細胞生物學(xué)系列常見問題及解決方法

1、細胞生物學(xué)系列常見問題及解決方法一、Vazyme TUNEL系列、高背景 (如未凋亡細胞的強綠色熒光背景)、標(biāo)記時間可能過長，可減少孵育時間。、適當(dāng)減少TdT酶及dUTP的用量。、在操作過程中保持細胞濕潤；標(biāo)記反應(yīng)完成，載玻片在用PBS洗一遍之后，可再用含0.1% Triton X-100和5mg/ml BSA的PBS洗三次，每次5分鐘。、熒光信號弱或無信號、細胞建議用Triton-100通透，切片用蛋白酶K處理，切片厚度小于10-15m時，通透1030min即可，如果過厚則延長通透時間。、延長標(biāo)記時間至2h，并適當(dāng)增加TdT酶及dUTP的含量。、陽性對照：設(shè)立凋亡模型。、組織切片從載玻片上脫

2、落a)、組織切片粘附之前的包被不充分。在展片之前，用3-氨丙基三乙氧基硅烷包被顯微鏡載玻片比多聚賴氨酸效果更好。、熒光顯微鏡或流式細胞儀分析只剩下很少的細胞、在操作過程中丟失大量細胞：提高起始的細胞量。、在制備貼到顯微鏡載玻片的細胞懸液時，離心過程中用含1%BSA的PBS洗細胞。二、Vazyme的Annexin V系列1)、Annexin V-FITC染色失敗或者陽性率偏低a)、要確定實驗中的誘導(dǎo)劑是否能產(chǎn)生凋亡：可通過設(shè)定確切凋亡誘導(dǎo)效果的陽性藥物對照來排除這一情況。b)、貼壁細胞消化不當(dāng)：AnnexinV跟PS的結(jié)合需要Ca2+離子，但大多數(shù)胰酶中含Ca2+的絡(luò)合劑EDTA，從而影響染色，

3、建議使用無EDTA的胰酶。c)、細胞用冷PBS洗滌離心后，應(yīng)盡量去掉殘余液體：殘留PBS中的磷酸根，會與游離的Ca2+形成磷酸鈣沉淀。d)、Binding Buffer是否被污染：瓶蓋要緊閉，空氣中的CO2進入后與游離的Ca2+形成CaCO3沉淀，導(dǎo)致實驗的失敗。e)、若為貼壁細胞，藥物誘導(dǎo)后漂浮的細胞也要收集，這部分細胞往往是凋亡陽性的細胞，丟棄會造成陽性結(jié)果偏低。2)、假陽性a)、細胞本身活力差：建議用臺盼藍染色計算細胞的活力，臺盼藍拒染的細胞應(yīng)大于95%。若活力低，建議重新復(fù)蘇細胞，通常剛復(fù)蘇的細胞至少要傳代3次以后才能進行實驗。b)、細胞操作不當(dāng)：尤其是貼壁細胞消化過程中反復(fù)劇烈吹打?qū)?/p>

4、致破壞細胞膜，使得假陽性偏高。c)、誘導(dǎo)時間過長：一般情況下誘導(dǎo)幾個小時就可以出現(xiàn)早期凋亡，因此通常不需要處理大于48小時以上；誘導(dǎo)時間過長會使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)耗盡，導(dǎo)致細胞狀態(tài)差，假陽性結(jié)果偏高。三、Cell Cycle Assay Kit1)、G0/G1突然發(fā)生變化或漂移a)、流式細胞儀管路中有氣泡或被阻塞：建議檢查管路是否通暢或是否有氣泡b)、PI濃度不夠：建議增加PI的濃度c)、與PI孵育的時間不夠長：建議增加孵育的時間2)、峰寬a)、流式細胞儀的流速太快，建議調(diào)整流式細胞儀的流速b)、樣品中有氣泡，檢查樣品中是否有氣泡c)、樣品中有壞死細胞，建議更換樣品3)、無樣品峰a)、可能樣品中無細胞核

