浙江大學生物化學甲實驗實驗6酶的基本性質實驗——底物專一性激活劑和抑制劑最適溫度

1、 實驗七 用正交法測定幾種因素 對蔗糖酶活性的影響（半自主性設計實驗）浙江大學生物化學甲實驗實驗6酶的基本性質實驗底物專一性激活劑和抑制劑最適溫度一、實驗目的和要求 1. 初步掌握正交試驗設計法的使用。 2. 運用正交法測定底物濃度、酶濃度、溫度和pH值這四種因素對酶活力的影響。二、實驗基本原理 酶的催化作用是在一定條件下進行的，它受多種因素的影響，如酶濃度、底物濃度、溫度、 pH值、抑制劑和激活劑等都能影響酶催化的反應速度。通常在其他因素恒定的條件下，通過某一因素在一系列變化條件下的酶活性測定求得該因素的影響，這是單因素的試驗方法。對于多因素的試驗可以通過正交試驗設計法來完成。正交法是借助于

2、正交表，簡化的表格計算，正確分析結果，找到實驗的最佳條件，分清因素的主次，這樣就可以通過比較少的實驗次數達到好的實驗效果。實踐證明正交法是一個多、快、好、省的方法。目前已廣泛用于工農業(yè)生產和科學實驗中。 本實驗運用正交法測定底物濃度、酶濃度、溫度、pH值這四個因素對酶活性的影響，并求得在什么樣的底物濃度、酶濃度、溫度和pH值時酶的活性最大。浙江大學生物化學甲實驗實驗6酶的基本性質實驗底物專一性激活劑和抑制劑最適溫度三、實驗材料與試劑1、實驗材料 純化的蔗糖酶（樣品）2、實驗試劑 5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）； 0.2mol/L乙酸緩沖液，pH3.6、4.6、5.6； 3,5二硝基水楊酸試

3、劑； 甲液：溶解6.9g結晶酚于15.2ml 10NaOH溶液中，并用水稀釋至69ml,在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉。 乙液：稱取255克酒石酸鉀鈉加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入800ml 1%3,5-二硝基水楊酸溶液. 甲,乙二溶液相混合即得黃色試劑,貯于棕色瓶中備用,在室溫放置7-10天以后使用。 四、實驗器材與儀器 1. 試管及試管架； 2. 吸量管； 3. 恒溫水浴箱 （37、50、65、100 ）； 4可見光分光光度計。浙江大學生物化學甲實驗實驗6酶的基本性質實驗底物專一性激活劑和抑制劑最適溫度五、實驗操作方法和步驟1、實驗設計、確定試驗因素和水平本實驗取四個因素，即

4、底物濃度S、酶濃度E、溫度、pH值。每個因素選三個水平，實驗因素和選用水平如表1。 表1 因素、水平表 因素 水平S（ml）E（ml）溫度（）pH10.51.0503.620.20.6375.630.80.2654.6 作因素、水平表時，各因素的水平，最好不要按大小順序排列。按一般方法，如對四個因素三個水平的各種搭配都要考慮，共需做34=81次試驗，而用正交表只需做9次試驗。浙江大學生物化學甲實驗實驗6酶的基本性質實驗底物專一性激活劑和抑制劑最適溫度、選擇合適的正交表 合適的正交表，是指要考察的因素的自由度總和，應該不大于所選正交表的總自由度。 正交表 Ln（ tq）L 正交表的代號n 處理數

5、（試驗次數）t 水平數q 因素數試驗次數 n = q( t1 )+1= 4（31）+19總自由度 V總= n-1各列自由度 V列 = K（該列水平數）1 例如本實驗選用四個因素，每個因素選三個水平，四個因素各占一列，那么四個因素的自由度分別為：V1 = 31 = 2， V2 = 31 = 2， V3 = 31 = 2， V4 = 31 = 2。四個因素的自由度總和 = V1 + V2 + V3 + V4 = 8因為各因素自由度總和是8，它沒有超過L9（34）的總自由度= 91 = 8。所以選擇正交表L9（34）是適合的。浙江大學生物化學甲實驗實驗6酶的基本性質實驗底物專一性激活劑和抑制劑最適溫

6、度3. 在所選的正交表上進行表頭設計 由于本實驗是一項四因素各三水平的試驗，這樣將四個因素依次放在L9（34）的第1，2，3，4列上，這項把因素放入正交表頭的工作，叫做表頭設計。見表2。正交表都應具有以下兩個特性：（1）在每一列中，各水平出現(xiàn)的次數相等。即在任何一列中，數字1和數字2和數字3都出現(xiàn)三次（幾個水平就均出現(xiàn)幾次）。（2）任何兩列中，橫行組成的數對出現(xiàn)次數相等，均出現(xiàn)一次（這里有9個不同的數對，均出現(xiàn)一次）（1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、（2，3）、（3，1）、（3，2）、（3，3），各出現(xiàn)一次。 以上這些特點保證了用正交表安排的試驗計劃是均衡搭配的，因此

