰胺類抗生素。 28青霉素類6-APA6-APA*143229 發(fā)展史1929年，弗來明(Alexander Fleming) 發(fā)現(xiàn)青霉素。1958年謝漢合成6-氨基青霉烷酸(6-

15、APA)成功。開創(chuàng)了半合成青霉素的時代1961年，頭孢菌素C被發(fā)現(xiàn)，頭孢菌素迅速發(fā)展。80年代:廣譜碳青霉烯類上市。30發(fā)現(xiàn)第一個用于臨床的抗生素由青霉菌的培養(yǎng)液中分離而得31發(fā)現(xiàn)-偶然性在1928年夏弗萊明外出度假時，把實驗室里在培養(yǎng)皿中正生長著細菌這件事給忘了。3周后當他回實驗室時，注意到 一個與空氣意外接觸過的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)皿中長出了一團青綠色霉菌。在用顯微鏡觀察這只培養(yǎng)皿時弗萊明發(fā)現(xiàn)，霉菌周圍的葡萄球菌菌落已被溶解。這意味著霉菌的某種分泌物能抑制葡萄球菌。此后的鑒定表明，上述霉菌為點青霉菌，因此弗萊明將其分泌的抑菌物質稱為青霉素。然而遺憾的是弗萊明一直未能找到提取高純度青霉素的方法

16、，于是他將點青霉菌菌株一代代地培養(yǎng)，并于1939年將菌種提供給準備系統(tǒng)研究青霉素的英國病理學家弗洛里（Howard Walter Florey）和生物化學家錢恩。32 田中幾乎沒有發(fā)表過什么論文。僅有的幾篇也只是發(fā)表在不是很重要的會議和雜志上。他與日本學術界幾乎沒有任何交往。以至于前天晚上獲獎的消息傳來時，日本學術界措手不及。在電視臺采訪去年的諾貝爾化學獎獲獎者名古屋大學野依良治教授時，該教授透露他剛與前年的獲獎者白川英樹教授聯(lián)系過，都不知道田中耕一何許人也。最后，該教授只能結結巴巴地說：這說明只要自己努力，不在學術界活躍也能得到諾貝爾獎。與田中有一面之交的另一位教授也找不到話來稱贊他，只是籠

17、統(tǒng)地說：人很老實，工作熱心。再問如何相識時，原來教授也只是因為買了島津制作所的分析儀器，聽過一次田中作的產(chǎn)品介紹。 333435細心與協(xié)作精神的勝利青霉素的發(fā)現(xiàn)始于一個現(xiàn)象的意外觀察，而我唯一的功勞僅是沒有忽視觀察。 A.Fleming36細心與協(xié)作精神的勝利化學家和經(jīng)過生物學訓練或具有生物學知識的行家之間的合作是非常關鍵之處，這也是在此之前對大批已知抑制劑的研究成果甚少的原因之所在。 Florey37發(fā)現(xiàn)-偶然性2田中耕一基質輔助激光解吸質譜（對生物大分子的質譜分析法 ）牛頓-萬有引力0.004%甲酸機會總是給有準備的人留著的,當機會到來時,你準備好了嗎?38頭孢菌素類7-ACA*12435

18、639一、化學結構與性質青霉素類的基本結構頭孢菌素的基本結構1.化學結構：-內酰胺環(huán)側鏈A：-內酰胺環(huán)B：氫化噻唑環(huán)青霉素類（penicillins）側鏈A：-內酰胺環(huán)B：氫化噻嗪環(huán)頭孢菌素類（cephalosporins）AB6-APA 7-ACA 40藥物名稱物理性質鑒別檢查含量測定阿莫西林Amoxicillin白色或類白色結晶性粉末；味微苦。在水中微溶，在乙醇中幾乎不溶。D(水溶液) +290o+315o。1. TLC或HPLC2. IR1. 有關物質：HPLC；2. 阿莫西林聚合物；3. 殘留溶劑：丙酮與二氯甲烷；4. 水分HPLC法阿莫西林鈉Amoxicillin Sodium白色或

19、類白色粉末或結晶；無臭或微臭，味微苦；有引濕性。在水或乙醇中易溶，在乙醚中不溶。D(水溶液) +240o+290o。1. TLC或HPLC2. IR3. 鈉鹽的鑒別1. 有關物質：HPLC；2. 殘留溶劑：乙醇與乙酸甲酯；3. 2-乙基己酸；4. 水分；5. 可見異物；6. 不溶性微粒；7. 細菌內毒素；8. 無菌HPLC法青霉素鉀Phenoxymethylpenicillin Potassium白色結晶或結晶性粉末；無臭或微臭，微苦。在水中易溶，在三氯甲烷、乙醚或液體石蠟中幾乎不溶。D(水溶液) +215o+230o。1. HPLC2. IR3. 鉀鹽的鑒別1. 吸光度；2. 結晶性；3.

