質(zhì)粒比對(duì)結(jié)果分析

1、DNA測(cè)序結(jié)果比對(duì)實(shí)例：從測(cè)序公司得到的一份DNA測(cè)序結(jié)果通常包含.seq格式的測(cè)序結(jié)果序列文本和.ab1格式的 測(cè)序圖兩個(gè)文件，下面是一份測(cè)序結(jié)果的實(shí)例：CYP3A4-E1-1-1(E1B).ab1CYP3A4-E1-1-1（E1B）.seq.seq文件可以用系統(tǒng)自帶的記事本程序打開，.ab1文件需要用專門的軟件打開。軟 件名稱：Chromas軟件Chromas下載.seq文件打開后如下圖：.ab1文件打開后如下圖:ExportFt ini通常一份測(cè)序結(jié)果圖由紅、黑、綠和藍(lán)色測(cè)序峰組成，代表不同的堿基序列。 測(cè)序圖的兩端（下圖原圖的后半段被剪切掉了）大約50個(gè)堿基的測(cè)序圖部分通 常雜質(zhì)的干擾

2、較大，無(wú)法判讀，這是正?，F(xiàn)象。這也提醒我們?cè)谧鲆镌O(shè)計(jì)時(shí)， 要避免將所研究的位點(diǎn)離PCR序列的兩端太近（通常要大于50個(gè)堿基距離），以免測(cè)序后難以分析比對(duì)。我的課題是研究基因多態(tài)性的，因此下面要介紹的內(nèi)容也主要以判讀測(cè)序圖 中的等位基因突變位點(diǎn)為主。實(shí)際上，要在一份測(cè)序圖中找到真正確實(shí)的等位基因多態(tài)位點(diǎn)并不是一件容 易的事情。一般認(rèn)為等位基因位點(diǎn)假如在測(cè)序圖上出現(xiàn)像套疊的兩個(gè)峰，就是雜 合子位點(diǎn)。實(shí)際比對(duì)后才知道，情況并非那么簡(jiǎn)單，下面測(cè)序圖中標(biāo)出的兩個(gè) 套峰均不是雜合子位點(diǎn)，如圖并說(shuō)明如下：100 .110120寸史能導(dǎo)博既 C - T C C T C T T T C C T T C C T

3、從測(cè)序公司得到的一份DNA測(cè)序結(jié)果通常包含.seq格式的測(cè)序結(jié)果序列文本和.ab1格式 的測(cè)序圖兩個(gè)文件，下面是一份測(cè)序結(jié)果的實(shí)例：CYP3A4-E1-1-1(E1B).ab1CYP3A4-E1-1-1(E1B).seq軟件.seq文件可以用系統(tǒng)自帶的記事本程序打開，.ab1文件需要用專門的軟件打開。名稱：Chromas軟件Chromas下載.seq文件打開后如下圖：.ab1文件打開后如下圖：通常一份測(cè)序結(jié)果圖由紅、黑、綠和藍(lán)色測(cè)序峰組成，代表不同的堿基序列。測(cè)序圖 的兩端（下圖原圖的后半段被剪切掉了）大約50個(gè)堿基的測(cè)序圖部分通常雜質(zhì)的干擾較大， 無(wú)法判讀，這是正?，F(xiàn)象。這也提醒我們?cè)谧鲆?/p>

4、設(shè)計(jì)時(shí)，要避免將所研究的位點(diǎn)離PCR序 列的兩端太近（通常要大于50個(gè)堿基距離），以免測(cè)序后難以分析比對(duì)。我的課題是研究基因多態(tài)性的，因此下面要介紹的內(nèi)容也主要以判讀測(cè)序圖中的等位基因突變位點(diǎn)為主。實(shí)際上，要在一份測(cè)序圖中找到真正確實(shí)的等位基因多態(tài)位點(diǎn)并不是一件容易的事 情。一般認(rèn)為等位基因位點(diǎn)假如在測(cè)序圖上出現(xiàn)像套疊的兩個(gè)峰，就是雜合子位點(diǎn)。實(shí)際 比對(duì)后才知道，情況并非那么簡(jiǎn)單，下面測(cè)序圖中標(biāo)出的兩個(gè)套峰均不是雜合子位點(diǎn)，如圖并說(shuō)明如下:12011010D中無(wú) 用與k + gnc C T C CT . C rr T T C C T T C C T說(shuō)明：第一組套峰，兩峰的軸線并不在同一位置，左

