藥用植物基因工程研究課件

1、植物基因工程技術(shù)研究進(jìn)展Advances in Gene Engineering of Plants匯報內(nèi)容植物基因工程的概念 主要內(nèi)容及相關(guān)的技術(shù) 藥用植物基因工程研究 小結(jié) 一、植物基因工程的概念 所謂植物基因工程，是指利用基因工程的普遍原理和通用技術(shù)，將特定目的基因經(jīng)克隆修飾后，與合適的表達(dá)元件和合適的轉(zhuǎn)化載體進(jìn)行重組，進(jìn)而轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞內(nèi)，使之穩(wěn)定整合在植物基因組中正常的表達(dá)和遺傳，最終改良植物的遺傳性狀或獲得有用的基因產(chǎn)品的方法二、 植物基因工程的主要內(nèi)容及相關(guān)的技術(shù) 分離有用目的基因的方法： PCR擴(kuò)增技術(shù)、基因文庫分離法、化學(xué)合成法等.mRNA差別顯示技術(shù)、代表性差式分析（RDA）

2、、和抑制性減法雜交（SSH）等是在PCR基礎(chǔ)上建立的分離和克隆目的基因的新方法.DNA插入誘變法也稱DNA 標(biāo)簽法是從野生型基因組DNA文庫中克隆目的基因的方法，主要有兩種類型：轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法和T-DNA標(biāo)簽法，此外還有標(biāo)簽測序法，包括表達(dá)序列標(biāo)簽法和基因表達(dá)序列分析法 . 植物表達(dá)載體的構(gòu)建，即對目的基因進(jìn)行一些修飾，改造: 5端加啟動子，3端加終止子。目前最常用的啟動子是從花椰菜花葉病毒中分離出來的35S啟動子，其次是胭脂堿和章魚堿合成酶的NOS啟動子和OCS啟動子。目前最常用的終止子是胭脂堿合成酶的Nos終止子和Rubisco小亞基基因的3端區(qū)域。目的基因轉(zhuǎn)入植物的方法 :一種是載體法:土

3、壤農(nóng)桿菌Ti 質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法。 例子，張蔭麟等用發(fā)根農(nóng)桿菌和根癌農(nóng)桿菌感染丹參無菌苗，分別誘導(dǎo)出毛狀根和冠癭瘤，使其在無激素培養(yǎng)基及光照條件下分化出丹參再生植株，以發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的再生植株具典型毛狀根再生植物的特征，根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的再生植株株形高大，根系發(fā)達(dá)，丹參酮含量高于原植物。 另一種是直接轉(zhuǎn)移法: 目前的技術(shù)有電擊法、基因槍法、激光微束穿孔法、顯微注射法、直接注射法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、細(xì)菌圓球體融和法、多聚物介導(dǎo)法、花粉管通道法、花粉介導(dǎo)法、超聲波法、氣槍法、渦流法等.轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的篩選及轉(zhuǎn)基因植物的鑒定 1）遺傳表型直接篩選 ：如共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)及

4、MAT載體系統(tǒng)等.其中共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中的雙T-DNA載體系統(tǒng)是去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標(biāo)記基因的一種簡單有效的方法.2）依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析篩選3）核酸分子雜交分析為了區(qū)分轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因植物，常借組報告基因，主要的報告基因有：胭脂堿合酶（NOS）、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPT1）、熒光素酶（LUC）和-葡萄糖甘酸酶（GUS）基因，綠色熒光蛋白（GFP）基因等.外源基因表達(dá)的檢測主要是對特異性mRNA或表達(dá)蛋白的檢測。 一是NPT1和GUS基因融合 二是Northern Blotting和Western Blotting分析 三是主要針對表達(dá)蛋白的檢測 三、藥用植物基因工