20、有關物質：HPLC；4. 青霉素聚合物；5. 水分HPLC法青霉素鈉Benzylpenicillin Sodium白色結晶性粉末；無臭或微有特異性臭；有引濕性；遇酸、堿或氧化劑等即迅速失效，水溶液在室溫放置易失效。在水中極易溶解，在乙醇中溶解，在脂肪油或液狀石蠟中不溶。1. HPLC2. IR3. 鈉鹽的鑒別1. 吸光度；2. 結晶性；3. 有關物質：HPLC；4. 青霉素聚合物；5. 可見異物；6. 不溶性微粒；7. 細菌內毒素；8. 無菌HPLC法氨芐西林Ampicillin白色結晶性粉末；味微苦。在水中微溶，在三氯甲烷、乙醇、乙醚或不揮發(fā)油中不溶；在稀酸溶液或稀堿溶液中溶解。D(水溶液)

21、 +280o+305o。1. TLC或HPLC2. IR1. 有關物質：HPLC；2. N,N-二甲基苯胺：GC；3. 水分HPLC法普魯卡因青霉素Procaine Benzylpenicillin白色微晶性粉末；遇酸、堿或氧化劑等即迅速失效。在甲醇中易溶，在乙醇或三氯甲烷中略溶，在水中微溶。D(水溶液) +280o+305o。1. TLC或HPLC2. IR1. 有關物質：HPLC；2. 青霉素聚合物；3. 殘留溶劑：乙酸乙酯與正丁醇；4. 水分；5. 細菌內毒素；6. 無菌HPLC法-內酰胺類抗生素部分原料藥的物理性質、鑒別、檢查和含量測定 41-內酰胺類抗生素部分原料藥的物理性質、鑒別、

22、檢查和含量測定 藥物名稱物理性質鑒別檢查含量測定頭孢他啶Ceftazidime白色或類白色結晶性粉末；無臭或微有特臭。在磷酸鹽緩沖液(pH6.0)中略溶，在水或甲醇中微溶，在丙酮或三氯甲烷中不溶。E1% 1cm(磷酸鹽緩沖液 pH6.0) 400430。1. HPLC2. IR1. 有關物質：HPLC；2. 頭孢他啶聚合物；3. 吡啶：HPLC；4. 可見異物；5. 不溶性微粒；6. 細菌內毒素；7. 無菌HPLC法頭孢克洛Cefaclor白色至微黃色粉末或結晶性粉末，微臭。在水中微溶，在甲醇、乙醇、三氯甲烷或二氯甲烷中幾乎不溶。 D(水溶液) +105o+120o。E1% 1cm(水溶液)

23、230255。1. TLC或HPLC2. IR1. 有關物質：HPLC；2. 殘留溶劑：二氯甲烷；3. 水分HPLC法頭孢呋辛酯Cefuroxime axetil白色或類白色粉末；幾乎無臭，味苦。在丙酮中易溶，在三氯甲烷中溶解，在甲醇或乙醇中略溶，在乙醚中微溶，在水中不溶。E1% 1cm(甲醇) 390420。1. HPLC2. IR1. 結晶性；2. 異構體：HPLC；3. 有關物質：HPLC；4. 水分HPLC法頭孢拉定Cephradine白色或類白色結晶性粉末；微臭。在水中略溶，在乙醇、三氯甲烷或乙醚中幾乎不溶。D(醋酸鹽緩沖液 pH4.6) +80o+90o。1. TLC或HPLC2.

