乙型肝炎病原學診斷和治療

1、乙型肝炎病原學診斷和治療一、實驗目的1、熟悉乙肝病毒DNA提取方法2、掌握乙肝病毒DNAPCR檢測方法2二、實驗原理聚合酶鏈反應（PCR）技術是在體外模擬體內(nèi)DNA復制，利用兩段特異的寡核酸引物，由DNA聚合酶催化產(chǎn)生目的基因的擴增技術。3PCR技術基本原理4目的基因擴增循環(huán)數(shù). 擴增子數(shù) (靶序列拷貝數(shù))122438416532664201,048,576301,073,741,824(10億)1 循環(huán)= 2 擴增子2 循環(huán) = 4 擴增子3 循環(huán) = 8 擴增子4 循環(huán) = 16 擴增子5 循環(huán) = 32 擴增子6 循環(huán) = 64 擴增子7 循環(huán) = 128 擴增子5三、實驗準備（一）試劑

2、1、DNA提取液2、PCR反應液3、石蠟油、雙蒸水4、電泳緩沖液（TAE）5、2瓊酯糖6、溴化乙錠（EB）7、Taq聚合酶10XPCR緩沖液dNTP引物6三、實驗準備（一）器材和儀器1、離心機2、水浴鍋3、PCR擴增儀4、電泳槽、電泳儀5、紫外燈6、移液器7移液器加樣槍頭8高速離心機旋渦振蕩器9PCR擴增儀10熒光定量PCR擴增儀11電泳儀電泳槽12暗室中紫外燈觀察結果13（一）乙肝病毒DNA提?。崃呀夥ǎ?、分離血清2、50ul血清加入50 ul裂解液混勻。3、沸水浴煮10分鐘。4、15000轉離心15分鐘。5、取上清到另一離心管中備用。三、實驗步驟14分離血清15加入裂解液提取DNA16

3、熱 裂 解17高 速 離 心18三、實驗步驟（二）HBVDNA擴增1、配制反應液（15ul10TAE，1ulTaq酶，13ul雙蒸水，1ul模板）,振蕩混勻.2、擴增儀中：9430秒，5530秒，72 1分鐘，共30循環(huán)。3、72 延伸5分鐘。19配制PCR反應液20三、實驗步驟（三）擴增產(chǎn)物檢測1、配制2瓊酯糖的凝膠2、取擴增產(chǎn)物10ul加入凝膠小孔中3、電泳30分鐘4、紫外燈下觀察結果。21擴增產(chǎn)物分析221分區(qū)操作：PCR具有超敏感性，因此在檢測過程中應分區(qū)操作，即分為樣品處理區(qū)，PCR擴增區(qū)，產(chǎn)物分析區(qū)。2、試驗前實驗室應使用紫外消毒至少30分鐘，實驗器械應用70乙醇擦拭。3操作時戴一

4、次性手套，加樣頭要求及時更換，吸液時避免飛濺。四、注意事項234每天實驗前，在廢物缸內(nèi)套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次氯酸鈉液，實驗時將吸頭、離心管丟入廢液缸中浸泡。5、EP管在開蓋前應離心片刻。6、所有試劑試驗前充分融化，避免反復凍融。7、每次PCR反應均應設立陰陽性對照。四、注意事項24試驗實設置與管理25PCR室的管理與防污染PCR室建立嚴格規(guī)章制度PCR室嚴格分區(qū)PCR室各區(qū)器械專區(qū)使用PCR室各區(qū)單向流動PCR檢測前后要用1次氯酸鈉液或75乙醇擦拭PCR反應液中使用dUTP防污染2627試劑準備室管理制度 實驗室人員進入該室須穿專用白色工作服，實驗中應需戴手套。 每天實驗開始前，清