5、側(cè)的T峰是干擾峰；第二組套峰，雖 兩峰軸線位置相同，但兩峰的位置太靠近了，不是雜合子峰，藍(lán)色的C峰是干擾峰。通常 的雜合子峰由一高一略低的兩個(gè)軸線相同的峰組成，此處的序列被機(jī)器誤判為“C”，實(shí)際 的序列應(yīng)為“人，通常一個(gè)高大堿基峰的前面12個(gè)位點(diǎn)很容易產(chǎn)生一個(gè)相同堿基的干擾峰， 峰的高度大約是高大堿基峰的1/2，離得越近受干擾越大。一個(gè)摸索出來(lái)的規(guī)律是：主峰通常在干擾峰的右側(cè)，干擾峰并不一定比主峰低。最關(guān)鍵 的一點(diǎn)是一定要拿疑似為雜合子峰的測(cè)序圖位點(diǎn)與測(cè)序結(jié)果的文本序列和基因庫(kù)中的比對(duì) 結(jié)果相比較；一個(gè)位點(diǎn)的多個(gè)樣本相比較；你得出的該位點(diǎn)的突變率與權(quán)威文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫(kù)中 的突變率相比較。通常，對(duì)于

6、一個(gè)疑似突變位點(diǎn)來(lái)說(shuō)，即使是國(guó)際上權(quán)威組織大樣本的測(cè)序結(jié)果中都沒 有報(bào)道的話，那么單純通過(guò)測(cè)序結(jié)果就判定它是突變點(diǎn)，是并不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?，因一份PCR產(chǎn)物 中各個(gè)堿基的實(shí)際含量并不相同，很難避免不產(chǎn)生誤差的。對(duì)于一個(gè)未知突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)， 通常還需要用到更精確的酶切技術(shù)。DNA套峰分析1、測(cè)序結(jié)果有很多套峰（出現(xiàn)很多N）,為什么？（見圖4）答：模板或引物的原因都可能造成套峰的形成，原因如下：A、DNA模板上出現(xiàn)二處以上的測(cè)序引物結(jié)合位點(diǎn)B、模板不純，如果是質(zhì)?；蚴蔷?，原因是非單克隆，如果是PCR，原因?yàn)榉翘禺愋詶l帶C、模板序列的特殊結(jié)構(gòu)，如poly結(jié)構(gòu)，發(fā)卡結(jié)構(gòu)、嚴(yán)重的重復(fù)序列等D、引物降解，引物不純

7、，或引物的特異性不好2、為什么用PCR產(chǎn)物測(cè)序時(shí)，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)套峰現(xiàn)象？PCR產(chǎn)物測(cè)序出現(xiàn)套峰現(xiàn)象，一般有以下幾種原因：（1）PCR用模板不純或PCR用引物特異性不好，擴(kuò)增出的產(chǎn)物除了目的片段外，還有與目 的片段長(zhǎng)度相近的片段，即使用凝膠電泳也無(wú)法分離開，這樣的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果是套峰。（2）結(jié)構(gòu)上的原因，造成了 PCR產(chǎn)物測(cè)序出現(xiàn)套峰的現(xiàn)象。PolyA/G/C/T以及原因不明的復(fù) 雜結(jié)構(gòu)的存在，都會(huì)出現(xiàn)測(cè)序結(jié)果套峰的情況。3、G/C rich、G/C Cluster：這種情況一般表現(xiàn)為測(cè)序信號(hào)突然減弱或消失（見圖1）；4、A、T的連續(xù)結(jié)構(gòu)：這種情況一般表現(xiàn)為A、T連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)套峰（見圖 2）。根據(jù)文獻(xiàn)記載，原因在于聚合酶進(jìn)行聚合反應(yīng)時(shí)，由于A或T的連續(xù)，聚合酶難以識(shí)別 完整的每個(gè)A或T，在某個(gè)A或T的后面便開始進(jìn)行A或T連續(xù)結(jié)構(gòu)以后序列的聚合反應(yīng)（打 滑現(xiàn)象），造成測(cè)序結(jié)果紊亂，出現(xiàn)套峰。出現(xiàn)這樣的情況，建議反向測(cè)序。 一般來(lái)說(shuō)， PCR片段直接測(cè)序時(shí)，A或T的連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的序列測(cè)序結(jié)果都會(huì)出現(xiàn)套峰。原因在于測(cè)序 時(shí)經(jīng)歷了 PCR反應(yīng)及測(cè)序反應(yīng)（測(cè)序反應(yīng)本身也是PCR反應(yīng)）二次聚合酶的打滑現(xiàn)象。3）原因不明的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)突然信號(hào)減弱或消失。從序列上看，DNA堿基排列并 無(wú)特別異常。估計(jì)是DNA整體出現(xiàn)復(fù)