第八章微生物的遺傳與變異

1、第八章 微生物的遺傳與變異遺傳性：指生物的親代傳遞給其子代一套遺傳信息的特性。基因型：指生物體所攜帶的全部基因的總稱。表型：指遺傳特性在一定環(huán)境條件下的具體表現(xiàn)。變異：指遺傳型的改變，即生物遺傳物質結構上發(fā)生改變。飾變：同樣遺傳型的生物，在不同的外界條件下呈現(xiàn)不同的表型。第一節(jié) 微生物遺傳變異的物質基礎 （一）轉化實驗 1944年美國洛克非勒醫(yī)學研究所的Avery等人證實了1928年英國人Griffith的發(fā)現(xiàn)，并將肺炎鏈球菌S型的DNA成功的轉化無毒性的肺炎球菌R型為有毒的肺炎球菌S型，第一次證明了載有肺炎鏈球菌S型莢膜遺傳信息的物質是DNA。（二）噬菌體的感染實驗 1953年美國人Hers

2、hey和Chase用放射性同位素方法，提供了DNA是噬菌體遺傳物質的直接證據。他們用含32P和35S的培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌H，再用被標記的大腸桿菌培養(yǎng)2噬菌體，直至完全標記上32P和35S的T2噬菌體為止。用標記的T2噬菌體侵染沒有標記的大腸桿菌，結果表明，2噬菌體外殼蛋白中有35S放射性并與細菌的細胞壁連接，而DNA部分則有32P放射性并進如細菌的細胞質中。這一事實說明，在噬菌體侵染細菌過程中蛋白質外殼留在細菌細胞外，只有DNA進入了細胞，又一次證明遺傳物質是DNA，而不是蛋白質。（三）病毒拆開和重建實驗 通過FraenbkelConrat等在植物病毒領域中的著名實驗，證明RNA是煙草花葉病毒

3、的遺傳物質。第二節(jié) 微生物突變 突變（mutation）指遺傳物質-核酸（DNA或RNA）中的核苷酸順序突然發(fā)生了穩(wěn)定的可遺傳的變化。突變包含基因突變和染色體畸變，基因突變是由于DNA鏈上的一對或少數幾對堿基發(fā)生改變而引起的。 一、基因突變的自發(fā)性和突變結果與原因不對應性的證明 人們通常認為，某種細菌從對藥物敏感到產生抗性是由于藥物長期作用于細菌的結果，但實際上，對藥物的這種抗性突變與接觸藥物無關，即突變的性狀與引起突變的原因間無直接的對應關系。后來，人們通過幾個嚴密的科學實驗后終于證明，在接觸抗性因子之前便已出現(xiàn)了抗性菌落。最著名的實驗有：變量試驗、涂布試驗、影印培養(yǎng)試驗 （一）變量試驗 1

4、943年，魯里亞（S.E.Luria）和德爾波留克（M.Delbruck）首先設計。其要點是：先將大腸桿菌液分成等量的兩部分。一部分裝在大試管里，另一部分裝在50支小試管里，將大小試管里的大腸桿菌放在恒溫箱里培養(yǎng)，經過24到60小時后分別接種到固體培養(yǎng)基上。一只大試管分接50副培養(yǎng)皿，而50支小試管，每支接一副培養(yǎng)皿。每皿固體培養(yǎng)基里有等量的噬菌體，能生長的大腸桿菌是抗噬菌體的突變體。所得結果是，從一支大試管里長出來的菌落，也就是抗噬菌體的數量比較一致，即使有差異，也僅僅是實驗上的誤差。而由50支小試管長出來的抗噬菌體菌落，在數量上的差異較大。這說明抗噬菌體突變體是在接觸噬菌體前在一次細胞分裂

