標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)技術(shù)及應(yīng)用(兩節(jié)課)新版

1、免疫組織化學(xué)技術(shù)(jsh)及應(yīng)用 南方(nnfng)醫(yī)科大學(xué)病理教研室張進(jìn)華 共二百零四頁 概念(ginin) 免疫組織化學(xué)（免疫組化）技術(shù)是利用已知的特異性抗體或抗原能特異性結(jié)合的特點，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記于結(jié)合后的特異性抗原上的顯示劑，如酶，金屬離子、熒光素、同位素等，顯示一定的顏色，并借助顯微鏡、熒光顯微鏡或電子顯微鏡觀察其顏色變化，從而在抗原抗體結(jié)合部位確定組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的一門新興組化技術(shù)。 共二百零四頁 免疫組化是組織化學(xué)吸收了免疫學(xué)的理論和技術(shù)發(fā)展(fzhn)起來的一門重要的方法學(xué)，在現(xiàn)代生物學(xué)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用，尤其在醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)和臨床研究中發(fā)揮著重要的作用，對疾病尤其是腫瘤的診斷、鑒別

2、診斷及發(fā)病機(jī)理的研究提供了強(qiáng)有力的手段。共二百零四頁 免疫組化是一種綜合技術(shù)，除抗原抗體的制備、抗體的標(biāo)記外，還包括細(xì)胞組織材料的準(zhǔn)備（包括標(biāo)本取材與貯存(zhcn)及固定、組織脫水、浸蠟、包埋等），緩沖液及有關(guān)試劑的配制。共二百零四頁在染色過程中： 實驗方案的設(shè)計、 抗體的稀釋、 內(nèi)原性過氧化物酶的阻斷， 非特異性染色的消除、 染色對照的準(zhǔn)確設(shè)計 結(jié)果的分析判斷。只有掌握了這些(zhxi)技術(shù)，才能做好高質(zhì)量的免疫組化切片。 共二百零四頁 抗原(kngyun)和抗體：共二百零四頁抗原（antigen） 凡能刺激(cj)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并能與抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合的物

3、質(zhì)稱為抗原。物質(zhì)所具有的這種特性稱為抗原性（antigenicity），即抗原性具有免疫原性和反應(yīng)原性兩種基本屬性。 共二百零四頁抗體(antibody) 是機(jī)體(jt)受抗原刺激后，在體液中出現(xiàn)的一種能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白。它是構(gòu)成動物及人類體液免疫作用的主要物質(zhì)。 共二百零四頁多克隆抗體(kngt) 制備共二百零四頁共二百零四頁單克隆抗體(kngt)制備 共二百零四頁共二百零四頁免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原理： 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)(gnj)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（抗體）。共二百零四頁 在細(xì)

4、胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮(mngling)的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位、以及利用定量技術(shù)測定含量。 共二百零四頁 用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法，用已知的熒光抗原標(biāo)記示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，以熒光抗體方法較常用(chn yn)。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù)。 共二百零四頁共二百零四頁共二百零四頁共二百零四頁常用的熒光(ynggung)素 1、異

5、硫氰酸熒光素(FITC) 熒光色 蘋果綠 2、四乙基羅達(dá)明（RB200）熒光色紅色 3、cy3熒光色 紅色 4、AMCA熒光色 藍(lán)色熒光 5、ELF熒光色 黃綠色 共二百零四頁 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分直接法、夾心(jixn)法、間接法和補(bǔ)體法。共二百零四頁一、直接法 1、檢查抗原法這是最早的方法，用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成熒光特異性抗體，直接與細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。此法十分特異和簡便(jinbin)，但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。 共二百零四頁共二百零四頁 2、檢查抗體法：將抗原標(biāo)記上熒光素，即為熒光抗原，用此熒光抗原與細(xì)胞

6、(xbo)或組織內(nèi)相應(yīng)抗體反應(yīng)，而將抗體定位檢測出來。 共二百零四頁二、間接法 1、檢查(jinch)抗體法（夾心法）此法是先用特異性抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)抗體反應(yīng)，再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)抗體上的抗原相結(jié)合，抗原夾在細(xì)胞抗體與熒光抗體之間，故稱夾心法。 共二百零四頁共二百零四頁2、檢查抗體法 用已知抗原細(xì)胞或組織標(biāo)本的切片，加上待檢查血清，如果其中含有切片中某種抗原的抗體，抗體使沉淀結(jié)合在抗原上，再用間接(jin ji)熒光抗體（抗種屬特異性IgG熒光抗體）與結(jié)合在抗原上的抗體反應(yīng)（如檢測人血清中的抗體必須用抗人IgG熒光抗體等），在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反應(yīng)部位呈現(xiàn)明亮的特異

7、性熒光。此法是檢驗血清中自身抗體和多種病原抗體的重要手段。 共二百零四頁3、檢查抗原法（間接法） 此法是直接法的重要改進(jìn)，先用特異性（對細(xì)胞或組織內(nèi)抗原）抗體（或稱第一抗體）與細(xì)胞標(biāo)本反應(yīng)(fnyng)，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體（也稱第二抗體，種特異性）與結(jié)合在抗原上的抗體（是第二抗體的抗原）結(jié)合，形成抗原抗體熒光抗體的復(fù)合物。 共二百零四頁共二百零四頁 由于(yuy)結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光抗體顯著多于直接法，從而提高了敏感性。如細(xì)胞抗原上每個分子結(jié)合35個分子抗體，當(dāng)此抗體作為抗原時又可結(jié)合35分子的熒光抗體，所以直接法相比熒光高密度可增強(qiáng)3或4倍。共二百

8、零四頁 此法除靈敏性高外，它只需要制備一種屬間接熒光抗體，可以適用于多種第一抗體的標(biāo)記顯示(xinsh)。這是現(xiàn)在最廣泛應(yīng)用的技術(shù)。共二百零四頁三、補(bǔ)體法 1、直接檢查組織內(nèi)免疫(miny)復(fù)合物法用抗補(bǔ)體C3等熒光抗體直接作用組織切片，與其中結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的補(bǔ)體反應(yīng)，而形成抗原抗體補(bǔ)體復(fù)合物抗補(bǔ)體熒光抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽性熒光的部位就是免疫復(fù)合物存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢診斷等。 共二百零四頁共二百零四頁 2、間接檢查組織的內(nèi)抗原法常將新鮮補(bǔ)體與第一抗體(kngt)混合同時加在抗原標(biāo)本切片上，經(jīng)37孵育后，如發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，補(bǔ)體就結(jié)合在此復(fù)合物上，再用抗補(bǔ)體熒光抗