7、分析數據比較方便，可進行綜合比較，結果比較可靠。在所選的正交表上進行表頭設計，見表2。 浙江大學生物化學甲實驗實驗6酶的基本性質實驗底物專一性激活劑和抑制劑最適溫度 水平 因素實驗號1S2E3溫度4pH111112122231333421235223162312731328321393321L9表 表2 表頭設計浙江大學生物化學甲實驗實驗6酶的基本性質實驗底物專一性激活劑和抑制劑最適溫度2、試驗安排 將本實驗的四個因素依次填入L9表的因素1，2，3，4中；再將各列的水平數用該列因素相應的水平寫出來，便可得到下面的試驗安排表（表3）。 表中試驗號共9個，表示要做9次試驗，每次試驗的條件如每一縱行

8、所示。如做第一個試驗時S是0.5 ml，E是1.0mL，溫度50，pH為3.6。第二個試驗S是0.5ml，E是0.6mL，溫度37，pH為5.6，余類推。浙江大學生物化學甲實驗實驗6酶的基本性質實驗底物專一性激活劑和抑制劑最適溫度 實驗號試劑（ml）2491683575%蔗糖溶液S0.50.20.80.50.20.80.50.20.80.2mol/L乙酸緩沖溶液pHpH5.61.0pH4.61.0pH3.61.0pH3.61.0pH5.61.0pH4.61.0pH4.61.0pH3.61.0pH5.61.0蒸餾水0.90.81.00.51.60.61.31.20.237預溫5min50預溫5m

9、in65預溫5min蔗糖酶（樣品）E(作相應的預溫）0.61.00.21.00.20.60.20.61.0溫度37反應10min50反應10min65反應10minDNS1111111111005min蒸餾水555555555A520表3 試驗安排表 另取試管一支作非酶對照，即加5%蔗糖溶液0.5ml，緩沖液1.9ml。先加DNS 1ml搖勻室溫放置5分鐘后再加入蔗糖酶（樣品） 0.6ml搖勻室溫放置10分鐘，1005min，再加入蒸餾水5ml，混勻后在520nm處測光密度值。浙江大學生物化學甲實驗實驗6酶的基本性質實驗底物專一性激活劑和抑制劑最適溫度六、試驗結果及分析 實驗做好后，把9個數據

10、填入表4試驗結果欄內，按表中數據計算出各因素的一水平試驗結果總和、二水平試驗結果總和、三水平試驗結果總和，再取平均值（各自被3除）。最后計算極差。極差是指這一列中最好與最壞的之差，從極差的大小就可以看出那個因素對酶活力影響最大，那個影響最小。找出任何條件下酶活力最高。最后作一直觀分析的結論。 以OD值 為縱座標，因素的水平數為橫座標作圖。實驗的典型結果與異常分析 試驗確定的最佳條件與理論很吻合。如出現(xiàn)與理論明顯不一致的現(xiàn)象可能是試驗過程中如加樣及時間控制等出現(xiàn)較大誤差所致。浙江大學生物化學甲實驗實驗6酶的基本性質實驗底物專一性激活劑和抑制劑最適溫度 水平 因素實驗號1S(ml)2E(ml)3溫

11、度()4pH值試驗結果A52011 0.51 1.01 501 3.621 0.52 0.62 372 5.631 0.53 0.23 653 4.642 0.21 1.02 373 4.652 0.22 0.63 651 3.662 0.23 0.21 502 5.673 0.81 1.03 652 5.683 0.82 0.61 503 4.693 0.83 0.22 371 3.6(一水平試驗結果總和)(二水平試驗結果總和)(三水平試驗結果總和)/3/3/3級差表4 試驗結果分析計算表浙江大學生物化學甲實驗實驗6酶的基本性質實驗底物專一性激活劑和抑制劑最適溫度七、注意事項 1、各試劑加樣一定要準確。2、保溫時間各管要一致。3、加DNS后應立即搖勻。八、參考資料 童一中，生物統(tǒng)計法，湖南科學技術出版社，1987丁鳴浙江大學生物化學甲實驗實驗6酶的基本性質實驗底物專一性激活劑和抑制劑最適溫度下 次 實 驗 課自主實驗