24、 IR1. 結晶性；2. 頭孢氨芐：HPLC；3. 有關物質：HPLC；4. 頭孢拉定聚合物；5. 水分；6. 可見異物；7. 不溶性微粒；8. 細菌內毒素；9. 無菌HPLC法頭孢氨芐Cefalexin白色或乳黃色結晶性粉末；微臭。在水中微溶，在乙醇、三氯甲烷或乙醚中不溶。D(水溶液) +149o+158o。 E1% 1cm(水溶液)220245。1. HPLC2. IR1. 有關物質：HPLC；2. 水分HPLC法頭孢羥氨芐Cefadroxil白色或類白色結晶性粉末，有特異臭味。在水中微溶，在乙醇、三氯甲烷或乙醚中幾乎不溶。1. 三氯化鐵反應2. HPLC 3. IR1. 結晶性2. 有關

25、物質：HPLC 3. 水分HPLC法頭孢替唑鈉CeftezoleSodium白色至淡黃色結晶性粉末；無臭，有引濕性。在水中易溶，在甲醇中微溶，在乙醇和乙醚中幾乎不溶。D(水溶液) -5o-9o。E1% 1cm(水溶液)270300。1. UV2. HPLC3. IR4. 鈉鹽的鑒別1. 有關物質：HPLC；2. 頭孢替唑聚合物；3. 水分；4. 可見異物；5. 不溶性微粒；6. 細菌內毒素；7. 無菌HPLC法頭孢噻吩鈉Cefalotin Sodium白色或類白色的結晶性粉末；幾乎無臭。在水中易溶，在乙醇中微溶，在三氯甲烷和乙醚中不溶。D(水溶液)+124o+134o。1. HPLC2. IR

26、3. 鈉鹽的鑒別1. 吸光度；2. 有關物質：HPLC；3. 頭孢噻吩聚合物；4. 殘留溶劑：乙醇與丙酮；5. 2-乙酸己酸；6. 水分；7. 可見異物；8. 不溶性微粒；9. 細菌內毒素；10. 無菌HPLC法青霉素（青霉素G、芐青霉素） 氨芐西林（氨芐青霉素）頭孢氨芐頭孢拉定44酸性結構與性質2、與堿金屬(Na+、K+)成鹽 ，（1）酸性與溶解度 羧基 易溶于水 Na45與有機堿(普魯卡因)成鹽 難溶于水普魯卡因青霉素46（2）(5%頭孢唑啉鈉溶液 1824)頭孢菌素類 C6 C7青霉素類 C2 C5 C6 旋光性（手性C）47 （3）共軛體系 頭孢菌素類 母核有共軛體系 青霉素類 母核無

27、明顯UV 多數(shù)有苯環(huán)取代基 UV48青霉素鈉UV7-2049（4）內酰胺環(huán) 水溶液 不穩(wěn)定 干燥純凈 穩(wěn)定 不穩(wěn)定性因素四元環(huán)張力大 酰胺鍵易水解 50100-青霉噻唑?；u胺酸青霉素青霉烯酸青霉噻唑酸青霉酸青霉醛青霉胺圖 青霉素的降解反應51例青霉素的降解反應青霉素青霉噻唑酸H2O/OH青霉素酶青霉酸H2OpH2100青霉噻唑?；u胺酸NH2OH青霉烯酸pH4青霉胺CO2青霉醛HgCl252圖 頭孢噻吩鈉降解產(chǎn)物圖 53二、鑒別試驗 本類藥物的鑒別試驗，現(xiàn)版ChP，USP，BP采用的方法主要為HPLC、IR和TLC法。 (一) 色譜法 (二) 光譜法 (三) 呈色反應 (四) 各種鹽的反應5

28、4(一) 色譜法 利用比較供試品溶液主峰與對照品溶液主峰的保留時間(tR)是否一致或比較供試品溶液與對照品溶液所顯主斑點的位置和顏色是否相同進行鑒別。HPLC法一般都規(guī)定在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰應與對照品溶液主峰的保留時間一致。中國藥典對鑒別試驗中有HPLC法又有TLC法的，規(guī)定可在兩種鑒別方法中選做一種。 55 (二) 光譜法 1. 紅外吸收光譜(IR) 紅外吸收光譜反映了分子的結構特征，各國藥典對收載的-內酰胺類抗生素幾乎均采用了本法進行鑒別。該類抗生素的-內酰胺環(huán)羰基的伸縮振動(1750cm-11800cm-1)，仲酰胺的氨基、羰基的伸縮振動(3300cm-1，152