9、體與結(jié)合的補(bǔ)體反應(yīng)，形成抗原抗體抗補(bǔ)體熒光抗體的復(fù)合物，此法優(yōu)點是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來源的第一抗體的標(biāo)記顯示。 共二百零四頁 四、雙重免疫熒光標(biāo)記法 在同一細(xì)胞組織標(biāo)本上需要同時檢查兩種抗原時，要進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧?，一?ybn)均采用直接法，將兩種熒光抗體（如抗A抗B）以適當(dāng)比例混合，加在標(biāo)本上孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體，抗A抗體用異硫氰酸熒光素標(biāo)記，發(fā)黃綠色熒光；抗B抗體用TMRITC或RB200標(biāo)記，發(fā)紅色熒光，可以明確顯示兩種抗原的定位。 共二百零四頁共二百零四頁免疫(miny)酶細(xì)胞化技術(shù)共二百零四頁原理 酶標(biāo)記抗體原理和熒光抗體法相似，先用結(jié)合劑（戊二醛）

10、將酶結(jié)合在抗體免疫球蛋白分子的氨基或羥基上而形成酶標(biāo)記抗體。直接法是將酶直接標(biāo)記在抗體上，然后和相應(yīng)抗原反應(yīng)，使抗原抗體復(fù)合物上帶有酶分子，再與酶的底物H2O-DAB（3,3一二胺基聯(lián)苯胺）呈色反應(yīng)，在抗原抗體反應(yīng)部位形成棕色或深棕色產(chǎn)物，借以研究抗原物質(zhì)(wzh)頒布和性質(zhì)。 共二百零四頁目前常用的方法有 1、 直接(zhji)法 2、 間接法 3、 三步法共二百零四頁免疫組化室常用小設(shè)備冰箱(4 、-18 )；貯存免疫組化試劑用。18cm不銹鋼高壓鍋，電爐(1000-1500W)或微波爐(700-800瓦)(抗原修復(fù)用，可任選一種)，電爐或微波爐，1000ml燒杯；3 . 孵育盒、塑料(s

11、lio)耐高溫切片架；沖洗瓶、定時器、塑料試管、5-10ml玻璃試管等；100l 、200 l 、20 l 可調(diào)微量移液器各1支；相應(yīng)的吸嘴。磨砂玻片；PAP劃圈筆；空調(diào)1臺；恒溫箱1臺；10. pH計1臺(PHS-25型)。共二百零四頁共二百零四頁共二百零四頁共二百零四頁共二百零四頁抗原修復(fù)(xif) 目前進(jìn)行的常規(guī)石蠟切片標(biāo)本，一般均用甲醛固定。 共二百零四頁 事實上經(jīng)甲醛固定(gdng)的部分組織細(xì)胞，免疫組化標(biāo)記敏感性明顯降低，其原因為： （1）在用甲醛固定過程中形成醛鍵而封閉了部分抗原決定簇 共二百零四頁 （2）甲醛在保存進(jìn)程中會形成(xngchng)羧甲基，而封閉抗原決定簇 共二百

12、零四頁 （3）在用固定劑固定時，會使蛋白蛋白之間發(fā)生交聯(lián)，也可能會封閉抗原決定簇，因此在染色時，有些抗原需先進(jìn)行(jnxng)修復(fù)或暴露。國內(nèi)外一些試劑公司已將需要做抗原修復(fù)的抗體注明在產(chǎn)品目錄或商品化抗體的說明書中。 共二百零四頁抗原修復(fù)(xif)方法一般分為: 化學(xué)方法 物理/化學(xué)方法 共二百零四頁 (一)化學(xué)(huxu)方法（酶消化方法） 1、胰蛋白酶（trypsin）消化方法 酶濃度一般為0.050.1%，配制方法：取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml0.05%或0.1%PH7.8的無水氯化鈣水溶液中，溶解即可用。消化條件和時間：將切片旋轉(zhuǎn)在濕盒，371040min，一般為2

13、0min即可。 共二百零四頁 2、胃蛋白酶(pepsin)消化方法(fngf)0.4%胃蛋白酶，用0.1mol/l,PH7.4的PBS中，消化時間為37,20min。主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示如纖粘素、膠原酶等。 共二百零四頁 3、鏈霉蛋白酶（ponase）消化(xiohu)方法 濃度為0.1%、該酶溶于0.5mol/l，PH7.4的Tris-Hcl中，消化時間為20min。 共二百零四頁 4、無花果蛋白酶（ficin）消化(xiohu)方法其濃度基本與胰蛋白酶相似，溶在PBS（PH7.4）中即可用于消化，消化時間為20min。 共二百零四頁 5、菠蘿(blu)蛋白酶消化方法 其濃度為0.4%

14、1%，溶在0.01mol/l，PH7.4的PBS中，消化時間為20min。 共二百零四頁 6、尿素消化方法 有人認(rèn)為尿素消化可以提高組織中抗原抗體(kngt)反應(yīng)，尤其是用于單克隆抗體(kngt)的石蠟切片，有時較蛋白酶消化效果好。方法為3mol/l尿素水溶液處理切片5min。 共二百零四頁胰蛋白酶溶液 胃蛋白酶溶液和無花果蛋白酶溶液現(xiàn)有即用型產(chǎn)品銷售，具有效果(xiogu)好、使用方便、保存期長等優(yōu)點。 共二百零四頁 在選擇酶消化時，應(yīng)針對要顯示的抗原成分不同而不同，同時可根據(jù)抗體說明書的要求加以選擇，一般來說，胃蛋白酶和菠蘿(blu)蛋白酶主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的消化，其余均為細(xì)胞內(nèi)抗原的消