5、程研究 轉(zhuǎn)基因器官的培養(yǎng) 發(fā)狀根培養(yǎng) 發(fā)狀根是植物受發(fā)根農(nóng)桿菌感染后產(chǎn)生的。在感染過程中，發(fā)根農(nóng)桿菌將其Ri 質(zhì)粒的T-DNA上的基因轉(zhuǎn)移并整合入植物基因組，這些基因表達(dá)后即產(chǎn)生發(fā)狀根。特點(diǎn)： 生長速度快； 合成次生代謝產(chǎn)物的能力強(qiáng)； 可以向培養(yǎng)液中分泌一定的產(chǎn)物； 無需添加外源激素 Ri 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)還具有如下優(yōu)點(diǎn)： 對單個的根尖培養(yǎng)系的研究結(jié)果表明，一個發(fā)狀根是單個轉(zhuǎn)化細(xì)胞的克隆體，即使它們含有多個獨(dú)立的轉(zhuǎn)化發(fā)狀根，每個發(fā)狀根的T-DNA 結(jié)構(gòu)也是非常穩(wěn)定的，并且單個根尖的分枝也常具有與親本根系一樣的T-DNA 組成。發(fā)狀根的這種克隆性質(zhì)有利于篩選和轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究。 利用Ri 質(zhì)粒轉(zhuǎn)移外源

6、基因容易從發(fā)狀根或愈傷組織上產(chǎn)生再生植株，不必除去象Ti 質(zhì)粒內(nèi)的一類致癌基因 應(yīng)用：（1）許多有開發(fā)價值的次生代謝產(chǎn)物已從不同植物的發(fā)狀根培養(yǎng)物中提取出來，有的化合物已通過發(fā)狀根培養(yǎng)法得以工業(yè)化生產(chǎn)或中試生產(chǎn)，其中藥用植物較高的有喹啉生物堿、吲哚生物堿等次生代謝產(chǎn)物都是重要的藥用化合物。（2）發(fā)狀根培養(yǎng)生產(chǎn)的次生代謝產(chǎn)物不只限于那些正常植物的根中能夠合成的物質(zhì)，對于那些由植物綠色部分所合成的次生物質(zhì)而言，綠色發(fā)狀根更具有十分重要的意義。 2.冠癭瘤和畸狀莖培養(yǎng) 根癌農(nóng)桿菌Ti 質(zhì)粒的T-DNA 片段(含tms 基因、tm基因)通過根癌農(nóng)桿菌感染植物，并整合進(jìn)入植物細(xì)胞的基因組，誘導(dǎo)冠癭瘤組織

7、的發(fā)生。特點(diǎn)： 冠癭瘤離體培養(yǎng)時，具有激素自主性、增殖速度較常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)快等特點(diǎn)，其次生代謝產(chǎn)物合成的穩(wěn)定性與合成能力較強(qiáng)。 植物種類農(nóng)桿菌/Ti質(zhì)粒培養(yǎng)物代謝產(chǎn)物石刁柏(Asparagus officinalis Linn.)C58C1冠癭瘤顛茄(Atropa belladonna Linn.)PGV2215 (aux)畸狀莖天仙子胺到茛胺的生物轉(zhuǎn)化鬼針草(Bidens sp.)Ti plasmid冠癭瘤多炔類歐洲紅豆杉(Taxus baccata Linn.)B0542、C58冠癭瘤紫杉醇及其類似物短葉紅豆杉(Taxus brevifolia Nutt. )B0542、C58冠癭瘤紫杉醇及

8、其類似物長春花Catharanthus roseus (Linn.) G. DonTi plasmid冠癭瘤細(xì)胞系生物堿金雞納樹Cinchona ledgeriana (Howard)Moens ex Trim.A6冠癭瘤細(xì)胞系丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)C58冠癭瘤醌啉生物堿辣薄荷(Mentha piperita Linn.)PTiT37畸狀莖丹參酮檸檬留蘭香(Mentha citrata Ehrh.)PTiT37畸狀莖薄荷油三萜毛地黃(Digitalis purpurea Linn.) PTiC58、pTiB6S3冠癭瘤薄荷油三萜羽扇豆(Lupinus mic

9、ranthus Guss.) DSM30151冠癭瘤細(xì)胞系強(qiáng)心甾表1 Ti 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化藥用植物形成的冠癭瘤和畸狀莖藥用植物模式基因工程 植物基因工程的最終目的是把有用的基因轉(zhuǎn)移到受體基因組，并在受體中能穩(wěn)定表達(dá)和遺傳。研究遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系及外源目的基因的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制，需要一類具有選擇標(biāo)記的基因，稱為模式基因(model gene)或報道基因(reporter gene)。 模式基因大致可分抗性基因和編碼催化人工底物產(chǎn)生顏色變化的酶的基因2類。前者常用的有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、潮酶素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，以及草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因等；后者有葡萄糖苷酶、螢火蟲熒光素酶基因、綠色熒光蛋