5、過程中隨機自發(fā)產生的。這一自發(fā)突變發(fā)生得越早，則抗噬菌體菌落出現(xiàn)得越多，反之越少?？故删w突變體的出現(xiàn)與是否接觸噬菌體無關。（二）涂布試驗 1949年Newcombe設計的試驗，其要點：在12個平板上涂上數目相等的敏感于T1噬菌體的大腸桿菌，經5小時的培養(yǎng)，在皿上長出大量的微菌落，取其中6皿直接噴上T1噬菌體，另6皿則先用滅菌玻棒把微菌落重新均勻涂布一次后同樣噴上等量的T1噬菌體，培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，涂布過的一組有抗性菌落353個，比未涂布過的（僅28個菌落）高得多。這說明該抗性突變發(fā)生在未接觸噬菌體前，噬菌體的加入不是誘導突變的因素。（三）影印培養(yǎng)試驗 所謂影印培養(yǎng)法，實質上是使在一系列培養(yǎng)皿的相同

6、位置上能出現(xiàn)相同菌落的一種接種培養(yǎng)方法。1952年J.Lederberg夫婦首先進行的實驗，是通過使菌不接觸抗性環(huán)境而檢查其抗性菌落出現(xiàn)的方法來證明的。方法要點是：包有滅菌絲絨布的木質圓柱（直徑略小于培養(yǎng)皿底）為印章，用不具抗性環(huán)境（如不加抗生素等）的完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，以印章輕輕粘取菌落，然后再一一接種到不同的選擇培養(yǎng)基（如含有不同抗生素等）上，培養(yǎng)后，對各培養(yǎng)皿相同位置上的菌落作比較，便可選出相應的突變型菌落。 二、自發(fā)突變自發(fā)突變：指微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的突變。自發(fā)突變可能的機制： （一）背景輻射和環(huán)境因素的誘變 例如：充滿宇宙空間的各種短波輻射、高溫的誘變效應以及自然界中存在的

7、誘變物質的作用。由于長期受到原因不詳的誘變因素的綜合效應，便發(fā)生自發(fā)突變。 （二）微生物的代謝產物的誘變 通常存在于細胞內的天然物質，如：過氧化氫、咖啡堿、硫氰化合物、二硫化二丙烯、重氮絲氨酸等。它們既是微生物的代謝產物，又可以引起微生物的自發(fā)誘變。 （三）環(huán)出效應 在DNA復制的過程中，如果其中某一單鏈上偶爾產生一小環(huán)，則會因其上的基因越過復制而發(fā)生遺傳缺失，從而造成自發(fā)突變。 三、誘發(fā)突變（一）物理因素的突變 1.紫外線 紫外線的大劑量作用可導致菌體死亡，小劑量則可引起突變。其主要生物學效應是其對DNA的作用。其中主要機制是胸腺嘧啶二聚體的形成，它可在同一條鏈或兩條鏈上發(fā)生。但發(fā)現(xiàn)形成的復

8、合物暴露在可見光下，會使胸腺嘧啶二聚體重新解聚成為單體，此過程稱為光復活作用。在紫外線照射進行誘變育種工作時，必須在紅光下進行處理或操作，并在黑暗條件下培養(yǎng)，以免發(fā)生光復活作用。 2.X射線和射線 X射線和射線是不帶電的光量子，不能直接引起物質電離，但在與原子或分子碰撞時，能把全部能量或部分能量傳給原子而產生次級電子，這些次級電子具有很高的能量，使產生電離作用，從而直接或間接的改變DNA的結構。其直接效應是使堿基間、DNA間、糖與磷酸間相接的化學鍵斷裂；間接效應是，電離作用引起水或有機分子產生自由基作用于DNA分子，導致缺失或損傷。 （二）化學因素的誘變 1.堿基結構類似物 這是一類與正常堿基

9、結構（A、T、C、G）相似的物質，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-脫氧尿嘧啶（5-dU）、8-氮鳥嘌呤（8-NG）、2-氨基嘌呤等，它們能摻入DNA分子中而不妨礙DNA的正常復制，但其發(fā)生的錯誤配對便可引起堿基對的置換，出現(xiàn)突變。這類代謝類似物只有對正常進行新陳代謝和繁殖著的微生物才起作用，而對休止細胞，游離的噬菌體粒子或離體的DNA分子卻不起作用。 2.與核酸上堿基起化學反應的誘變劑 有些化合物能與DNA分子的某些基團起化學反應，如亞硝酸可使堿基脫氨，脫去的氨基被羥基取代，從而使A、G、C分別轉變成H（次黃嘌呤）、X（黃嘌呤）、U（尿嘧啶），復制時它們便與C、G、A配對。3.移碼誘變 吖啶類