29、5 cm-1，1680 cm-1)、羧酸離子的伸縮振動(1600cm-1，1410cm-1)是該類抗生素共有的特征峰。56特征吸收峰歸屬峰位(cm-1)歸屬36002600O-H1780C=O1690C=O1585, 1480COO-1250CO圖 阿莫西林的紅外光譜圖(KBr壓片法) 57 1、IR法-內酰胺環(huán)酰胺58 2. 紫外吸收光譜(UV) 本類藥物的紫外光譜鑒別法通常利用最大吸收波長鑒定法：將供試品配成適當濃度的溶液，直接測定紫外吸收光譜，根據(jù)其最大吸收波長或最大吸收波長處的吸光度進行鑒定。如頭孢唑啉鈉的紫外鑒別法：取本品適量，加水溶解并稀釋制成每1ml中約含16g的溶液，在272n

30、m的波長處有最大吸收。 59（1）樣品的最大吸收波長Cu2+頭孢氨芐 max = 262nm青霉素V鈉 A280nm/A264nm = 1.301.50（2）分解產(chǎn)物的最大吸收波長60(三) 呈色反應 1. 羥肟酸鐵反應 青霉素及頭孢菌素在堿性中與羥胺作用，-內酰胺環(huán)破裂生成羥肟酸；在稀酸中與高鐵離子呈色。 612. 類似肽鍵的反應-茚三酮反應 -氨基酸62-氨基、伯胺某些羥基胺類酮式烯醇式茚三酮茚三酮縮合藍紫色633. 與重氮苯磺酸反應（偶合）酚羥基頭孢哌酮此外，本類藥物還可與變色酸-硫酸、硫酸-甲醛等試劑反應而呈色。 64(四) 各種鹽的反應 鉀、鈉離子的火焰反應 青霉素類、頭孢菌素類藥品

31、中，許多制成鉀鹽或鈉鹽供臨床使用，因而可利用鉀、鈉離子的火焰反應進行鑒別。如阿莫西林鈉、頭孢尼西鈉、頭孢西丁鈉、頭孢曲松鈉等鈉離子的鑒別；青霉素鉀、青霉素鉀等鉀離子的鑒別。 65 焰色鮮黃色 + 醋酸氧鈾鋅黃 Na+（二）各種鹽的反應K+、Na+反應1、 焰色紫色 + 0.1%四苯硼鈉 + Ac白 K+66三、檢查 本類抗生素的雜質主要有高分子聚合物，有關物質，異構體等，一般采用HPLC法控制其限量，也有采用測定雜質的吸光度來控制雜質量的。此外，有的還進行結晶性、抽針與懸浮時間等有效性試驗，部分抗生素還檢查有機溶劑殘留量。 (一) 聚合物 (二) 有關物質和異構體 (三) 吸光度 (四) 有機

32、溶劑 (五) 結晶性67四、含量測定 各國藥典收載的青霉素類和頭孢菌素類的含量測定除少數(shù)幾個樣品采用抗生素微生物檢定法測定外，大多采用HPLC測定方法。 高效液相色譜法是近年來發(fā)展最快的方法，它能有效地分離供試品中可能存在的降解產(chǎn)物、未除盡的原料及中間體等雜質，并能準確定量，適用于本類藥物的原料、各種制劑及生物樣本的分析測定。ChP2010收載的本類抗生素中除磺芐西林鈉采用微生物檢定法測定含量外，其余均采用HPLC法測定含量。 68HPLC法 外標法特點 快速、高效、靈敏 專屬性強、重現(xiàn)性好 一法多用（鑒別、檢查、含測） 可分離降解產(chǎn)物、未除盡的原料藥及中 間體ChP2010 青霉素類、頭孢菌

33、素類69色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸二氫鉀溶液(取磷酸二氫鉀6.8g，加水溶解并稀釋成1000ml，用磷酸調節(jié)pH值至3.4)-乙腈(92 8)為流動相；檢測波長為254nm。取頭孢克洛對照品及頭孢克洛-3-異構體對照品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1ml中分別含頭孢克洛及頭孢克洛-3-異構體約0.2mg的混合溶液，取20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖，頭孢克洛峰與頭孢克洛-3-異構體峰的分離度應符合要求。 測定法 取本品約20mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，取20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取頭孢克洛對照品適量，同法測

