結(jié)構(gòu)生物學(xué)第3章核磁共振波譜學(xué)

1、結(jié)構(gòu)生物學(xué)第3章核磁共振波譜學(xué)X射線晶體學(xué)和NMR波譜學(xué)測(cè)定的最大結(jié)構(gòu)的比較NMR相對(duì)于晶體學(xué)的優(yōu)點(diǎn)：NMR使用溶液樣品，因此，它不局限于那些能很好結(jié)晶的樣品。NMR可以測(cè)定不同溶液條件下的分子結(jié)構(gòu)。NMR也使得研究分子的性質(zhì)相當(dāng)容易，例如，研究分子的柔性、分子與其它分子的反應(yīng)或相互作用、分子的動(dòng)態(tài)特征等。NMR技術(shù)的原理簡(jiǎn)述 NMR技術(shù)依賴(lài)于一個(gè)外加磁場(chǎng)和某些原子核中的天然“小磁鐵”之間的相互作用。用NMR技術(shù)解析一個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)就象一件出色的偵探工作。 NMR使用的磁場(chǎng)大多數(shù)強(qiáng)度范圍在500mHz(11.7tesla)-800mHz(18.8tesla)之間。NMR磁體是超導(dǎo)磁體Vrian

2、公司的NMR波譜儀（見(jiàn)圖）強(qiáng)度為900mHz的Vrian公司的NMR波譜儀 NMR波譜儀連續(xù)波譜儀：60-70年代產(chǎn)品結(jié)構(gòu)示意圖（見(jiàn)圖）射頻振蕩器磁場(chǎng)系統(tǒng)探測(cè)系統(tǒng)記錄裝置靈敏度低，已基本淘汰。脈沖傅里葉核磁譜儀：目前流行結(jié)構(gòu)示意圖3.2 NMR的基本原理3.2.1 原子核的自旋與核磁共振原子核的自旋量子數(shù)II與原子核的質(zhì)量數(shù)和原子序數(shù)有關(guān)核自旋量子數(shù)I與質(zhì)量數(shù)和原子序數(shù)的關(guān)系I=0的原子核，如12C, 16O, 32S等，沒(méi)有自旋，不產(chǎn)生核磁共振現(xiàn)象。I0的原子核，具有自旋，可產(chǎn)生核磁共振現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)生物學(xué)中，經(jīng)常研究的原子核有：1H, 13C, 15N, 31P, 它們的自旋量子數(shù)I=1/2。

3、其中，1H核在生物分子中廣泛存在，13C, 15N是稀有同位素。原子核的自旋與進(jìn)動(dòng)原子核都具有電荷和質(zhì)量，自旋量子數(shù)I0的原子核由于能夠自旋因而還具有自旋動(dòng)量或角動(dòng)量。旋轉(zhuǎn)的電荷有磁場(chǎng)，有自旋的核就有與角動(dòng)量有關(guān)的磁矩。在一個(gè)強(qiáng)大而均勻的外加磁場(chǎng)H0中，自旋核的磁矩將沿外磁場(chǎng)的方向進(jìn)行取向。自旋核將產(chǎn)生進(jìn)動(dòng)。（見(jiàn)圖）核磁共振的產(chǎn)生原子核自旋軸在外加磁場(chǎng)H0中的取向是量子化的，每一個(gè)取向相當(dāng)于一個(gè)自旋能級(jí)。 H0的增加不能產(chǎn)生自旋能級(jí)的躍遷。在與H0相垂直的方向上再施加一個(gè)比H0弱很多的附加磁場(chǎng)H1（稱(chēng)為射頻場(chǎng)），當(dāng)H1的頻率與原子核的進(jìn)動(dòng)頻率相同時(shí)，原子核從附加磁場(chǎng)（射頻場(chǎng)）吸收能量，產(chǎn)生自旋

4、能級(jí)的躍遷。這就是核磁共振（見(jiàn)圖）。核磁共振條件的理論推導(dǎo)在外加靜磁場(chǎng)H0的作用下，核自旋量子數(shù)不為零的原子核會(huì)發(fā)生能級(jí)分裂。 以1H為例，其I=1/2，在靜磁場(chǎng)H0中，它的進(jìn)動(dòng)可以有2I+1=2個(gè)方向，即有2個(gè)能級(jí)，分別為順磁場(chǎng)和逆磁場(chǎng)兩種取向。如圖所示。 b DE H0=0 a H00 能級(jí)裂分圖順磁場(chǎng)的1H核居較低能態(tài)，逆磁場(chǎng)的1H核居較高能態(tài)，二者能級(jí)差： DE = g h H0其中，g 為旋磁比，是各種核的特征常數(shù)，不同原子核的旋磁比不同。h = h/2p，h 為普朗克常數(shù)。H0為外加靜磁場(chǎng)的強(qiáng)度。 自旋核繞外磁場(chǎng)方向進(jìn)動(dòng)的頻率為： n0 = gH0/2p以上兩個(gè)方程合起來(lái)得： hn