15、化。弱消化用無花果蛋白酶，中度消化用胰蛋白酶，強(qiáng)消化用胃蛋白酶，但在日常工作中用胰蛋白酶消化即可。 共二百零四頁物理/化學(xué)方法 1、單純加熱方法將片子入盛有檸檬酸鹽緩沖液的容器中，置電爐上加熱至沸騰(fitng)，并持續(xù)10min。 共二百零四頁 2、高壓加熱方法 將片子(pin zi)放入盛有檸檬酸鹽緩沖液的高壓鍋內(nèi)，置電爐上對噴氣，并持續(xù)2min。 共二百零四頁 3、微波方法 將片子(pin zi)放入盛有檸檬酸鹽緩沖液的容器中，置微波爐上加熱合溫度保持在92100，并持續(xù)25min，在第1次5min后可視檸檬酸鹽緩沖液是否有蒸氣減少，如有，可適當(dāng)加蒸餾水后再進(jìn)行第2次的min。值得一提的

16、是各個病理科所使用的微波爐型號不同，應(yīng)適當(dāng)加以摸索調(diào)試，以掌握最佳的實驗條件。 共二百零四頁檸檬酸鹽緩沖液的配制(pizh)：A液稱取21.01g檸檬酸溶于1000ml蒸餾水中。B液 稱取29.41g檸檬酸鈉溶于1000ml蒸餾水中。工作液取9mlA液和41mlB液加入450ml蒸餾水中，調(diào)PH6.00.1/6.00.1。共二百零四頁 有關(guān)抗原修復(fù)中的作用機(jī)理尚不完全清楚，可能與下列因素有關(guān)： 1、化學(xué)反應(yīng) 細(xì)胞中抗原決定簇因甲醛(ji qun)等化學(xué)物質(zhì)使其封閉，化學(xué)物質(zhì)分子或離子與部分決定簇相結(jié)合產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，增加細(xì)胞和組織的通透性，以便抗體與抗原最大限度結(jié)合。 共二百零四頁 近年來，許多

17、學(xué)者通過利用重金屬（znso4）、檸檬酸鹽緩沖液、尿素、PBS液等多種修復(fù)液，結(jié)果抗原修復(fù)有不同程度的差別，說明化學(xué)效應(yīng)(xioyng)的存在。 共二百零四頁2、熱效應(yīng) 組織切片在高溫下使某些已被封閉的抗原(kngyun)決定簇得以重新暴露和修復(fù)。 共二百零四頁3、微波直接作用(zuyng) 組織切片在調(diào)頻電磁波作用下，可打開蛋白質(zhì)間交聯(lián)鏈，使抗原決定簇中化學(xué)鍵獲得修復(fù)。 共二百零四頁消除內(nèi)源性過氧化物酶 這是在免疫酶技術(shù)中對一切組織標(biāo)本切片必須早些處理的一個步驟。由于切片內(nèi)可能原有過氧物酶存在，當(dāng)用免疫酶法顯色時，這種內(nèi)源性酶的活性同時顯示出來，造成對抗體上酶標(biāo)記(bioj)混淆。 共二百零

18、四頁 為清除這種染色的干擾，一般采用(ciyng)含3%H2O2的甲醇預(yù)先處理切片10min。可用2.28%過碘酸氧化5分鐘，以抑制內(nèi)源酶的活性。 共二百零四頁 非免疫血清陰滯組織內(nèi)反應(yīng)部位 1、無關(guān)動物正常血清（1：20） 孵育(f y)20分鐘。 2、第二抗體同種動物的正常血清 共二百零四頁 改善組織的透過性 在染色前對組織切片須要處理的另一步驟就是改善組織的透過性。當(dāng)待檢抗原被考慮是存在(cnzi)細(xì)胞內(nèi)，而抗體是大分子的時候，抗體就很難通過細(xì)胞的質(zhì)膜順利達(dá)到接觸抗原。 共二百零四頁 因此，對涂片、組織培養(yǎng)標(biāo)本、細(xì)胞懸浮液的材料等細(xì)胞內(nèi)抗原(kngyun)，必須使細(xì)胞膜易于為大分子抗體所

19、透過，以利于染色。共二百零四頁 采取的辦法： 用凈化劑即表面活性劑三硝基甲苯(ji bn)（Triton）X100溶解于PBS中的0.21%液體，例如浸洗組織切片或涂片。共二百零四頁 標(biāo)記酶的要求 凡對抗體無毒性又具有高催化(cu hu)效率的酶，理論上均可標(biāo)記抗體。 共二百零四頁 1、性質(zhì)較穩(wěn)定；比活性高。 2、該酶應(yīng)當(dāng)是適度純的制品。 3、酶結(jié)合物要穩(wěn)定，便于觀察和保存實驗結(jié)果。當(dāng)該酶與其它分子（如抗體）交聯(lián)后，必須繼續(xù)(jx)保留著它的活性部位和催化能力。 共二百零四頁 4、被檢組織內(nèi)最好(zu ho)沒有底物有關(guān)的酶作為內(nèi)源性組分存在。 共二百零四頁 5、酶的相應(yīng)底物易于(yy)制備和

20、保存，價格低廉，酶分子量不能太大。 共二百零四頁 目前已純化的數(shù)百種酶中，要完全能符合上述要求(yoqi)是很困難的，只能基本符合。 共二百零四頁 常用(chn yn)于標(biāo)記的酶 1、 辣根過氧化物酶 2、堿性磷酸酶 3、酸性磷酸酶 4、葡萄糖氧化酶。 共二百零四頁 5、D半乳糖苷酶 6、葡萄糖淀粉酶。 7、乙酰膽堿脂酶 8、蘋果酸脫氫酶 9、溶菌酶 10、6磷酸(ln sun)葡萄糖脫氫酶 共二百零四頁 在免疫酶技術(shù)中，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶的應(yīng)用(yngyng)比較廣泛。最近國外報道應(yīng)用(yngyng)葡萄糖氧化酶進(jìn)行免疫組織化學(xué)的雙重染色。 共二百零四頁辣根過氧化物酶標(biāo)記的產(chǎn)物顯色

21、原理(yunl)：HRP+H2O2 HRP+H2O2供氫體（電子供體） HRP+H2O2供氫體（氧化型）共二百零四頁共二百零四頁DAB(Diaminobenzidine)顯色液DAB即3,3-二氨基(nj)苯聯(lián)胺試劑：DAB 50mg PBS(0.01mol PH7.2)100ml 30%雙氧水 30-40微升 共二百零四頁免疫酶組織化學(xué)染色1直 接 法用酶標(biāo)記的特異性抗體直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原結(jié)合，再與酶的底物作用產(chǎn)生有色的產(chǎn)物，沉積在抗原-抗體反應(yīng)部位，即可對抗原進(jìn)行定性、定位及定量(dngling)研究。 共二百零四頁直接法簡便、快速、特異性強(qiáng)，非特異性背景反應(yīng)低。常用于檢查腎組織(zz

22、h)活檢標(biāo)本中的IgG、IgA、IgM、C3和C4等免疫復(fù)合物成分，以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡和其他結(jié)締組織疾病、皮膚疾病的檢查，但必要時需做間接法對照。 共二百零四頁操作步驟: (1)石蠟切片脫蠟至水。 (2)根據(jù)每一種抗體的要求，對組織抗原進(jìn) 行相應(yīng)的修復(fù)(xif)。 (3)每張切片加1滴或50l過氧化物酶阻斷 溶液(3%H2O2)，以阻斷內(nèi)源性過氧化物 酶的活性，室溫下孵育10分鐘。 共二百零四頁 (4)PBS沖洗33min。 (5)甩去PBS液，每張切片(qi pin)加1滴或50l 的非免疫性動物血清，室溫下孵育10 分鐘。 (6)甩去血清，每張切片滴加50l酶標(biāo) 抗體于切片上，3730mi

23、n或室溫1h。 (7) PBS沖洗33min。 共二百零四頁 (8)甩去PBS液，每張切片加2滴或100l新鮮配 制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3-10分鐘， 陽性顯色為棕色或紅色。 (9)自來水沖洗，蘇木素復(fù)染。 (10)如果用DAB顯色，則切片經(jīng)過梯度酒精脫水干 燥，(二甲苯透明)，中性(zhngxng)樹膠封固；如果用 AEC顯色，則切片不能經(jīng)酒精脫水，而直接用 水性封片劑封片。 共二百零四頁2間接法先用未標(biāo)記的特異性抗體(一抗)與標(biāo)本中相應(yīng)抗原反應(yīng)，再用抗特異性抗體的酶標(biāo)記抗體與結(jié)合在抗原上的一抗反應(yīng)。該法的優(yōu)點(yudin)是用一種酶標(biāo)記抗體就可與多種一抗配合探測多種抗原，因此

24、廣泛應(yīng)用于自身抗體、癌胚抗原、病毒、細(xì)菌、寄生蟲檢查。 共二百零四頁操作步驟: (1)石蠟切片脫蠟至水。 (2)根據(jù)每一種抗體的要求，對組織抗原進(jìn) 行相應(yīng)的修復(fù)。 (3)每張切片加1滴或50l過氧化物酶阻斷 溶液(3%H2O2)，以阻斷內(nèi)源性過氧化物 酶的活性，室溫(sh wn)下孵育10分鐘。 共二百零四頁 (4)PBS沖洗33min。 (5)甩去PBS液，每張切片加1滴或50l的非免 疫性動物血清，室溫下孵育10分鐘。 (6)甩去血清，每張切片加1滴或50l的第一 抗體，室溫下孵育60分鐘或4過夜，建議(jiny) 參閱每種抗體的說明書。 (7)PBS沖洗33min。 共二百零四頁 (8)

25、 每張切片滴加1滴或50lHRP標(biāo)記的二 抗，37 30min或室溫60min。 (9) PBS沖洗33min。（10）甩去PBS液，每張切片加2滴或100l 新鮮配制的DAB或AEC溶液(rngy)，顯微鏡下觀 察310分鐘，陽性顯色為棕色或紅色。 共二百零四頁 （11）自來水沖洗，蘇木素復(fù)染。 （12）如果用DAB顯色，則切片(qi pin)經(jīng)過梯度 酒精脫水干燥，（二甲苯透明）， 中性樹膠封固；如果用AEC顯色， 則切片不能經(jīng)酒精脫水，而直接用 水性封片劑封片。 共二百零四頁親和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 親和細(xì)胞化學(xué)（affinity cytochemistry）是利用兩種物質(zhì)之間的高度親和能力

26、而互相結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)。免疫細(xì)胞化學(xué)與親和細(xì)胞化學(xué)相互結(jié)合，提高了親和細(xì)胞化學(xué)的定位專一性和免疫細(xì)胞化學(xué)的靈敏度，減少(jinsho)了非特異性反應(yīng)，兩者合稱為親和免疫細(xì)胞化學(xué)（affinity immunocytochemistry）。共二百零四頁早期發(fā)現(xiàn)的有高度親和能力的物質(zhì)是卵白素-生物素，生物素（biotin）即維生素H，卵白素（avidin）現(xiàn)統(tǒng)稱抗生物素，具有4個與維生素H親和力極的結(jié)合點，它們之間的親和力比抗原(kngyun)抗體的親和力高100萬倍，既能牢固結(jié)合又不影響彼此生物活性及與其結(jié)合物的活性，這一系統(tǒng)現(xiàn)被稱為抗生物素-生物素系統(tǒng)。 共二百零四頁根據(jù)上述原理建立(jinl)

27、的技術(shù)方法有抗生物素-生物素-過氧化物酶復(fù)合法（avidin-biotin-peroxidase comples technique，ABC法）、橋抗生物素-生物素法（bridged avidin-Biotin technique，BRAB法）、標(biāo)記生物素-抗生物素（labelled avidin-Biotin technique，LAB法）、葡萄球菌蛋白A-辣根過氧化物酶法（stephylococcal protein A，SPA法）、鏈霉親合素蛋白-過氧化物酶連接法（streptavidin-peroxidase complex，SP法）鏈霉親合素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法（Stre

28、pt Avidin-Biotin Complex SABC法）等。 共二百零四頁目前被發(fā)現(xiàn)的親和素物質(zhì)還有凝集素（lectin）與糖結(jié)合物，激素與受體，脂質(zhì)與受體，多聚合物與HRP抗體，以及維生素與其作用(zuyng)部位等。 共二百零四頁1ABC染色方法 抗生物素-生物素-過氧化酶復(fù)合物技術(shù)（avidin biotin-peroxidase complex technique，簡稱ABC技術(shù)）。ABC法是許世明于1981年在BRAB法和LAB法的基礎(chǔ)上改良的，其特點是利用抗生物素分別連接生物素標(biāo)記(bioj)的第二抗體和生物素標(biāo)記(bioj)的酶。 共二百零四頁與LAB法和BRAB法不同的是

29、第一抗體不為標(biāo)記物所標(biāo)記，生物素標(biāo)記的第二抗體與ABC復(fù)合物相連接。復(fù)合物是將過氧化酶結(jié)合在生物素上、再將生物素-過氧化酶連接物與過量的抗生物素蛋白反應(yīng)而制備的，最后進(jìn)行顯色(xin s)反應(yīng)定位。 共二百零四頁（一）親和素-生物素-過氧化物(u yn hu w)酶（Avidin Biotin-peroxidase Complex，ABC）技術(shù) 1基本原理共二百零四頁操作步驟：（1）石蠟切片脫蠟至水。（2）根據(jù)每一種抗體的要求，對組織(zzh) 抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。（3）每張切片加1滴或50l過氧化物 酶阻斷溶液（3%H2O2），以阻斷內(nèi) 源性過氧化物酶的活性，室溫下 孵育10分鐘。 共二百零

30、四頁 （4）PBS沖洗33min。 （5）甩去PBS液，每張切片加1滴或50l 的非免疫性動物(dngw)血清，室溫下孵育10 分鐘。 （6）甩去血清，每張切片加1滴或50l的 第一抗體，室溫下孵育60分鐘或4 過夜，建議參閱每種抗體的說明書。 （7）PBS沖洗35min。 共二百零四頁 （8） 甩去PBS液，每張切片加1滴或50l 生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫(sh wn)下孵育 30分鐘。 （9） PBS沖洗33min。 （10）甩去PBS液，每張切片加1滴或50l ABC復(fù)合物，室溫下孵育30分鐘。 （11）PBS沖洗33min。 共二百零四頁（12）甩去PBS液，每張切片加2滴或100l

31、新鮮 配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3 10分鐘，陽性顯色為棕色或紅色。（13）自來水沖洗，蘇木素復(fù)染。（14）如果用DAB顯色，則切片經(jīng)過梯度酒精脫 水干燥，（二甲苯透明）中性樹膠(shjio)封固； 如果用AEC顯色，則切片不能經(jīng)酒精脫水， 而直接用水性封片劑封片。 共二百零四頁ABC法有以下(yxi)優(yōu)點 共二百零四頁 敏感性高：抗生物素同生物素結(jié)合有四個位點，一部分同生物素化過氧化物酶結(jié)合，另一方面同生物標(biāo)記的抗體結(jié)合。在ABC反應(yīng)中，抗生物素作為橋邊接于生物素標(biāo)記的酶和生物素標(biāo)記的抗體之間，而生物素標(biāo)記的過氧化物酶分子又可作為橋連接于抗生物素分子之間，于是形成了一個(y )含

32、有3個以上過氧化物酶分子的網(wǎng)格狀復(fù)合物，敏感性極大提高。 共二百零四頁特異性強(qiáng)，背景淡：由于敏感性高，第一抗體和第二抗體都可被高度稀釋，減少了非特異性染色。方法簡便，節(jié)約時間：由于ABC法敏感，操作(cozu)的抗原抗體反應(yīng)的時間可縮短為2h左右。由于生物素與抗生物素具有多種示蹤物結(jié)合的能力，可用于雙重或多重免疫染色。 共二百零四頁4SP染色(rns)方法 共二百零四頁鏈霉菌抗生物素蛋白（SA）是從鏈霉菌中分離出的蛋白質(zhì)，分子量為60KD，穿透(chun tu)組織的能力比ABC，復(fù)合物大，反應(yīng)速度快。它含有四個亞基，每個亞基都具有與生物素（Biotin）聯(lián)接的部位，且二者間有極強(qiáng)的親和力，S

33、A的等電點接近于6.5，近中性，而卵白素（Avidin）為10。 共二百零四頁因此，SA幾乎不與組織中的內(nèi)源性凝集樣物質(zhì)發(fā)生非特異性結(jié)合，使用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶放大系統(tǒng)，即可產(chǎn)生低背景、高放大效果，經(jīng)過多年來的實驗應(yīng)用，證明(zhngmng)SP放大系統(tǒng)比傳統(tǒng)的ABC法更為簡單，敏感、特異。 共二百零四頁目前，免疫組化染色超敏試劑盒，它是根據(jù)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶（Streptavidin-Peroxidase，SP ）連接系統(tǒng)設(shè)計的，S-P免疫組化染色試劑盒采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物(u yn hu w)酶及底物色素混合液來測定細(xì)胞和組織中的抗

34、原。 共二百零四頁（三） S-P （ streptavidin peroxidase）技術(shù)(jsh)1、基本原理共二百零四頁操作步驟：（1）石蠟切片脫蠟至水。（2）根據(jù)每一種抗體的要求，對組織抗原進(jìn)行 相應(yīng)的修復(fù)。（3）每張切片加1滴或50l過氧化物酶阻斷(z dun)溶 液（3%H2O2），以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶 的活性，室溫下孵育10分鐘。 共二百零四頁（4）PBS沖洗33min。（5）甩去PBS液，每張切片加1滴或50l 的非免疫性動物血清(xuqng)，室溫下孵育 10分鐘。（6）甩去血清，每張切片加1滴或50l 的第一抗體，室溫下孵育60分鐘或 4過夜，建議參閱每種抗體的說明 書。共

35、二百零四頁（7） PBS沖洗35min。（8） 甩去PBS液，每張切片加1滴或50l生物 素標(biāo)記的第二抗體(kngt)，室溫下孵育20分鐘。（9） PBS沖洗35min。（10）甩去PBS液，每張切片加1 滴或50l鏈霉 菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫下孵 育20分鐘。 共二百零四頁(11)PBS沖洗35min。(12)甩去PBS液，每張切片加2滴或100l 新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下 觀察3-10分鐘，陽性顯色為棕色或紅色(hngs)。(13)自來水沖洗，蘇木素復(fù)染。 共二百零四頁(14)如果用DAB顯色，則切片經(jīng)過梯度酒精(jijng)脫水干燥，(二甲苯透明)，中性樹膠封固；