34、定。按外標法以峰面積計算出供試品中C15H14ClN3O4S的含量。規(guī)定按無水物計算，含C15H14ClN3O4S不得少于95.0%。 ChP2010頭孢克洛含量的HPLC測定法 70Assay Mobile phase Dissolve 1 g of sodium 1-pentanesulfonate（戊） in a mixture of 780 mL of water and 10 mL of triethylamine. Adjust with phosphoric acid to a pH of 2.5 0.1, add 220 mL of methanol, and mix. Sta

35、ndard preparation Transfer about 15 mg of USP Cefaclor RS, accurately weighed, to a 50-mL volumetric flask, dilute with Mobile phase to volume, and mix. Sonicate briefly, if necessary, to achieve dissolution, and avoid heating the solution. noteUse this Standard preparation within 8 hours if stored

36、at room temperature, or within 20 hours if stored under refrigeration. preparation Transfer about 15 mg of Cefaclor, accurately weighed, to a 50-mL volumetric flask, dilute with Mobile phase to volume, and mix. Sonicate briefly, if necessary, to achieve dissolution, and avoid heating the solution. n

37、oteUse this Assay preparation within 8 hours if stored at room temperature, or within 20 hours if stored under refrigeration. USP34 Cefaclor(頭孢克洛)71Resolution solution Prepare a solution in Mobile phase containing about 0.3 mg of cefaclor and 0.3 mg of USP Cefaclor, Delta-3 Isomer RS per mL. Chromat

38、ographic system The liquid chromatograph is equipped with a 265-nm detector and a 4.6-mm 25-cm column containing 5-m packing. The flow rate is about 1.5 mL per minute. Chromatograph the Resolution solution, and record the responses as directed for Procedure: the relative retention times for cefaclor

39、 and cefaclor, delta-3 isomer are about 0.8 and 1.0, the resolution, R, between the cefaclor peak and the cefaclor, delta-3 isomer peak is not less than 2.5, the tailing factor is not more than 1.5, and the relative standard deviation for replicate injections is not more than 2%. 72Procedure noteUse

40、 peak areas where peak responses are indicated. Separately inject equal volumes (about 20 L) of the Standard preparation and the Assay into the chromatograph, record the chromatograms, and measure the responses for the major peaks. Calculate the potency, in g per mg, of cefaclor (C15H14ClN3O4S) in e

41、ach mg of the Cefaclor taken by the formula: (WS / WU)(P)(rU / rS)in which WS and WU are the weights, in mg, of USP Cefaclor RS and of Cefaclor taken to prepare the Standard preparation and the Assay preparation, respectively; P is the designated potency, in g of cefaclor (C15H14ClN3O4S) per mg, of

42、USP Cefaclor RS; and rU and rS are the peak responses of the cefaclor peaks obtained from the Assay preparation and the Standard preparation, respectively.Cefaclor has a potency of not less than 950 g and not more than 1020 g of C15H14ClN3O4S per mg, calculated on the anhydrous basis.USP（2009）版與Ch.P

43、方法相比，USP方法更為嚴謹。 73第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 氨基糖苷類抗生素抗生素的化學結構都是以堿性環(huán)己多元醇為苷元，與氨基糖縮合而成的苷，故稱為氨基糖苷類抗生素(Aminoglycosides Antibiotics)。主要有硫酸鏈霉素、硫酸慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、鹽酸大觀霉素、硫酸小諾霉素、硫酸巴龍霉素、硫酸卡那霉素、硫酸西索霉素、硫酸阿米卡星、硫酸依替米星、硫酸核糖霉素、硫酸新霉素等，它們的抗菌譜和化學性質都有共同之處。 74第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素鏈霉素 雙氫鏈霉素新霉素 卡那霉素慶大霉素 巴龍霉素 75鏈霉素鏈霉胍 + 鏈霉糖 + N-甲基-L-葡萄糖胺 苷元糖(鏈霉雙糖胺

