分離技術(shù)實驗(共6頁)

1、實驗(shyn)一: 雙水相萃取(cuq)牛血清(xuqng)蛋白一.實驗目的1.了解雙水相系統(tǒng)的成相原理和方法；2.了解制作雙水相系統(tǒng)相圖的方法，加深對相圖的認識；3.掌握雙水相溶液配制與雙水相萃取的操作；4.掌握分配系數(shù)和萃取收率的計算方法。二. 實驗原理雙水相系統(tǒng)是由兩種互不相溶的聚合物（如聚乙二醇（PEG）與葡聚糖（DX）或者互不相溶的聚合物溶液和鹽溶液（如PEG與（NH4）2SO4）組成。雙水相系統(tǒng)的制備一般是將兩種溶質(zhì)分別配制成一定濃度的水溶液，然后將兩種溶液按照不同的比例混合，靜止一段時間，當兩種溶質(zhì)的濃度超過某一濃度范圍時，就會產(chǎn)生兩相。相圖是研究雙水相萃取的基礎(chǔ)，雙水相形成條

2、件和定量關(guān)系常用相圖來表示。圖1是典型的高聚物-高聚物雙水相體系的直角坐標相圖，兩種聚合物A、B以適當比例溶于水就會分別形成有不同組成的兩相，上相組成用T點表示，下相組成用B點表示，由圖1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。曲線TCB稱為結(jié)線，直線TMB稱為系線。結(jié)線上方是兩相區(qū)，下方為單相區(qū)，若配比取在曲線上，則混合后，溶液恰好從澄清變?yōu)榛鞚?。組成在系線上的點，分為兩相后，其上下相組成分別為T和B，T、B量的多少服從相圖的杠桿定律。即T和B相質(zhì)量之比等于系線上MB與MT的線段長度之比。又由于兩相密度相差很小，故上下相體積之比也近似等于系線上MB與MT線段長度之比。圖1

3、A-B雙水相體系(tx)相圖雙水相萃取(cuq)與有機溶劑萃取原理相似,都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配原則。當物質(zhì)進入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力（如憎水性、氫鍵、離子鍵等）的存在，使得待分離的物質(zhì)在上、下相中的濃度不同。對于某一物質(zhì)，只要選擇合適的雙水相體系，控制一定(ydng)的條件就可以得到合適的分配系數(shù)，從而達到分離純化的目的。本實驗選擇PEG-硫酸銨雙水相系統(tǒng)萃取牛血清蛋白。雙縮脲反應是指蛋白質(zhì)在堿性溶液中與二價銅離子結(jié)合生成紫色絡合物的反應。含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物都具有雙縮脲反應，蛋白質(zhì)含有多個肽鍵，因此有雙縮脲反應，反應生成物顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量成正比

4、，因此可以利用雙縮脲反應進行蛋白質(zhì)的定量測定。三、試劑及儀器儀器：紫外可見分光光度計，電子天平，臺式高速離心機，電熱恒溫水浴箱，漩渦混合儀，滴定管，大試管，離心試管(20mL)6只，移液管(1mL,5mL)，試管（10mL），注射器（10mL）試劑：PEG2000，硫酸銨，牛血清蛋白，雙縮脲試劑四、實驗內(nèi)容1.蛋白質(zhì)溶液標準曲線的測定取七支試管分別加入0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5,0.6mL的標準蛋白質(zhì)溶液（用標準的結(jié)晶牛血清蛋白（BSA）配制成10mg/mL 的標準蛋白溶液），并用水補足到1mL,然后加入4mL雙縮脲試劑（A NaOH 3.5mL,，B CuSO4 0.5mL）

5、，充分搖勻后在室溫下放置30min，在540nm波長下測定吸光度。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照樣。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。BSA濃度（mg/mL）0.10.20.30.40.50.6吸光度A0.0590.1150.1660.2190.2600.3012.PEG2000-硫酸銨雙水相體系(tx)相圖的測定（1）取50%的PEG2000溶液(rngy)（w/v,g/mL）10.07g，約10mL于大試管(shgun)中；（2）用40%的硫酸銨溶液（w/v,g/mL）裝入滴定管中向大試管滴加，并不斷在漩渦混合器上混合，觀察溶液的澄清程度，直至試管內(nèi)液體出現(xiàn)渾濁為

6、止，記錄硫酸銨消耗的體積。加入1mL水使溶液澄清，繼續(xù)用硫酸銨滴定至恰好混濁，重復7次，記錄每次硫酸銨消耗的體積，計算每次出現(xiàn)混濁時體系中PEG和硫酸銨的濃度（w/v,g/mL）,并填入表1中。表1 PEG2000-硫酸銨雙水相體系相圖的制作表編號累計加水量(mL) 硫酸銨溶液讀數(shù)大試管中純硫酸銨的累計量(g)溶液的總體積（mL）PEG2000的濃度(w/v)硫酸銨的濃度（w/v）100.820.32810.820.46210.0303210.380.48012.200.40980.0393320.440.65613.640.36660.0481430.380.80815.020.33290.