10、化合物,如原黃素、吖啶橙、吖啶黃、a-氨基吖啶等是一類染料，具有扁平結構，能插入到DNA分子的堿基對之間，使DNA結構變形，在復制時產生不對稱交換，從而引起在DNA鏈中插入或缺失一個或幾個核苷酸，造成這一對核苷酸以后所有密碼發(fā)生移動，產生移碼突變。四、誘變育種 誘變育種是指通過人工方法處理微生物，使之發(fā)生突變，并運用合理的篩選程序和方法，把適合人類需要的優(yōu)良菌株選育出來的過程。 第三節(jié) 基因重組 把兩個不同性狀的個體內的遺傳基因轉移到一起，經過遺傳分子的重新組合，形成新遺傳型個體的方式，稱為基因重組（gene recombination）。 原核微生物的基因重組方式主要有轉化、轉導、接合等形式

11、。 一、轉化（transformation） 受體菌直接吸收了來自供體菌的DNA片段，通過交換，把它組合到自己的基因組中，從而獲得了供體菌的部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉化（transformation)。轉化后的受體菌，就稱轉化子（transformant）。 受體菌：只有處于感受態(tài)的細菌才能吸收外源DNA實現(xiàn)轉化。細菌的感受態(tài)是一種生理狀態(tài)，它可以通過感受態(tài)因子，一種蛋白質因子在細胞間的轉移而獲得；也可由某些生長條件誘導而成，如受體菌由豐富培養(yǎng)基轉移到貧瘠培養(yǎng)基時約15%的枯草桿菌進入感受態(tài)。也與培養(yǎng)時間有關，如肺炎球菌的感受態(tài)出現(xiàn)在對數期后的40min。 轉化過程示意圖二、轉導（transd

12、uction） 通過完全缺陷或部分缺陷噬菌體為媒介，把一個細胞（供體細胞）的DNA片段轉移到另一個細胞（受體細胞）中，并使后者發(fā)生遺傳變異的過程，稱為轉導(transduction)。通過轉導獲得部分供體細胞部分遺傳性狀的重組受體細胞，稱為轉導子。攜帶供體部分遺傳物質（DNA片段）的噬菌體稱為轉導噬菌體或轉導顆粒。在噬菌體內僅含有供體DNA的稱為完全缺陷噬菌體；在噬菌體內同時含有供體DNA和噬菌體DNA的稱為部分缺陷噬菌體（部分噬菌體DNA被供體DNA所替換）。 三、接合（conjugation) 通過供體菌和受體菌完整細胞間的直接接觸而傳遞大段DNA的過程，稱為接合(conjugation)

13、。 接合菌株與F因子 在細菌中，接合現(xiàn)象研究的最清楚的是大腸桿菌。大腸桿菌有性別分化。決定其性別的因子是F因子（即致育因子或稱性質粒），這是一種在染色體外的小型獨立環(huán)狀DNA單位。F因子是一種屬于附加體（episome）的質粒，它既可脫離染色體在細胞內獨立存在，也可插入（即整合）到染色體組上。由于F因子在細胞中的有無和存在方式的不同，可把大腸桿菌分成4種接合類型：F+（雄性菌株）、F-（雌性菌株）、Hfr（高頻重組菌株），F(xiàn)菌株。 F因子的存在和轉移方式（三）幾種雜交結果 1、F+菌株和F-菌株接合的結果是產生二個F+菌株。 2、F菌株和F-菌株接合的結果是產生二個F菌株。 3、Hfr菌株和F

14、-菌株接合，在大多數的情況下，受體細菌仍然是F-，只有在極少數的情況下，由于遺傳物質轉移完整，受體細菌才能成為Hfr菌株。第四節(jié) 基因工程 基因工程（gene engineering）指基因水平上的遺傳工程，它是用人為方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質（DNA大分子）提取出來，在離體條件下進行切割后，把它和作為載體的DNA分子連接起來，然后導入某一受體細胞中，以讓外來的遺傳物質在其中安家落戶，進行正常的復制和表達，從而獲得新的物種的一種嶄新的育種技術。 一、基因分離1、提取供體細胞的DNA，加入專一性很強的限制性核酸內切酶，從而獲得帶有特定基因并露出稱為黏性末端的DNA。2、提供作為載體的細