44、)鏈霉雙糖胺鏈霉胍鏈霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺絳紅糖胺紫素胺 2-脫氧鏈霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺78慶大霉素C復合物 慶大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 慶大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 慶大霉素C1a R、R1、R2=H 慶大霉素C2a R=CH3 R1= R2=H 慶大霉素C2b R=R1=H R2=CH379硫酸鏈霉素StreptomycinSulfate 硫酸巴龍霉素Paromomycin Sulfate 硫酸慶大霉素Gentamycin sulfate 硫酸奈替米星Netilmicin Sulfate 一、化學結構與性質80藥物名稱物理性質鑒別檢查

45、含量測定硫酸鏈霉素StreptomycinSulfate白色或類白色的粉末；無臭或幾乎無臭，味微苦；有引濕性。在水中易溶，在乙醇或三氯甲烷中不溶。1. 坂口反應2. 麥芽酚反應3. IR4. 硫酸鹽的鑒別反應1. 硫酸鹽 EDTA滴定法2. 有關物質：HPLC(蒸發(fā)光散射檢測器);3. 可見異物;4. 不溶性微粒;5. 異常毒性;6. 細菌內毒素;7. 無菌微生物檢定法硫酸巴龍霉素Paromomycin Sulfate白色或微黃色的粉末；無臭，引濕性極強，遇光易變色。在水中易溶，在甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷或乙醚中不溶。D(水溶液) +50o+55o。1. TLC或HPLC2. IR3. 硫酸

46、鹽的鑒別反應巴龍霉素組分：HPLC(蒸發(fā)光散射檢測器)微生物檢定法硫酸慶大霉素Gentamycin sulfate白色或類白色的粉末；無臭；有引濕性。在水中易溶，在乙醇、丙酮、三氯甲烷或乙醚中不溶。D(水溶液) +107o+121o。1. TLC或HPLC2. IR3. 硫酸鹽的鑒別反應1. 硫酸鹽 ：HPLC;2. 慶大霉素C組分 HPLC-蒸發(fā)光散射檢測器;3. 有關物質：HPLC(蒸發(fā)光散射檢測器);4. 水分;5. 細菌內毒素微生物檢定法硫酸奈替米星Netilmicin Sulfate白色或類白色的粉末或疏松塊狀物；無臭，味微苦；有引濕性。在水中易溶，在乙醇、三氯甲烷或乙醚中不溶。D(

47、水溶液) +88o+96o。1. HPLC2. 硫酸鹽的鑒別反應1. 硫酸鹽：HPLC2. 有關物質：HPLC(蒸發(fā)光散射檢測器);3. 水分;4. 可見異物;5. 不溶性微粒;6. 細菌內毒素微生物檢定法氨基糖苷類抗生素部分原料藥的物理性質、鑒別、檢查和含量測定 81一、結構與性質多與硫酸成鹽鏈霉素 3個慶大霉素 5個堿性中心堿性（1）水溶性溶解性（2）(3) 旋光性 含多個氨基糖82鏈霉素 pH57.5慶大霉素 pH212 穩(wěn)定UV （4）穩(wěn)定性（5）鏈霉素水解產(chǎn)物反應鏈霉素230nm有吸收,慶大、奈替米星無83二、鑒別試驗 (一) 茚三酮反應 (二) Molisch試驗 (三) N-甲基

48、葡萄糖胺反應(Elson-Morgan反應) (四) 麥芽酚(Maltol)反應 (五) 坂口(Sakaguchi)反應 (六) 硫酸鹽反應 (七) 色譜法(八) 光譜法84(一) 茚三酮反應 本類抗生素為氨基糖苷結構，具有羥基胺類和-氨基酸的性質，可與茚三酮縮合成藍紫色化合物。中國藥典采用本法鑒別硫酸小諾霉素及其制劑。 硫酸小諾霉素的茚三酮反應鑒別法：取本品約5mg，加水1ml溶解后，加0.1%茚三酮的水飽和正丁醇溶液1ml與吡啶0.5ml，在水浴中加熱5分鐘，即呈紫藍色。 85二、鑒別試驗 茚三酮反應 （一）羥基胺結構86（二）Molisch試驗 具五碳糖或六碳糖結構的氨基糖苷類經(jīng)酸水解后

49、，在酸作用下脫水生成糠醛（五碳糖）或甲基糠醛，這些產(chǎn)物遇-萘酚或蒽酮呈色。-萘酚呈色 紅紫色蒽酮呈色 藍紫色87 阿米卡星的蒽酮呈色鑒別：取本品約10mg，加水1ml 溶解后，加0.1%蒽酮的硫酸溶液4ml，即顯藍紫色。 88坂口反應N-甲基葡萄糖胺反應麥芽酚反應89本類藥物經(jīng)水解，產(chǎn)生葡萄糖胺衍生物，如鏈霉素中的N-甲基葡萄糖胺，硫酸新霉素、硫酸巴龍霉素中的D-葡萄糖胺，在堿性溶液中與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物(I)，與對二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液(Ehrlich試劑)反應，生成櫻桃紅色縮合物(II)。 (三) N-甲基葡萄糖胺反應(Elson-Morgan反應)90N-甲基葡萄糖胺反應（三）

50、乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對二甲氨基苯甲醛H+紅色（Elson-Morgan反應）(縮合吡咯衍生物)紅色對二甲氨基苯甲醛H+93 硫酸鏈霉素的麥芽酚反應鑒別：取本品約20mg，加水5ml溶解后，加氫氧化鈉試液0.3ml，置水浴上加熱5分鐘，加硫酸鐵銨溶液(取硫酸鐵銨0.1g，加0.5mol/L硫酸溶液5ml使溶解) 0.5ml，即呈紫紅色。 （四）麥芽酚反應94（四）麥芽酚反應 鏈霉糖特有反應H+分子重排95（五）坂口反應鏈霉胍特有反應（或-萘酚）8-羥基喹啉 -萘酚96（六）反應H+UV法（七）光譜色譜法（八）慶大霉素無UV吸收（BP） TLC法IR法TLC法HPLC971. 薄層色譜法 Ch

51、P2010、USP34-NF29和BP2010均采用TLC法對本類抗生素進行鑒別。多以硅膠為薄層板，三氯甲烷-甲醇-濃氨水為展開劑，茚三酮或碘蒸氣為顯色劑。 2. 高效液相色譜法 本類藥物也可根據(jù)組分檢查或含量測定項下HPLC方法，通過比較供試品溶液和對照品溶液的色譜圖進行鑒別。98 ChP硫酸慶大霉素注射液的TLC鑒別：取本品與硫酸慶大霉素標準品，分別加水制成每1ml中含2.5mg的溶液，作為供試品溶液和標準品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各2l，分別點于同一硅膠G薄層板(臨用前于105 活化2 小時)上；另取三氯甲烷-甲醇-氨溶液(1:1:1)混合振搖，放置1小時，分取下層混合液

52、為展開劑，展開，取出于2025晾干，置碘蒸氣中顯色，供試品溶液所顯主斑點數(shù)、位置和顏色應與標準品溶液斑點數(shù)、位置和顏色相同。 99BP(2010)對硫酸鏈霉素注射液的鑒別方法如下： Carry out the method for thin-layer chromatography, using a silica gel precoated plate (Merck silica gel 60 plates are suitable) and as the mobile phase the lower layer obtained by shaking together equal volum

53、es of 13.5M ammonia, chloroform and methanol and allowing to separate. Apply separately to the plate (1) a volume of the injection containing the equivalent of 30 g of gentamicin and (2) 0.1 mg of gentamicin sulphate British Pharmacopoeia Chemical Reference Substance dissolved in a volume of water e

54、qual to the volume of the injection used. After removal of the plate, allow it to dry in air, spray with ninhydrin solution R1 (Dissolve 1.0 g of ninhydrin in 50 ml of ethanol (96%) and add 10 ml of glacial acetic acid.) and heat at 105 for 2 minutes. The three principal spots in the chromatogram ob

55、tained with solution (1) correspond to the three principal spots in the chromatogram obtained with solution (2).100(八) 光譜法 1. 紅外吸收光譜 中國藥典和英國藥典均采用紅外光譜法鑒別本類藥物，如硫酸慶大霉素、硫酸巴龍霉素、硫酸卡那霉素、硫酸阿米卡星、硫酸新霉素、硫酸鏈霉素等。 2. 紫外吸收光譜 本類藥物多無紫外吸收，故其鑒別試驗中很少采用紫外法。但BP2010利用這一性質，采用紫外法對慶大霉素進行鑒別， 101 硫酸慶大霉素的UV鑒別：取硫酸慶大霉素10mg，加水1ml和