36、如果用AEC顯色，則切片不能經(jīng)酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。 共二百零四頁5Envision染色(rns)方法 共二百零四頁Envision(Enharnced labeled-polymer system)技術(shù)是DAKO公司最近(zujn)推出的新方法。它將辣根過氧化物酶標(biāo)記的多聚合物再標(biāo)記在抗兔或抗鼠的IgG上，并螯合形成一個巨大復(fù)合物。每1mol/L復(fù)合物中，約含70mol/L的HRP和10mol/L抗兔和抗鼠IgG。因此，每1個復(fù)合物中的HRP絕對數(shù)量顯著高于ABC和SP復(fù)合物，其敏感性高于目前其他幾種酶標(biāo)記方法。 共二百零四頁Envision法基本原理是，在切片上加上一抗以后第二

37、抗體標(biāo)記多聚螯合物酶(AP或HRP)的復(fù)合物與一抗體結(jié)合(jih)，在多聚螯合物上有大量的HRP分子，比其他傳統(tǒng)方法使抗原有了顯著的放大，比ABC、LSAB、SP高出幾十倍，因多聚物是人體內(nèi)不存在，無非特異性染色，背景非常干凈。 共二百零四頁鑒于Envision復(fù)合物內(nèi)含多個第二抗體分子，故有效增強(qiáng)了該復(fù)合物與特異性抗體的結(jié)合(jih)機(jī)會和能力。由于此技術(shù)將酶聚合物直接標(biāo)記第二抗體，因此，整個染色方法只需兩步即可完成，而其他方法則需三步，從而使染色時間大幅度縮短。 共二百零四頁共二百零四頁操作步驟：(1)石蠟切片脫蠟至水。(2)根據(jù)每一種抗體的要求，對組織抗原(kngyun) 進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)

38、。(3)每張切片加1滴或50l過氧化物酶阻 斷溶液(3%H2O2)，以阻斷內(nèi)源性過氧化 物酶的活性，室溫下孵育10分鐘。 共二百零四頁(4)PBS沖洗33min。(5)甩去PBS液，每張切片加1 滴或50l 的非免疫性動物血清(xuqng)，室溫下孵育10 分鐘。(6)甩去血清，每張切片加1 滴或50l的 第一抗體，室溫下孵育60分鐘或4過 夜，建議參閱每種抗體的說明書。(7)PBS沖洗35min。 共二百零四頁(8) 甩去PBS液，每張切片加1滴或50l 的第二抗體標(biāo)記多聚螯合物-酶復(fù)合 物，室溫下孵育(f y)30分鐘。(9) PBS沖洗35min。(10)甩去PBS液，每張切片加2滴或1

39、00l 新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下 觀察3-10分鐘，陽性顯色為棕色或紅色。 共二百零四頁(11)自來水沖洗，蘇木素復(fù)染。 (12) 如果用DAB顯色，則切片經(jīng)過梯度 酒精脫水干燥，(二甲苯透明(tumng)，中 性樹膠封固；如果用AEC顯色，則 切片不能經(jīng)酒精脫水，而直接用水 性封片劑封片。 共二百零四頁6Ramos染色(rns)方法 共二百零四頁Ramos法(rapid microwave one step method)是一種快速免疫組化一步法，它利用微波熱效應(yīng)(xioyng)和化學(xué)效應(yīng)(xioyng)，與DAKO公司Epos酶標(biāo)記特異性抗體相結(jié)合，以加速其抗原抗體結(jié)合反應(yīng)為

40、其特點，這是目前國內(nèi)外最快速而較完美的新方法。該法的特點是快速、簡便、特異。靈敏。質(zhì)量穩(wěn)定及結(jié)果可靠。 共二百零四頁【特點】 (1) 快速：本法整個標(biāo)記程序在10min內(nèi)即可完成。 (2)敏感性高：本法不同于以往(ywng)酶標(biāo)直接法。它先將HRP標(biāo)記在一個惰性的聚合物上，形成一個酶標(biāo)記復(fù)合物(每一個mole復(fù)合物中含70mole HRP)，再用酶標(biāo)復(fù)合物標(biāo)記各種特異性抗體，最后形成HRP-聚合物-特異性抗體復(fù)合物。由于酶標(biāo)記抗體中HRP絕對數(shù)量多，故其敏感性較ABC和LSAB高數(shù)倍。 共二百零四頁(3)特異性強(qiáng)，無背景著色：由于該法為一步法，無內(nèi)源性生物素的干擾，加之應(yīng)用了微波輻射技術(shù)(js

41、h)，故抗原抗體反應(yīng)時間很短，所以該法基本無背景著色。(4)成本低：由于本法采用蓋玻片法，每張切片只需25l酶標(biāo)抗體，因此降低了成本，而且無邊緣效應(yīng)，染色更均勻。(5)無脫片現(xiàn)象發(fā)生。(6)該法適用于石蠟。冷凍和細(xì)胞涂片。 共二百零四頁操作步驟:(1)組織經(jīng)中性甲醛常規(guī)固定、脫水。石 蠟包埋切片。(2)組織切片常規(guī)脫蠟至水。(3)微波抗原(kngyun)修復(fù)，切片檸檬酸緩沖液內(nèi) (250ml)，置微波爐中功率(350W)輻射 約120s，溫度控制在80內(nèi)，冷卻至 室溫。 共二百零四頁(4)PBS洗滌，吸干切片周圍(zhuwi)多余的水分。(5)每張切片加25l聚合物-酶標(biāo)記抗體， 加蓋玻片(2

42、2mm22mm)，置微波爐中 功率輻射60s左右，靜置35min。(6)PBS洗2次，每次2min。 共二百零四頁(7)DAB-H2O2顯色510min，或置微波低中功 率(280W)輻射40s左右。(8)自來水沖洗，蘇木素復(fù)染。(9)如果用DAB顯色，則切片經(jīng)過梯度酒精脫 水干燥，(二甲苯透明(tumng)，中性樹膠封固； 如果用AEC顯色，則切片不能經(jīng)酒精脫水， 而直接用水性封片劑封片。 共二百零四頁7CSA染色(rns)方法 共二百零四頁CSA(catalyzed signal amlplification)法1989年首次由Bobrow等報道應(yīng)用于免疫酶聯(lián)吸附試驗和蛋白電泳轉(zhuǎn)移膜的檢測