5、0=g (h/2p) H0=DE當(dāng)外加一個(gè)與靜磁場(chǎng)H0垂直的射頻電磁場(chǎng) H1，使其頻率滿(mǎn)足： hn=DE=hn0時(shí)，低能態(tài)核吸收射頻場(chǎng)能量而躍遷到高能態(tài)，于是 n=n0=gH0/2p從以上公式可以看出：發(fā)生核磁共振的條件是：照射到自旋核上的電磁波的頻率（n）應(yīng)等于自旋核的進(jìn)動(dòng)頻率（n0），它不僅與核的特性（g）有關(guān)，也與外磁場(chǎng)的強(qiáng)度（H0）有關(guān)。3.2.2 弛豫弛豫是高能態(tài)的自旋核釋放能量返回低能態(tài)的過(guò)程。通過(guò)弛豫過(guò)程可以獲得穩(wěn)定的核磁共振信號(hào)。弛豫過(guò)程有兩種：自旋晶格弛豫，也稱(chēng)縱向弛豫。以弛豫時(shí)間T1表示。自旋-自旋弛豫，也稱(chēng)橫向弛豫。用弛豫時(shí)間T2描述。3.2.3 吸收的測(cè)量所有NMR波譜

6、儀都采用測(cè)定與吸收有關(guān)的正信號(hào)?？赏ㄟ^(guò)改變輻射電磁波的頻率（掃頻）或改變外加磁場(chǎng)的強(qiáng)度（掃場(chǎng)）的辦法來(lái)達(dá)到共振的目的。掃頻在技術(shù)上有困難。NMR譜儀都是保持射頻振蕩器的頻率恒定，而連續(xù)改變H0的辦法達(dá)到共振的目的。見(jiàn)圖。3.2.4 化學(xué)位移由電子云的屏蔽作用所引起的共振時(shí)磁場(chǎng)強(qiáng)度的移動(dòng)，稱(chēng)為化學(xué)位移。見(jiàn)圖化學(xué)位移與原子的核外電子云密度有關(guān)，后者又與原子核的化學(xué)環(huán)境有關(guān)。因此，可根據(jù)化學(xué)位移的大小，來(lái)考察原子核所處的化學(xué)環(huán)境，從而對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。為了確定化學(xué)位移的大小，選一個(gè)參比核，規(guī)定其化學(xué)位移為零。對(duì)于1H譜常以四甲基硅烷（TMS）為參比。參比核的屏蔽作用很強(qiáng)，在最高場(chǎng)有一個(gè)強(qiáng)的尖峰，

7、定義其化學(xué)位移為0，在其低場(chǎng)區(qū)（左方）的化學(xué)位移為正值?；瘜W(xué)位移的大小用下式計(jì)算： d = (H參-H樣)/H參 x 106 = (n樣-n參)/n參 x 106 d的單位為ppm, 即10-6，大多數(shù)質(zhì)子的d 在1-12之間。影響化學(xué)位移的三種效應(yīng)：1) 磁各向異性效應(yīng)：苯環(huán)p電子云的影響，使處于環(huán)上方和四周的氫核的化學(xué)位移有極大的差別，見(jiàn)圖。2）順磁效應(yīng)：順磁離子如Mn2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+的存在對(duì)周?chē)说幕瘜W(xué)位移影響很大。3）化學(xué)交換：與O, N, S 等原子相連的氫原子，在溶液中常常發(fā)生質(zhì)子交換。在pH值變化時(shí)，這類(lèi)可交換氫的化學(xué)位移的變化非常大（見(jiàn)圖）。氫鍵的形成，

8、使這種交換變慢，化學(xué)位移向低場(chǎng)變化。3.2.5 譜線強(qiáng)度在常規(guī)一維譜中，譜線強(qiáng)度與參與共振的粒子數(shù)成正比。（見(jiàn)圖）3.2.6 自旋耦合與自旋裂分自旋核的核磁矩通過(guò)成鍵電子影響鄰近核，引起其共振譜線增多，這種現(xiàn)象稱(chēng)為自旋裂分，自旋核之間的相互作用稱(chēng)為自旋耦合。見(jiàn)圖。裂分的共振譜線的能量差，稱(chēng)為自旋耦合常數(shù)，以J表示。J與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。自旋耦合與自旋裂分可提供相互作用的核的數(shù)目、類(lèi)型及相對(duì)位置等結(jié)構(gòu)方面的信息。3.3 多維NMR一維NMR譜是一個(gè)頻率變量的函數(shù)：S(w) ，見(jiàn)圖二維NMR譜是兩個(gè)頻率變量的函數(shù)：S(w1,w2), 見(jiàn)圖二維NMR譜的原理二維NMR譜中的對(duì)角線峰和交叉峰不同類(lèi)型的二維