15、菌質粒（也可用噬菌體或病毒作載體）。其中DNA也可用同樣的限制性核酸內切酶切斷，露出其相應的黏接末端。二、體外重組 把供體細胞的DNA片段和質粒DNA片段放在試管中，在較低的溫度（56）下混合“退火”，當兩者混合在一起時，凡粘接末端上堿基互補的片段，就會因氫鍵的作用而彼此吸引，重新形成雙鍵。這時，在外加連接酶的作用下，供體DNA片段與質粒DNA片段的裂口處被“縫合”，形成一個完整的有復制能力的環(huán)狀重組體，及“雜種質?！薄?三、載體傳遞 通過載體把供體的遺傳基因導入受體細胞內。載體必須具有自主復制的能力。 四、復制表達 “雜種質?！边M入受體細胞后，能通過自主復制而得到擴增，并使受體細胞表達出為供

16、體細胞所固有的部分遺傳性狀，成為“工程菌”。 五、篩選、繁殖 重組后的雜種質粒的性狀是否符合原定藍圖，以及它能否在受體細胞內正常增殖和表達等還需要經過仔細檢查，以便能在大量個體中設法篩選出所需要性狀的個體，然后才可加以繁殖和利用。第五節(jié) 菌種退化、復壯和保藏 在微生物的研究中，要保持一個優(yōu)良菌株的遺傳穩(wěn)定性是一件艱苦的工作。菌種退化就是一種潛在的威脅。一、菌種退化現(xiàn)象 菌種退化（degeneration）指群體中退化細胞在數量上占一定數值后，表現(xiàn)出菌種生產性能下降的現(xiàn)象。常表現(xiàn)為，在形態(tài)上的分生孢子減少或顏色改變，甚至變形；在生理上常指產量的下降。 二、退化菌種的復壯 因為在退化的菌種中仍有一

17、些保持原有菌種特性的細胞，故有可能采取一些相應措施，使這些細胞生長、繁殖，以更新退化的菌株，稱之為菌種的復壯。常用的方法是單細胞分離、純化、擴大培養(yǎng)。 三、菌種的保藏 經誘變篩選、分離純化以及純培養(yǎng)等一系列艱苦勞動得到的優(yōu)良菌株，能使其穩(wěn)定的保存、保持原有的特性、不死亡、不污染，這就是菌種保藏的任務。 （一）原理 人為地創(chuàng)造合適的環(huán)境條件，使微生物的代謝處于不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。這些人工環(huán)境主要從低溫、干燥、缺氧三方面設計。 （二）常用方法 1、斜面保藏法 將菌種接種在斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長完全后，置于4冰箱中保藏，每隔一定時間再轉接到新的斜面培養(yǎng)基上，生長后繼續(xù)保藏。此方法簡單

18、、存活率高，故應用較普遍。其缺點是菌株仍有一定的代謝強度，傳代多則菌種易變異，故不宜長時間保藏菌種。 2、液體石蠟覆蓋保藏法 為了防止傳代培養(yǎng)菌因干燥而死亡，也為限制氧的供應以削弱代謝水平，在斜面或穿刺的培養(yǎng)基中覆蓋滅菌的液體石蠟。本法的優(yōu)點是方法簡單不需特殊裝置。3、載體保藏法 使微生物吸附在適當的載體上（土壤、沙子等）進行干燥保存的方法。最常用的有土壤保藏法。主要用于能形成孢子或孢子囊的微生物的保存。此方法簡便，保藏時間長，微生物轉接也較方便，故應用范圍較廣。 4、懸液保藏法 使微生物混懸于適當媒液中加以保藏的方法，其中蒸餾水保藏法較為常用。酵母菌、霉菌和放線菌的大部分均適用此法保存。操作