第6章食品的衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)

1、第6章食品的衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)第一節(jié)食品中菌落總數(shù)的測(cè)定一、菌落總數(shù) 是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后,所得1mL(g)或1cm2面積檢樣中所含菌落的總數(shù)。 二、菌落總數(shù)測(cè)定的意義1、判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量。2、預(yù)測(cè)食品存用的期限長短。3、了解細(xì)菌在食品中的繁殖動(dòng)態(tài)。三、菌落總數(shù)測(cè)定的方法 平板傾注法平板表面涂布法平板表面點(diǎn)滴法四、平板傾注法測(cè)定菌落總數(shù)檢驗(yàn)步驟(程序)： 檢樣稀釋處理做平板培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)報(bào)告結(jié)果（一）、樣品稀釋及做平板1ml1ml1ml1ml1:101:10001:1001:100001ml1ml1ml加入46營養(yǎng)瓊脂1215ml25g/ml樣品生理鹽水 檢樣從

2、開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過20min，以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖。 （二）培養(yǎng)普通食品:37 48h 倒放平板清涼飲料、調(diào)味品、糕點(diǎn)、酒類： 37 24h 水產(chǎn)品: 30 48h（三）計(jì)數(shù)和報(bào)告 到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間，應(yīng)立即計(jì)數(shù)。如果不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平板放置于04，但不得超過24h。1、菌落的選擇（1）、單個(gè)菌做一個(gè)菌落計(jì)（2）、呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，作為一個(gè)菌落計(jì)，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個(gè)菌落計(jì)算。（3）、如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個(gè)平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。2、平板菌落計(jì)數(shù)的選擇 （1）、選取菌落數(shù)在3030

3、0之間的平板（SN標(biāo)準(zhǔn)要求為25250個(gè)菌落），若有二個(gè)稀釋度均在30300之間時(shí)，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字。（2）、如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告（3）、如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報(bào)告（4）、如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于30，不在30300之間，以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告（5）、如所有稀釋度均無菌落生長，則應(yīng)按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。 3、菌落數(shù)的報(bào)告菌落數(shù)在1100時(shí)，按實(shí)有數(shù)字報(bào)告，如大于100時(shí)，則報(bào)告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計(jì)算。固體檢樣以克（g)為單位報(bào)告，液體檢

4、樣以毫升（ml）為單位報(bào)告，表面涂擦則以平方厘米（cm2）報(bào)告。 (四)、檢驗(yàn)注意事項(xiàng)1、對(duì)照平板出現(xiàn)幾個(gè)菌落時(shí)，要追加對(duì)照平板；2、吸管進(jìn)出瓶子或試管時(shí)，吸管口不得觸及瓶口、管口的外圍部分；3、吸管插入試樣液內(nèi)的深度不得小于2.5cm,調(diào)整時(shí)要使管尖與容器內(nèi)壁緊貼;4、進(jìn)行稀釋時(shí),吸管口不得與稀釋液接觸;5、檢樣從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過20min.6、稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，不可作為檢樣計(jì)數(shù)報(bào)告的依據(jù)。復(fù)習(xí)題1、什么是菌落總數(shù)？2、測(cè)定食品、飲料等產(chