組織固定液的使用-供參考

1、談?wù)劰潭ㄒ旱氖褂米髡? HYPERLINK /bbs/space.php?uid=2066250 t _blank liza3 HYPERLINK /bbs/space.php?uid=2066250 t _blank (站內(nèi)聯(lián)系TA) 發(fā)布: 2013-01-11當(dāng)前，應(yīng)用于固定試劑的種類較多，它們對于固定不同的組織成分起著不同的作用，因此我們在使用時應(yīng)該了解不同固定劑的效能，才能合理的固定組織。根據(jù)Bencroft的分類法，將不同的固定劑分為四種類型：類：醛類，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。類：氧化劑類，四氧化鋨（奧酸），高錳酸鉀，重鉻酸鉀等。類：蛋白變性類，甲醇，乙醇

2、，醋酸等。類：其他，氯化汞，苦味酸等。上述四種類型的固定劑，最常使用的是甲醛，其余的也在其它病理技術(shù)方面中用到。下面根據(jù)使用的需要，將著重介紹幾種常用的固定劑。（1）甲醛甲醛商品名為福爾馬林，一般市售的含甲醛3740%，由甲醛氣體飽和于水而成，比重為1.12。它也可以穩(wěn)定的固體形式存在，它的成分為高分子量的聚合體，稱為多聚甲醛。甲醛溶液較難純化，在每批市售商品中，都含有不少的雜質(zhì)如甲醇，這種在組織化學(xué)方法當(dāng)中，能使酶鈍化，影響其反應(yīng)。甲酸，它可使固定液變酸，在陳列標(biāo)本或長時間固定的組織，由于酸的作用，往往細胞核染色欠佳。甲醛有效固定作用的要點是，在蛋白質(zhì)末端基團之間形成交聯(lián)鏈。參與甲醛固定蛋白

3、質(zhì)的基團，主要為氨基，亞氨基及酰氨基，肽，胍基，羥基，SH和芳香環(huán)。甲醛與組織蛋白類的反應(yīng)是多樣和復(fù)雜的，因為它能和多種不同的功能基團結(jié)合，在多數(shù)情況下在其間形成橋鍵。甲醛有這種交聯(lián)的功能，也是它的缺點，在用甲醛固定過的組織中，需要做免疫組化的，往往提倡用酶消化或熱抗原修復(fù)法來使蛋白與甲醛交聯(lián)的醛鍵斷裂開，以利于后來的染色。甲醛可配成簡單的或混合的固定液，最簡單和最容易掌握的方法，就是取10ml甲醛液，加水90ml，這就是10%的福爾馬林.當(dāng)然,現(xiàn)在使用的固定液要求較為嚴(yán)格些,最好是使用緩沖福爾馬林固定液,這將有利于后來的免疫組化染色的需要.從組織學(xué)的觀點來說,甲醛是一種良好的固定劑,它有很多

4、的優(yōu)點:1. 組織收縮較少,損傷少,保存固有物質(zhì)好.2. 固定均勻,穿透力強.3. 能使組織硬化,增進組織彈性,有利于切片.4. 能保存脂肪及脂類物質(zhì).5. 成本較低.雖然甲醛有上述的優(yōu)點,但這都是相對而言,任何物質(zhì)都不可能十全十美的,它也有許多缺點:1. 雜質(zhì)含量較多,如甲醇,可鈍化酶類,影響反應(yīng).2. 含有微量甲酸,導(dǎo)致固定液酸變,影響染色.3. 可產(chǎn)生福爾馬林色素,影響觀察.4. 不能固定尿酸和糖類物質(zhì).5. 容易揮發(fā),污染環(huán)境,可導(dǎo)致標(biāo)本干涸.6. 可長期存在于固定過的組織上.有人做過實驗,組織用甲醛固定后在流水中沖洗5小時后,仍留有相當(dāng)多的甲醛與蛋白質(zhì)相結(jié)合,但需要經(jīng)過長時間的流水沖

5、洗(24天的沖洗)方能除去.可見存在于組織上的甲醛是不可能除去的.因為臨床活檢不可能有這么長的時間來沖洗組織.因此要特別指出的是,在其后的各種技術(shù)操作中,要特別注意到甲醛的存在,必須要想辦法除去它,否則將會給各種染色造成影響,甚至導(dǎo)致失敗。應(yīng)用甲醛,可以配成許多種固定液:1. 10%緩沖福爾馬林固定液甲醛 100ml蒸餾水 900mlNaH2PO44gNa2HPO4 6.5g該固定液是當(dāng)今流行的固定液,因它對組織固定較好,損傷較少,因?qū)ζ浜蟮母鞣矫娴难芯慷驾^好,尤其是對免疫組化的染色.2、10%福爾馬林固定液甲醛100 ml自來水900ml這是一種最簡單的固定液，適合于邊遠地區(qū)攜帶的固定液，但