56、40%硫酸溶液5ml；在水浴中加熱100分鐘，冷卻，用水稀釋至25ml。取該溶液進行紫外掃描，在240nm330nm范圍內應無最大吸收。 102三、有關物質及組分分析(一) 有關物質檢查 (二) 組分測定 (三) 硫酸鹽檢查 103(一) 有關物質檢查 現(xiàn)版各國藥典對本類抗生素的有關物質檢查主要采用TLC和HPLC法。104(二) 組分測定 本類抗生素多為同系物組成的混合物，同系物的效價、毒性各不相同，為保證藥品的質量，必須控制各組分的相對含量，如ChP對硫酸慶大霉素、硫酸小諾霉素等規(guī)定了組分分析。105對微生物的活性無明顯差異毒副作用和耐藥性不同發(fā)酵菌種不同工藝差別C組分比例不一致規(guī)定控制各

57、組分的相對百分含量ChPUSPBPJP慶大霉素C組分的測定106 慶大霉素C1、C2、C1a對微生物的活性無明顯差異，但其毒副作用和耐藥性有差異，導致各組分的多少影響產(chǎn)品的效價和臨床療效。因此中、英、美、日等國藥典均規(guī)定控制各組分的相對百分含量。ChP2010、USP34-NF29和BP2010均采用高效液相色譜法測定慶大霉素C各組分的含量。 慶大霉素無紫外吸收，當采用紫外檢測器檢測時，需進行衍生化處理。由于其具有強極性和水溶性，為獲得理想的色譜結果，可采用蒸發(fā)光散射檢測器或利用慶大霉素C組分結構中的氨基與鄰苯二醛(o-phthaldehyde，OPA)、巰基醋酸在pH10.4的硼酸鹽緩沖液中

58、反應，生成1-烷基-2-烷基硫代異吲哚衍生物，在330nm波長處有強吸收。107108max = 330nm衍生化原理 1、蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD) 2005年版藥典 ChP2000年版 109RPHPLC方法 2.規(guī)定 C1 2550% C1a 1540% C2a +C2 2050%計算 3.峰面積歸一化法110 ChP慶大霉素中慶大霉素C組分的HPLC檢測：ChP采用蒸發(fā)光散射檢測器檢測慶大霉素中慶大霉素C組分： USP慶大霉素中慶大霉素C組分的衍生化紫外檢測HPLC測定法： BP慶大霉素中慶大霉素C組分的HPLC柱后衍生化法電化學檢測測定法： 111(三) 硫酸鹽檢查 本類抗生素臨床

59、應用的主要為硫酸鹽，各國藥典規(guī)定EDTA絡合滴定法或HPLC法測定硫酸鹽含量，作為組分分析。112 硫酸卡那霉素中硫酸鹽測定方法(EDTA絡合滴定法)：取本品約0.18g，精密稱定，加水100ml使溶解，加濃氨溶液調節(jié)pH值至11后，精密加氯化鋇滴定液(0.1mol/L)10ml、酞紫指示液5滴，用乙二胺四醋酸二鈉滴定液(0.05mol/L)滴定，注意保持滴定過程中的pH值為11，滴定至紫色開始消褪，加乙醇50ml，繼續(xù)滴定至藍紫色消失，并將滴定結果用空白試驗進行校正。每1ml氯化鋇滴定液(0.1mol/L)相當于9.606mg，本品含硫酸鹽的量按無水物計算應為23.0%26.0%。 113

60、硫酸依替米星中硫酸鹽測定方法(HPLC法)：精密量取硫酸滴定液適量，用水定量稀釋制成每1ml中約硫酸鹽(SO4)0.075mg、0.15mg和0.30mg的溶液作為對照溶液(1)、(2)、(3)。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(pH 值范圍0.88.0)；以0.2mol/L三氟醋酸-甲醇(8416)為流動相；流速為每分鐘0.5ml；用蒸發(fā)光散射檢測器檢測(參考條件：漂移管溫度100C，載氣流速為每分鐘2.6L)，取依替米星和奈替米星對照品各適量，加水溶解并稀釋制成每1ml中各0.2mg的混合溶液，取20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖，依替米星峰和奈替米星峰的分離度應大于1.2，連續(xù)5次進樣，依替