9、NMR波譜：二維分解譜、二維相關(guān)譜（COSY)、二維自旋回波相關(guān)譜（SECSY）、二維NOE譜（NOESY）。NOESY譜核歐沃豪斯效應(yīng)波譜反應(yīng)的結(jié)構(gòu)信息三維NMR是三個(gè)頻率變量的函數(shù)：S(w1,w2,w3), 四維NMR是四個(gè)頻率變量的函數(shù)：S(w1,w2,w3,w4)。見(jiàn)圖。多維NMR譜的特點(diǎn)：多維譜可以把一維譜中的重疊峰在二維或三維方向展開(kāi)，便于NMR譜的解析。多維譜包含了比一維譜豐富得多的信息。實(shí)驗(yàn)方法靈活多樣，可以設(shè)計(jì)出多種實(shí)驗(yàn)脈沖程序，從而產(chǎn)生各種有用的多維NMR技術(shù)。可以利用多維譜，間接地檢測(cè)到在普通NMR譜中得不到的躍遷，如多量子躍遷。3.4 多維NMR確定蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的

10、基本原理3.4.1 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息不同二級(jí)結(jié)構(gòu)提供了具有不同結(jié)構(gòu)特征的原子間距離及肽鍵二面角。a螺旋中，相鄰兩個(gè)殘基的酰胺質(zhì)子(1HN)在空間距離上很接近；而前一位殘基的a質(zhì)子（1Ha）與后一位殘基的酰胺質(zhì)子在空間上相距甚遠(yuǎn)；但是在b折疊中情況正相反。a螺旋肽鏈上的每一亞氨基與前面第四位殘基的羰基形成氫鍵，而反平行b折疊的兩條單鏈上相對(duì)的亞氨基與羰基之間形成氫鍵。b折疊的肽鍵二面角f遠(yuǎn)大于a螺旋中的f。三級(jí)結(jié)構(gòu)中，幾個(gè)b折疊相對(duì)集中的區(qū)域會(huì)形成一個(gè)比較剛性的疏水區(qū)，而空間位置比較靠近的幾個(gè)環(huán)可能成為比較柔性的活性部位。這些具有不同結(jié)構(gòu)特征的原子核間距、肽健二面角、肽鏈的動(dòng)態(tài)特性等都是多維NM

11、R所要提取的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。3.4.2 核磁共振的波譜信息直接用于測(cè)定蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的主要波譜參數(shù)為：（1）化學(xué)位移：反映了空間結(jié)構(gòu)及局域微環(huán)境的結(jié)構(gòu)情況。（2）J耦合常數(shù)：酰胺質(zhì)子與a質(zhì)子之間的耦合常數(shù)3JNa與主鏈的二面角f有關(guān)，a質(zhì)子與b質(zhì)子之間的耦合常數(shù)3Jab與側(cè)鏈二面角c有關(guān)。（3）NOE（核歐沃豪斯效應(yīng)）：NOE信號(hào)強(qiáng)度提供了蛋白質(zhì)中氫原子對(duì)之間的距離信息。3.4.3 波譜信息與結(jié)構(gòu)信息之間的對(duì)應(yīng)化學(xué)位移參數(shù)可用于判斷蛋白質(zhì)氨基酸序列中，a螺旋和b折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)單元的位置。 化學(xué)位移索引法（CSI）J耦合常數(shù)可由Karplus方程直接推算出相應(yīng)的主鏈和側(cè)鏈的二面角f和c:

12、NOE信號(hào)可以導(dǎo)出質(zhì)子間距離，這是計(jì)算蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的最主要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 3.5 蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的計(jì)算由核磁共振數(shù)據(jù)計(jì)算蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的流程圖3.5.1 建立核磁共振波譜數(shù)據(jù)的約束文件距離約束文件：由NOE導(dǎo)出的NOE距離約束 下限取1.8， 上限：強(qiáng)NOE，2.5-2.7, 中等NOE, 3.0-3.5，弱NOE, 5.0， 很弱NOE, 6.0由氫鍵提供的距離約束 1HN與羰基氧的距離：2.3-1.8 亞氨基15N與羰基氧的距離：3.4-2.4二面角約束文件主鏈f角和側(cè)鏈c角的約束3.5.2 獲得蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的不同構(gòu)象集合計(jì)算NMR三維結(jié)構(gòu)的軟件：DGII, Xplor, DI