5、，壞死細胞過多，建議顯微鏡觀察樣品或更換樣品b)、細胞碎片過多四、ExFect1)、轉(zhuǎn)染效率偏低a)、ExFect與DNA的比例不優(yōu)化：通過預(yù)實驗測試ExFect與DNA的最佳比例(在25 l/g DNA范圍內(nèi)嘗試)。在后續(xù)的實驗中選擇轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性低的比例進行轉(zhuǎn)染。b)、轉(zhuǎn)染前為細胞更換了無血清培養(yǎng)基：ExFect/DNA復(fù)合物的包裝反應(yīng)需在無血清條件下進行，但使用包裝好的復(fù)合物進行轉(zhuǎn)染時，細胞培養(yǎng)基中應(yīng)含有血清。多數(shù)情況下，在完全培養(yǎng)基中進行轉(zhuǎn)染，并且轉(zhuǎn)染后不更換培養(yǎng)基有助于獲得更高的轉(zhuǎn)染效率和更低的細胞毒性。c)、轉(zhuǎn)染時細胞密度不合適：多數(shù)情況下，當(dāng)細胞密度達到60%80%時轉(zhuǎn)染可

6、以取得較高的轉(zhuǎn)染效率。然而細胞類型不同，最適的轉(zhuǎn)染密度也不盡相同?？梢酝ㄟ^預(yù)實驗尋找較優(yōu)化的轉(zhuǎn)染密度，并在后續(xù)實驗中保持這個密度。d)、DNA質(zhì)量偏低(降解或包含內(nèi)毒素)：為實現(xiàn)高效率、低毒性的轉(zhuǎn)染，應(yīng)使用高質(zhì)量的DNA(高純度、無菌、無內(nèi)毒素)。e)、轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物包裝體系中包含血清：當(dāng)復(fù)合物包裝反應(yīng)中存在血清時，轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物無法正常形成。f)、存在轉(zhuǎn)染抑制因素：當(dāng)包裝反應(yīng)和轉(zhuǎn)染過程中存在多聚陰離子聚合物時(例如：硫酸葡聚糖、肝素等)轉(zhuǎn)染將無法正常進行。因此應(yīng)使用不含這些成分的培養(yǎng)基。g)、細胞狀態(tài)偏差：傳代次數(shù)太少或者太多都將導(dǎo)致細胞對轉(zhuǎn)染試劑敏感度的改變。因此，為了提高

7、轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性、降低細胞毒性，應(yīng)盡量使用適度傳代的細胞系，并在不同次實驗時保持細胞傳代次數(shù)的一致性。2)、細胞毒性偏高a)、轉(zhuǎn)染前為細胞更換了無血清培養(yǎng)基：ExFect/DNA復(fù)合物的包裝反應(yīng)需在無血清條件下進行，但使用包裝好的復(fù)合物進行轉(zhuǎn)染時，細胞培養(yǎng)基中應(yīng)含有血清。多數(shù)情況下，在完全培養(yǎng)基中進行轉(zhuǎn)染，并且轉(zhuǎn)染后不更換培養(yǎng)基有助于獲得更高的轉(zhuǎn)染效率和更低的細胞毒性。b)、轉(zhuǎn)染時細胞密度不合適：多數(shù)情況下，當(dāng)細胞密度達到60%80%時轉(zhuǎn)染可以取得較高的轉(zhuǎn)染效率。然而細胞類型不同，最適的轉(zhuǎn)染密度也不盡相同。可以通過預(yù)實驗尋找較優(yōu)化的轉(zhuǎn)染密度，并在后續(xù)試驗中保持這個密度。c)、ExFect/DNA復(fù)合物過量：轉(zhuǎn)染試劑過量會導(dǎo)致較高的細胞毒性。嘗試減少DNA或者ExFect的使用量。d)、ExFect/DNA復(fù)合物加入培養(yǎng)基時分布不均勻：局部轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物濃度過高是導(dǎo)致細胞毒性偏高最常見的原因之一。當(dāng)復(fù)合物添加到培養(yǎng)基之后，應(yīng)