6、由于它的單一性，因此，只要有條件的單位都不要求使用這種固定液。3、10%福爾馬林鹽固定液甲醛 100ml自來水 900mlNacl 9克先將Nacl溶于水，再加入甲醛。這也是一種較為簡單的固定液，但由于加入Nacl，它是一種重金屬鹽物質(zhì)，加入了它可促進和改善染色，增加染色的強度。4、Bouin氏固定液苦味酸飽和水溶液 75ml甲醛 2 ml冰醋酸 5 ml該固定液中的冰醋酸，對膠原纖維等組織有膨脹作用。而甲醛對組織有收縮作用。兩種試劑的混合使用，用以抵消彼此間的副作用。使組織固定達到優(yōu)良的固定水平。5醛糖鈣固定液甲醛100ml蔗糖300ml乙酸鈣20g蒸鎦水90ml先將蔗糖和乙酸鈣溶于蒸鎦水，

7、后加入甲醛。該固定液對于做酶的組織化學(xué)的研究效果較好，組織固定后，做冰凍切片，再給予顯示。當(dāng)前國內(nèi)外基本上都還是要用甲醛來固定組織。從免疫組織化學(xué)的角度來說，甲醛固定的組織大部分都可以用免疫組化的手段來檢測，據(jù)多人認(rèn)為，它對IgA ，IgM，J鏈，K鏈和鏈的標(biāo)記效果較好，且背景清晰。但美中不足的是：經(jīng)它固定的組織，可與蛋白形成醛交聯(lián)蛋白，這種醛鍵可封閉抗原。固此，在免疫組化實際檢測中，應(yīng)根據(jù)不同的要求和需要，采用酶消化或者其它抗原修復(fù)如微波、高壓等的方法，以便破壞醛鍵重新暴露抗原。（2）酒精：又稱乙醇，為無色透明的液體，沸點是78度，工業(yè)酒精是95%。酒精它有許多優(yōu)點：1、 可保存尿酸結(jié)晶和糖

8、原等物質(zhì)。高濃度的酒精如95%，無水酒精可保存上述兩種物質(zhì)，因它們易溶于水，因此，要證明上述兩種物質(zhì)的存在，就不能用含水的固定液來固定組織。2、 能在任何比例的情況下與水混合，在病理技術(shù)中，酒精是一種十分重要的試劑，它起著關(guān)鍵的作用。如果沒有酒精，將會無法完成必要的工作。如組織的脫水，切片染色前后都離不開酒精，在常規(guī)的工作中，通常都用95%的工業(yè)酒精來配成60%、70%、80%、90%等不同的濃度來使用。3、 可溶解苯類物質(zhì)為染色步驟中的橋梁試劑。常規(guī)活檢等切片上的石蠟必須除去，才能進行染色，能除去石蠟的物質(zhì)有苯及汽油等，常用的有苯類試劑，苯不溶于水，但能溶于酒精，酒精在這里充擔(dān)著除去苯和連接

9、水的作用，為切片入水架起了橋梁，因此稱它為橋梁試劑。4、 能除去切片上的水份，使切片無水化。切片經(jīng)染色后，由于所用的試劑都為水溶液，因此在切片上含有大量的水份，這些水份經(jīng)系列梯度酒精的置換吸附后，到無水酒精中已完全無水，這樣處理對于切片的保存是有好處的，否則，切片將會褪色。5、 可用來保存標(biāo)本。大體標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定后，如為了陳列保存，必須取出沖冼。然后移入75%的酒精中。如果用福爾馬林作陳列標(biāo)本的固定液，則因為福爾馬林含有雜質(zhì)較多，液體容易酸化，時間一長，會逐漸變?yōu)槲ⅫS*色或淡黃*色，影響美觀，影響陳列的效果。6、 可與其它試劑配成多種的混合固定液，有時為了加快固定，常采用酒精和其它試劑來配

10、成混合固定液，這種固定液在固定的同時，兼有對組織脫水的作用。應(yīng)用酒精配成的混合固定液有： Carnoy氏固定液氯仿 300ml冰醋酸 100 ml95%酒精 600 ml該固定液固定組織快速，在固定的同時兼有脫水的作用。溶液中的氯仿和酒精，對組織的收縮較厲害，但應(yīng)用了冰醋酸，這種現(xiàn)象便被中和去。 AF固定液甲醛 100 ml冰醋酸 50 ml95%酒精 850 ml這種固定液的作用與上液有相似之處，但要注意的是，凡使用含有醋酸的固定液，其脫水用具不能使用銅制的脫水盒，因冰醋酸跟銅離子起反應(yīng)，生成醋酸銅，這種物質(zhì)可沉淀于組織間，可破壞組織中的抗原，造成免疫組化檢測的失敗。應(yīng)用時應(yīng)多加注意。酒精也

11、有許多不足之處，它的缺點是：1、 可溶解脂類物質(zhì)，凡要證明組織是否含有脂類和類脂物時，切不能用含有酒精的固定液去固定組織，也不能用石蠟切片，因為酒精可將它們?nèi)芙馊ィ炃衅M織中含有的脂類物質(zhì)，則在組織脫水時被溶解去，只留下脂類或類脂物所占有的空間。2、 對組織收縮較大，不宜作單純固定液。高濃度的酒精，對組織有顯著的收縮作用，造成組織發(fā)硬易脆，難以切片等現(xiàn)象。因此，它不作為單純的固定液。3、 滲透力不強。當(dāng)用酒精固定組織時，組織表面很快就被固定，并形成了一層蛋白膜，這層膜可阻擋固定液向里滲透，造成了中間組織固定不佳的現(xiàn)象。4、 可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，凡經(jīng)酒精固定的組織，核的染色都不好

12、。5、 可脫去切片上已著染的各種顏色，切片經(jīng)染色后，一是必須洗去多余的染液，二是必須脫去切片上的水。在用酒精洗切片時，必須仔細地掌握顯微鏡下觀察，還要掌握酒精的濃度，低濃底的酒精脫色力強，稍不注意，便可脫去切片上大部分的顏色。切片脫水時，要較快地通過低濃度的酒精，以免使已著染的顏色被脫去。6、 價格較貴。從經(jīng)濟學(xué)的角度，應(yīng)用酒精固定組織劃不來，例如：一瓶500ml的甲醛，可配成500ml的固定液，按每例標(biāo)本需要100ml計，可固定50例標(biāo)本，而一瓶 500ml的酒精，即使配成80%酒精，也只能固定6例標(biāo)本，因此，若用酒精固定組織，其價格比用甲醛固定組織的要高8倍。（3） 冰醋酸。冰醋酸為無色透

13、明的液體，易揮發(fā)，氣味大，一打開瓶蓋，整個文章都可聞其味道，純醋酸在17時常為結(jié)晶狀，因稱為冰醋酸，在冬天使用時，可用微波爐進行解凍，再行使用，它的優(yōu)點有：1、 能迅速固定染色質(zhì)，助于染色，用醋酸配成的固定液，其作用快，固定效果均勻，對于染色質(zhì)的固定快，因此，用其作固定的切片染色好，在配其它染色液如明礬蘇木素和伊紅時，常常需加入一定量的醋酸，以促進染色。2、 能使組織尤其是富含纖維的組織膨脹。各種固定液對組織都有收縮的作用，尤其是對富含纖維的組織。而它不但不會使組織收縮，而且還會令許多組織發(fā)生膨脹的作用。根據(jù)這個特點，用它配成許多種不同的混合固定液，以達到固定好，收縮少，易切片，效果好等目的。

14、用它配成的混合固定液有：（1） Zenker氏固定液：重鉻酸鉀 25G升汞 50G蒸餾水 1000ml冰醋酸 50ml先將重鉻酸鉀和升汞溶于水中，尢其是重鉻酸鉀，應(yīng)用熱水或加溫的方法將其溶解，然后過濾貯存于帶蓋的玻璃瓶中，如暴露于空氣中，該溶液將會被慢慢氧化而便顏色加深，導(dǎo)致失效。臨用時，取貯存液950ml，加入50ml的冰醋酸，即可使用。應(yīng)用該固定液固定的組織，一般不要超過24h，取出組織，流水沖冼12小時以上，然后保存于75%-80%的酒精中，在切片染色前，必須用碘除去汞鹽的沉著。應(yīng)用該固定液的組織，細胞核及細胞漿染色十分清晰，特別是要顯示骨骼肌的橫紋時，應(yīng)用本液可獲得滿意的結(jié)果，但由于其

15、含有醋酸，故不能用于保存細胞顆粒，紅細胞及含鐵血黃素。（2） Flemming氏液2%酸水溶液 200ml1%鉻酸水溶液 700ml冰醋酸 100ml該液中的奧酸對脂肪組織既有固定作用，又有染色作用，對有髓神經(jīng)纖維也有固定兼染髓鞘的作用。如果做HE的染色，該液不適合。應(yīng)用該液固定的組織，切片不能太大過厚，一般1-2毫米厚固定時間1-3天，后經(jīng)水洗，保存于80%酒精中，除上述兩液體外，還有Bouin氏液和Carnoy氏液等。冰醋酸也有許多不足之處：1、 不能作為單一的固定劑。冰醋酸在實際應(yīng)用中，常被作為添加劑來使用，如許多種固定液，都加入了冰醋酸。另外，在蘇木素和伊紅染液中，也常加入了冰醋酸。2

16、、 不能凝固蛋白質(zhì)，不能保存白細胞顆粒，紅細胞及含血鐵黃素等。3、 價格較貴。(4) 重鉻酸鉀是一種固體，粉末狀，桔紅色，具有毒 性，較難溶解于涼水，因此在配制時用較高溫度的水來溶解，也較易發(fā)生沉淀。它的優(yōu)點是：1、 能固定脂肪及類脂物。2、 為髓鞘及嗜鉻細胞優(yōu)良的媒染劑。3、 可配成多種的混合固定液（1） Helly氏液重鉻酸鉀 25g升汞 50g蒸餾水 1000ml甲醛 50ml臨用時加入甲醛，因其加入后于24小時后可發(fā)生沉淀而失效，因用時應(yīng)特別注意。該液是白細胞顆粒的優(yōu)良固定劑，因此凡為白細胞或造血器官如骨髓，脾臟及患先天性梅毒之肝臟等，可用此液固定。此液原配方要求加入硫酸鈉，但據(jù)我們經(jīng)

17、驗認(rèn)為，硫酸鈉在液中對組織無任何作用，故省去。（2） Orth氏液重鉻酸鉀 20g蒸餾水 1000ml甲醛 100ml該液固定組織較緩慢，不適合于作臨床的活檢固定液，4毫米厚的組織固定時間需36-72小時，該液對于染色質(zhì)的固定好，顯示清晰，但可溶解部分紅細胞和含鐵血黃素。重鉻酸鉀的不足之處有：1、 不能沉淀蛋白質(zhì)，它必須和醋酸配成混合固定液，方能發(fā)揮作用，產(chǎn)生鉻酸，沉淀蛋白質(zhì)。2、 具有毒性及產(chǎn)生高溫。在配制液體時，如清洗劑，當(dāng)加入硫酸時，可產(chǎn)生很高的溫度，并揮發(fā)出刺鼻的氣體，應(yīng)特別注意。3、 它不能長期固定組織，經(jīng)它固定的組織應(yīng)充分水洗后保存于80%酒精中。（六） 氯化汞又稱升汞，具有毒性。

18、單獨用于固定組織，對組織有較大的收縮力，故很少單獨使用。它可使組織蛋白凝固，迅速硬化而形成白色硬膜，這是由于它穿透力極弱所致，因此它不適合固定較厚的組織。它常與其它的試劑配成混合固定液，彼此抵消各自存在的不足，使固定組織的效果非常好。應(yīng)用升汞配成的固定液的優(yōu)點有：1、 細胞核及細胞漿染色清晰。2、 對白細胞顆粒，造血器官如骨髓和脾臟等是優(yōu)良的固定劑。3、 可配成許多混合固定液如：Zenker氏、Helly氏和Stieve氏等。它的不足之處是：1、 容易產(chǎn)生汞鹽沉淀。經(jīng)升汞配成的混合固定液固定的組織，一是不能固定太長時間，經(jīng)24h后沖水，然后保存于70%或80%的酒精中，二是在洗色前，都必須用碘

19、除去汞鹽的沉淀，以免由于汞鹽沉淀在切片上而影響對切片的觀察。2、 對組織有較大的收縮力且穿透力弱，用它不能固定過厚的組織，因穿透力弱，組織中間部分固定不好。3、 具有毒性。（五）、微波輻射固定組織。組織固定的結(jié)果是組織中的蛋白質(zhì)凝固，以保存組織中原有的微細結(jié)構(gòu)。常規(guī)固定用的是甲醛或酒精等。但是這些固定劑從某些方面來說其穿透力不很強，因而需要較長時間的固定，另者，臨床上的冰凍切片，有的應(yīng)用快速加熱法預(yù)先固定組織，造成福爾馬林的極度揮發(fā)，污染環(huán)境，影響人們的身體健康，因此尋找其它固定組織的方法就成為研究的重點。微波輻射固定組織，就是在這種情況下產(chǎn)生的。微波是一種具有能量的電磁波，在其運動期間可產(chǎn)生瞬間熱。由于微波的快速運動，也導(dǎo)致了物體內(nèi)部極性分子的快速運動，產(chǎn)生了熱量，致使組織蛋白凝固，因此，舊的叫法稱微輻射固定組織。按實際的應(yīng)稱為微波輻射凝固蛋白。1、 組織固定溫度和時間的選擇。究竟微波產(chǎn)生的熱量需要多高，才級使蛋白凝固的呢：Masson氏等人的研究表明，700-90，對沒有固定的蛋白可發(fā)生變性。Bernard經(jīng)過一系列的研究后認(rèn)為，肝、腎、肺的最佳固定溫度是70，和77，因為各種組織的結(jié)構(gòu)不同，成分不一，電子