13、ANA等。具體計(jì)算蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)時(shí)，必須要獲得一個(gè)蛋白質(zhì)構(gòu)象的集合，包括40-50個(gè)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。為什么要獲得構(gòu)象集合？3.5.3 蛋白質(zhì)NMR結(jié)構(gòu)的精確性和正確性結(jié)構(gòu)的精確性： 用均方根偏差（RMSD）來(lái)衡量 目前，多維NMR方法測(cè)定結(jié)構(gòu)的精度可與分辨率為2-2.5的X射線晶體結(jié)構(gòu)相比較。結(jié)構(gòu)的正確性：將蛋白質(zhì)NMR結(jié)構(gòu)與晶體結(jié)構(gòu)相比較。對(duì)NMR結(jié)構(gòu)進(jìn)行反計(jì)算，計(jì)算可能產(chǎn)生的NOE交叉峰，并與NMR實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)照。近年來(lái)，發(fā)展了PROCHECK軟件來(lái)判斷NMR結(jié)構(gòu)的正確性。3.6 多維NMR方法測(cè)定蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的實(shí)例胰島素的NMR結(jié)構(gòu)研究胰島素生化性質(zhì)： 胰島素的晶體結(jié)構(gòu)：胰島素的N

14、MR結(jié)構(gòu)： B鏈羧端去七肽(B24B30)胰島素：一種新晶型的結(jié)構(gòu)胰島素,作為治療糖尿病的制劑，其結(jié)構(gòu)和功能已被進(jìn)行了廣泛的研究.胰島素存在締合的問(wèn)題.它可以締合成二體、四體、六體甚至六體復(fù)合物.然而，在生理?xiàng)l件下，在濃度為納摩爾時(shí)，胰島素將解聚成單體并發(fā)揮生理功能. 因此，胰島素六聚體解聚成單體的過(guò)程就成為人體吸收注射胰島素的速控步.為了獲得速效而保持較高活性的胰島素制劑，人們?cè)O(shè)計(jì)了許多突變體或類(lèi)似物，并對(duì)這些制劑的物理化學(xué)和生物化學(xué)特性進(jìn)行了深入的研究.3.7 蛋白質(zhì)折疊的NMR研究蛋白質(zhì)折疊是很迅速的過(guò)程研究蛋白質(zhì)折疊的意義研究蛋白質(zhì)折疊的方法肌紅蛋白的折疊研究： The Sweetes

15、t Puzzle Getting a protein structure using NMR is a lot of fun, says Chele DeRider, a graduate student at the University of Wisconsin-Madison. Youre given all these pieces to a puzzle and you have to use a set of rules, common sense, and intuitive thinking to put the pieces together. And when you do

16、, you have a protein structure. DeRider is working at UW-Madisons national NMR facility. She is refining the structure of brazzein, a small, sweet protein. Most sweet-tasting molecules are sugars, not proteins; so brazzein is quite unusual. It also has other remarkable properties that make it attrac

17、tive as a sugar substitute. It is 2,000 times sweeter than table sugar with many fewer calories. And, unlike aspartame (NutraSweet?), it stays sweet even after 2 hours at nearly boiling temperatures. In addition to its potential impact in the multimillion-dollar market of sugar substitutes, brazzein

18、 may teach scientists how we perceive some substances as sweet. Researchers know which amino acids in brazzein are responsible for its taste changing a single one can either enhance or eliminate this flavor but they are still investigating how these amino acids react with tongue cells to trigger a s

19、ensation of sweetness. Getting a protein structure using NMR is a lot of fun .You start out with just dots on a page and you end up with a protein structure. Chele DeRider Graduate Student University of Wisconsin-Madison The plum-sized berries of this African plant contains brazzein, a small, sweet

20、protein. Photo Credit: H. M. Hadik Ming and Hellekant（1994）從西非洲熱帶野生植物 Pentadiplandra brazzeana Baill的果實(shí)中，分離出一種甜味蛋白質(zhì)，命名為brazzein，它是由54個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽；甜度是蔗糖的2000倍。The fruit of Pentadiplandra brazzeana Baillon contains a small, sweet-tasting protein named brazzein. The structure of brazzein in solution was determined by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy at pH 5.2 and 22 C.Caldwell, Abildgaard, et al. 1998 ID: 2437 The brazzein fold, which contains one alpha-helix and three strands of antiparallel beta-sh