43、，1992年由Adams等將該方法應(yīng)用在免疫組織化學(xué)的檢測中，1995年Kerstens等又將該方法應(yīng)用到原位雜交技術(shù)領(lǐng)域(ln y)，該法比ABC、SP法具有更高的敏感性和穩(wěn)定性等優(yōu)點，CSA在原位雜交檢測HPV、p16、HBV、Bcl-2、nm23、P-qg等DNA和RNA的檢測都已獲得滿意的結(jié)果。 共二百零四頁CSA原理是，特異性一抗和組織細(xì)胞內(nèi)抗原結(jié)合后，滴加生物素化二抗，在鏈霉親和素上的HRP催化下，立刻在抗原抗體結(jié)合部位形成一個共價結(jié)合位點，這一反應(yīng)使大量的生物素沉積在信號位點上，然后加上生物素化的酪胺，當(dāng)再一次滴加streptavidin-HRP復(fù)合物時，因在信號上存在許多的生物

44、素，而使酶分子復(fù)合物越積越多，通過底物使原始信號得到幾何級的放大(如原始信號還得不到應(yīng)有的放大，可使上述(shngsh)循環(huán)再來一次)。敏感性較常規(guī)SP法要高近1000倍。 共二百零四頁操作步驟：(1)石蠟切片脫蠟至水。(2)根據(jù)(gnj)每一種抗體的要求，對組織抗原 進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。(3)每張切片加1滴或50l過氧化物酶阻 斷溶液(3%H2O2)，以阻斷內(nèi)源性過氧化 物酶的活性，室溫下孵育10分鐘。(4)PBS沖洗33min。 共二百零四頁(5)甩去PBS液，每張切片加1滴或50l的 非免疫性動物血清，室溫下孵育10分鐘。(6)甩去血清，每張切片加1滴或50l的第 一抗體，室溫下孵育60分鐘

45、或4過夜， 建議參閱每種抗體的說明書。(7) PBS沖洗35min。(8)甩去PBS液，每張切片加1滴或50l生 物素標(biāo)記(bioj)的第二抗體，室溫下孵育30 分鐘。共二百零四頁(9) PBS沖洗33min。(10)甩去PBS液，每張切片加1滴或50l鏈 霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫 下孵育(f y)30分鐘。(11)PBS沖洗33minj。(12)生物素化酪胺基團(tuán)分子3720min； PBS洗35min。 共二百零四頁(13)甩去PBS液，每張切片(qi pin)加1滴或50l鏈霉抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育30分鐘。(14)甩去PBS液，每張切片加2滴或100l新鮮配制的D

46、AB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3-10分鐘，陽性顯色為棕色或紅色。 共二百零四頁(15)自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1%HCl分化，0.1%氨水或PBS沖洗返藍(lán)。(16)如果用DAB顯色，則切片經(jīng)過梯度酒精脫水(tu shu)干燥，(二甲苯透明)，中性樹膠封固；如果用AEC顯色，則切片不能經(jīng)酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。 共二百零四頁 結(jié)果(ji gu)判斷標(biāo)準(zhǔn) 1、每批染色都要有特異慢性對照和陰性對照為基礎(chǔ)，都能對染色結(jié)果做判斷。 共二百零四頁 2、陽性表達(dá)必須在細(xì)胞和組織特定的抗原部位才能視為陽性。 3、陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)，即陰性結(jié)果無判斷(pndun)意義；陽性結(jié)果有強(qiáng)弱、多

47、少之分，哪怕是一個細(xì)胞陽性，只要是在抗原所在部位，也有診斷意義。 共二百零四頁 4、當(dāng)免疫組化結(jié)果與HE切片診斷有矛盾(modn)時，以HE切片診斷為準(zhǔn)。 5、應(yīng)用“反證法”確保免疫組化在診斷病理中的準(zhǔn)確性。 共二百零四頁 6、避免假陰性和假陽性的發(fā)生。造成判斷失誤的主要原因，假陽性；標(biāo)本固定不佳，標(biāo)本選擇不恰當(dāng)，標(biāo)本干燥，抗原擴(kuò)散(kusn)；抗體的交叉反應(yīng)，抗體的吸附，內(nèi)源性，外源性，假陰性；標(biāo)本脫蠟不充分，抗原性的變化和破壞，抗原性的變化和破壞，抗原的隱匿性，抗體的失活。 共二百零四頁免疫組化應(yīng)用的范圍(fnwi) 在常規(guī)病理診斷中應(yīng)用免疫組化主要有以下8個方面。 共二百零四頁 1、對腫

48、瘤(zhngli)的組織起源進(jìn)行鑒別診斷，如上皮性、間葉性、肌源性、血管源性、淋巴細(xì)胞源性等。 共二百零四頁 2、對腫瘤的良惡性進(jìn)行綜合判斷，如Ki-67、PCNA等抗體對腫瘤增生(zngshng)程度的判斷，CEA、AFP等對癌分化程度的判斷等。共二百零四頁 3、發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶，如對淋巴結(jié)內(nèi)極少轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的查找，對骨髓內(nèi)個別(gbi)轉(zhuǎn)移性瘤細(xì)胞的認(rèn)定等。 共二百零四頁 4、激素受體的檢測以指導(dǎo)臨床治療(zhlio)，目前主要是乳腺癌雌、孕激素的檢測。 5、激素類細(xì)胞的定性和定位，以進(jìn)一步明顯內(nèi)分泌細(xì)胞的類型和功能狀態(tài)。 共二百零四頁 6、指導(dǎo)腫瘤分期， 可通過免疫組化對基底膜、血管浸潤