7、0538540.481.00016.500.30300.0606650.581.23218.080.27650.0681760.581.46419.660.25430.0745870.641.72021.300.23470.0808以硫酸銨的濃度(nngd)（w/v,g/mL）為橫坐標，PEG的濃度(nngd)（w/v,g/mL）為縱坐標作圖，即得到(d do)PEG2000-硫酸銨的相圖。3.利用PEG2000-硫酸銨雙水相體系分離牛血清蛋白根據(jù)相圖，選擇三個成相比例，如上圖所示，選取了PEG的濃度為0.35g/mL，硫酸銨的濃度分別為6%，7%，8%，取定萃取總體積為18mL，由0.5V/

8、18=0.35可算出需要加入V=12.6mL的PEG溶液，實驗稱取12.6gPEG溶液，約等于12.6mL。由于還要加入3ml牛血清蛋白溶液，根據(jù)m/18=0.06、0.07、0.08可算出分別需要1.06g、1。07g、1.08g固體硫酸銨。18-12.6=2.4mL，即為需加入水的體積。如下圖所示。PEG2000濃度（w/v）%35離心管內(nèi)需加PEG體積/mL12.6管內(nèi)需加去離子水體積/mL2.4管內(nèi)需加蛋白溶液體積/mL3硫酸銨濃度（w/v）%678離心管內(nèi)需加硫酸銨質(zhì)量/g1.081.261.44實際加入硫酸銨質(zhì)量/g1.061.251.45實際硫酸銨濃度（w/v）%5.896.94

9、8.06 將雙水相體系(tx)配好后，分別(fnbi)加入3mL濃度(nngd)為10mg/mL牛血清蛋白溶液。攪拌均勻，3500r/min離心5min，靜置分層，分別量取記錄上下相的體積，并測量上下相的吸光度。由BSA標準曲線圖可得萃取后上下兩相中BSA的濃度。硫酸銨濃度（w/v）%678上相體積/mL17.016.315.2上相吸光度0.0350.0320.031上相濃度mg/mL0.3730.3110.2905下相體積（測得）/mL1.01.72.8下相吸光度0.3570.3320.333下相濃度mg/mL7.016.4956.5154、根據(jù)實驗所得數(shù)據(jù)，計算系統(tǒng)的相比，蛋白在不同雙水相

10、系統(tǒng)中的分配系數(shù)及收率。計算公式如下：表觀分配系數(shù) K=Ct/Cb相比 R=Vt/Vb回收率 P=下相蛋白含量/上下相蛋白總含量=Vt*Ct/(Vt*Ct+Vb*Cb)=R*K/(1+R*K)式中 Ct、Cb分別為上下相蛋白濃度；Vt、Vb分別為上下相體積。比較上下相蛋白總含量與加入的蛋白總量是否一致。a、PEG2000 35%，硫酸銨 6%K= 0.0746/1.402 = 0.0532R= 17.0/1.0 = 17 P（下相）= R*K/(1+R*K) = 17*0.0532/(1+17*0.0532) = 0.475b、PEG2000 35%，硫酸銨 7%K= 0.0622/1.299

11、 = 0.0479R= 16.3/1.7 = 9.6 P（下相）= R*K/(1+R*K) = 9.6*0.0479/(1+9.6*0.0479) = 0.315c、PEG2000 35%，硫酸銨 8%K= 0.0581/1.303 = 0.0445R= 15.2/2.8 = 5.4 P（下相）= R*K/(1+R*K) = 5.4*0.0445/(1+5.4*0.0445) = 0.1945、討論(toln)1、 如何(rh)正確繪制相圖？如何根據(jù)相圖配制雙水相體系，并對混合物進行分離？如何(rh)繪制相圖：精確稱取一定質(zhì)量PEG溶液于大試管中，用滴定管緩慢滴加已配好的40%的鹽溶液，并不斷

12、在漩渦混合器上混合，觀察溶液的澄清程度，直至試管內(nèi)液體出現(xiàn)渾濁為止。記錄鹽溶液的加量(g)。然后，加入1毫升水，溶液澄清，繼續(xù)向試管中滴加鹽溶液并不斷混勻，直至再次達到渾濁，如此反復操作。計算每次達到渾濁時，PEG和鹽在系統(tǒng)總量中的質(zhì)量分數(shù)，記錄實驗數(shù)據(jù)，以PEG的質(zhì)量分數(shù)為縱坐標，某種鹽的質(zhì)量分數(shù)為橫坐標作圖，即得到一條雙節(jié)線的相圖。如何分離：根據(jù)相圖，選擇三個成相比例，分別加入3mL濃度為10mg/mL牛血清蛋白溶液。攪拌均勻，3500r/min離心5min，靜置分層，分別量取記錄上下相的體積。2、實驗操作中應注意哪些問題？分析實驗誤差。注意事項：滴定管使用前必須要檢漏。在滴定時應該要注意氣泡和渾濁的區(qū)別，防止誤判。邊滴加邊震蕩，滴加速度要慢。在離心時一定要將對面的離心管配平，防止儀器損壞。硫酸銨固體應在牛血清蛋白溶液之前就加，否則可能引起局部鹽濃度過大而導致的鹽析現(xiàn)象。誤差分析：在分離上相和下相時，由于界面上存在一定的泡沫，在吸量時會存在一定的誤差，導致讀數(shù)不準確。滴定誤