5、潔臺面并應打開紫外燈消毒30分鐘。 取出當天試驗需配置和使用試劑，其余試劑要立即收好，并放回冰箱內(nèi)。 實驗中使用的離心管、吸頭等應經(jīng)過滅活無菌處理（應在消毒的有效期內(nèi)）。 PCR其他室的用品不得帶入本室。 每次實驗記錄，應使用本室專用的、帶有本室標志的記錄本、紙和筆。 實驗開始后，當天不得再返回本室。2829樣品制備室管理制度實驗人員進入該室須穿專用蘭色工作服，實驗中應需戴手套，手套須常更換。 樣品的接受、登記、保存和提取按試劑盒要求進行。 使用本室專用的經(jīng)滅菌處理的加樣器和帶濾芯的吸頭。 實驗記錄使用本室專用記錄本和筆。使用過的離心管、吸頭須置于1次氯酸鈉溶液中浸泡，消毒后方可丟棄。 患者樣

6、品按有生物傳染危險品對待，應高壓滅活后棄之。 PCR擴增后區(qū)的物品不得帶入本室。 實驗完畢后要打開紫外燈消毒。30產(chǎn)物分析區(qū)管理制度 實驗人員進入該室須穿專用紅色工作服，實驗中應需戴手套，手套須常更換。 使用本室專用的經(jīng)滅菌處理的加樣器和帶濾芯的吸頭。 實驗記錄使用本室專用記錄本和筆。 使用過的離心管、吸頭須置于1次氯酸鈉溶液中浸泡，消毒后方可丟棄。PCR產(chǎn)物分析區(qū)的物品不得帶出本室，嚴防污染攜帶至前區(qū)。 實驗完畢后要打開紫外燈消毒，最好通夜消毒。31定量PCR概念以外參或內(nèi)參為標準，通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測，對PCR起始模板量的定量32常規(guī)PCR與定量PCR的比較33實時熒

7、光定量PCR原理指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號的積累實時監(jiān)測PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。Ct（cycle threshold)值定義：每個反應管的熒光信號到達設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。熒光閾值（threshold)的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即： threshold=10SD cycle0-1534Ct值與起始模板的關系每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始模板數(shù)越多，Ct值越小，利用已知起始拷貝數(shù)的標準品作出標準曲線，只要獲得未知樣品的Ct值，及可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。35熒光定量的標

8、準曲線 標準曲線未知標本Crossing Point (Cycles)log (copy number)nlog (F2/F1)nlog (F2/F1)Target3836除常規(guī)的一對引物以外，PCR反應體系中另加有一個能與PCR產(chǎn)物雜交的熒光雙標記探針。該探針的5端標記一個熒光基團，3標記另一個熒光基團。此時5端熒光基團吸收能量后將能量轉移給臨近的3端熒光淬滅基團（發(fā)生FRET），因此正常情況下檢測不到該探針5端熒光基團發(fā)出的熒光信號。Taqman探針原理37但當溶液中有模板時，模板變性后低溫退火時，引物與探針同時與模板結合。在引物的介導下，沿模板向前延伸至探針結合處，發(fā)生鏈的置換；Taqm

9、an探針原理38Taqman探針原理Taq酶的53外切酶活性將探針5端連接的熒光基團從探針上切割下來，游離于反應體系中，從而脫離3端熒光淬滅基團的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光，切割的熒光基團數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例。因此根據(jù)PCR反應液的熒光強度即可計算出初始模板的數(shù)量。39實時熒光定量PCR無需內(nèi)標Ct值的重現(xiàn)性:同一模板Ct值恒定.Ct值與起始模板的線性關系決定.內(nèi)標對實時熒光定量PCR有影響:加入內(nèi)標后PCR反應變成雙重PCR,存在競爭。無法加入合適的起始拷貝的內(nèi)標。40定量PCR在臨床診斷治療上的意義對致病微生物核酸含量進行定量檢測彌補免疫檢測的缺陷（如HCV）縮短診斷的窗口期（如HBV,HIV）對治療過程進行藥物療效監(jiān)測指導用藥加快疾病的診斷，病情判斷預后對染色體突變導致的遺傳病進行檢測41定量PCR在乙肝檢測中意義1. 判斷疾病的嚴重程度和傳染性2. PCR結果與血清免疫學結果的綜合評價3. 觀察抗病毒藥物療效，指導藥物用量4.