49、得到清楚的顯示而獲得準(zhǔn)確(zhnqu)的分期。 7、指導(dǎo)腫瘤預(yù)后的判斷，如目前開展的瘤基因的免疫組化檢測，瘤細(xì)胞抗藥性的檢測等。 共二百零四頁 8、免疫性疾病的輔助診斷，如腎小球腎炎、某些皮膚疾病等組織內(nèi)免疫球蛋白、補(bǔ)體、復(fù)合物的檢測。其中應(yīng)用(yngyng)最多的還是腫瘤鑒別診斷。 共二百零四頁共二百零四頁共二百零四頁共二百零四頁共二百零四頁共二百零四頁共二百零四頁共二百零四頁共二百零四頁共二百零四頁共二百零四頁共二百零四頁共二百零四頁共二百零四頁MAB-0023CD30福爾馬林固定(gdng)，石蠟包埋。何杰金氏淋巴瘤，CD30/KI-1陽性定位胞膜，UltraSensitiveTM SP

50、（Mouse）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。SP X 400共二百零四頁MAB-0023CD30福爾馬林固定，石蠟包埋。何杰金氏淋巴瘤，CD30/KI-1陽性定位(dngwi)胞膜多核瘤巨細(xì)胞陽性，UltraSensitiveTMSP（Mouse）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。SP X 400共二百零四頁MAB-0198Cerbb-2福爾馬林固定，石蠟包埋。乳腺導(dǎo)管癌，Cerbb-2(M)陽性(yngxng)定位胞漿和胞膜，UltraSensitiveTM SP（PAN）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。SP X 100共二百零四頁RAB-0046Cerbb-2福爾馬林(f r m ln)固

51、定，石蠟包埋。乳腺癌，Cerbb-2陽性定位胞漿和胞膜，UltraSensitiveTM SP（PAN）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。SP X 400共二百零四頁RAB-0046Cerbb-2福爾馬林固定，石蠟包埋。乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，Cerbb-2陽性定位胞漿和胞膜， UltraSensitiveTM SP（PAN）試劑盒，DAB顯色(xin s)，蘇木素復(fù)染。SP X 200共二百零四頁RAB-0046Cerbb-2福爾馬林固定，石蠟包埋。乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，Cerbb-2陽性(yngxng)定位胞漿和胞膜， UltraSensitiveTM SP（Mouse）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染

52、。SP X 400共二百零四頁MAB-0049CK(Pan)福爾馬林固定，石蠟(sh l)包埋。食道鱗癌，CK（PAN）陽性定位胞漿， UltraSensitiveTM SP（PAN）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。SP X 200共二百零四頁RAB-0050CK(PAN)福爾馬林(f r m ln)固定，石蠟包埋。食道鱗癌，CK（PAN）陽性定位胞漿， UltraSensitiveTM SP（PAN）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。SP X 100共二百零四頁MAB-0041CD68福爾馬林固定，石蠟包埋。惡性纖維組織細(xì)胞瘤，CD68陽性定位巨噬細(xì)胞胞漿，UltraSensitiveTMSP

53、（PAN）試劑盒，DAB顯色(xin s)，蘇木素復(fù)染。SPX 200共二百零四頁RAB-0048CgA福爾馬林固定，石蠟包埋。肺神經(jīng)內(nèi)分泌(fnm)癌，嗜鉻素A陽性定位胞漿，UltraSensitiveTM SP（PAN）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。SP X 200共二百零四頁MAB-0182CK18福爾馬林固定(gdng)，石蠟包埋。結(jié)腸腺癌，CK18陽性定位胞漿， UltraSensitiveTM SP（Mouse）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。SP X 200共二百零四頁MAB-0062ER福爾馬林固定(gdng)，石蠟包埋。乳癌，ER陽性定位胞核， UltraSensitive

54、TMSP（PAN）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。SP X 400共二百零四頁RAB-0070Factor 福爾馬林固定，石蠟包埋。乳腺導(dǎo)管癌，F(xiàn)actor 陽性(yngxng)定位胞漿， UltraSensitiveTM SP（PAN）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。SPX 100共二百零四頁MAB-0088GST-福爾馬林固定，石蠟包埋。食道(shdo)鱗癌，GST-陽性定位胞漿， UltraSensitiveTM SP（Mouse）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。SP X 200共二百零四頁MAB-0100Insulin福爾馬林(f r m ln)固定，石蠟包埋。正常胰腺，Insulin

55、陽性定位胰島-細(xì)胞胞漿，UltraSensitiveTM SP（PAN）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。SP X 100共二百零四頁MAB-0100Insulin福爾馬林固定(gdng)，石蠟包埋。正常胰腺，Insulin陽性定位胰島-細(xì)胞胞漿，UltraSensitiveTM SP（PAN）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。SP X 200共二百零四頁MAB-0129Ki-67福爾馬林固定(gdng)，石蠟包埋。乳腺癌，Ki-67陽性定位胞核， UltraSensitiveTM SP（Mouse）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。SP X 400共二百零四頁MAB-0129Ki-67福爾馬林固定

56、，石蠟(sh l)包埋。乳腺癌，Ki-67陽性定位胞核， UltraSensitiveTM SP（PAN）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。SP X 200共二百零四頁MAB-0098Melanoma福爾馬林固定，石蠟(sh l)包埋。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤，Melanoma陽性定位胞漿， UltraSensitiveTM SP（Mouse）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。SP X 200共二百零四頁MAB-0269Hsp60福爾馬林固定，石蠟包埋。結(jié)腸腺癌，Hsp60陽性定位胞漿， UltraSensitiveTM SP（PAN）試劑盒，DAB顯色(xin s)，蘇木素復(fù)染。SPX 200共

57、二百零四頁MAB-0245MMP-9福爾馬林固定，石蠟包埋。乳腺癌，陽性(yngxng)定位胞漿，UltraSensitiveTMSP（PAN）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。SPX 200共二百零四頁MAB-0124Myosin福爾馬林固定，石蠟包埋。橫紋肌肉瘤，Myosin陽性(yngxng)定位胞漿， UltraSensitiveTM SP（PAN）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。SPX 100共二百零四頁MAB-0145PCNA福爾馬林固定，石蠟包埋。胃腺癌，PCNA陽性(yngxng)定位胞核， UltraSensitiveTM SP（PAN）試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。SPX 100共二百零四頁MAB-0224P-glycoprotein福爾馬林固定(gdng)，石蠟包埋。胃腺癌，Pgp 陽性定位胞漿， UltraSensitiveTM SP（Mouse）試劑盒，DAB顯色，蘇木素