10、白基因等。應(yīng)用見表。植物種類 模式基因載體 代謝產(chǎn)物 植株再生黃花蒿(Artemisia annua Linn.)Pnos-kanRi (pRiA46)青蒿素石刁柏(Asparagus officinalis Linn.)Nos-APHTi未確定顛茄(Atropa belladonna Linn.)TR1-kan、TR2-gus (pGSGluc1)Ri (pRi15834)莨菪烷生物堿甜菜(Beta vulgaris Linn.)Pnos-kan (pBin19)、Pnos-hyg (pAGS125)Ri (pRi1855)Betalain pigments洋地黃(Digitalis lan

11、ata Linn.)Pnos-kan 35S-gus (pBI121)Ti (pGV2260)未確定毛地黃(D. purpurea Linn.)TR1-kan、TR2-gus (pGSGluc1)Pnos-kan、35S-gus (pBI121)Ri (pRi15834)強(qiáng)心甾洋甘草(Glycyrrhiza glabra Linn.)Pnos-kan 35S-gus (pBI121)Ri (pRi15834)甘草甜素甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.) TR1-kan、TR2-gus (pGSGluc1)Ri (pRi15834)甘草甜素中寧枸杞(Lycium ba

12、rbarum Linn.) Pnos-kanTi (pGV3850、neo1103)未確定黃花煙草(Nicotiana rustica Linn.) Pnos-kan (pBin19)、Pnos-hyg (pAGS125)Ri (pRi1855)煙堿生物堿甾枳殼Poncirus trifolliata (Linn.) Raf. Pnos-kan 35S-gusTi (pGA482GG)未確定黃岑(Scutellaria baicalensis Georgi) Ri (pRi15834)黃酮類表2 利用模式基因轉(zhuǎn)化的藥用植物通過轉(zhuǎn)基因改良藥用植物的遺傳特性 將一些有用的目的基因?qū)胨幱弥参镏?，?/p>

13、望在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)藥用植物某些遺傳特性的定向改良。 1.提高抗性 通過遺傳轉(zhuǎn)化,將這些基因?qū)胨拗髦参镆栽鰪?qiáng)其抗性，這方面的研究工作已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展. 2.代謝途徑 在掌握次生產(chǎn)物代謝途徑的分子機(jī)制的基礎(chǔ)上,借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和酶的合成,可以提高目標(biāo)產(chǎn)物的含量. (例：紫杉醇 ） 3.其它基因相關(guān)工程 在進(jìn)行外源基因的植物次生代謝產(chǎn)物的遺傳操作中，許多研究者對細(xì)胞色素P-450 基因的研究興趣與日俱增. （絞股藍(lán) 和煙草）原生質(zhì)體培養(yǎng) 20 世紀(jì)80 年代開始，原生質(zhì)體培養(yǎng)已成為一個研究熱點(diǎn)，尤其是藥用植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)。藥用植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)包括夾竹桃科(Apocynaceae)、五加科(Araliaceae)、紫草科(Boraginaceae)等以及單子葉植物的天南星科(Araceae)和百合科(Liliaceae)的數(shù)十種植物，我國學(xué)者在該領(lǐng)域也進(jìn)行了較為深入的研究。四、小 結(jié) 總之，基因工程這一新技術(shù)在藥類植物方面應(yīng)用的前途是無限廣闊的。 通過雜交、誘變、多倍體、試管受精、原生質(zhì)融 合、花藥培養(yǎng)等生物技術(shù)獲得優(yōu)質(zhì)的新品種。 重組DNA技術(shù)可將植物及微生物的基因相互轉(zhuǎn)移， 從而使用藥用植物資源再生。 發(fā)根農(nóng)桿菌感染雙子葉植物形成毛狀根的培養(yǎng)系 統(tǒng) 也成熟起來。因?yàn)槊珷罡L迅速，遺傳性穩(wěn) 定， 生化特性不易改變，這對于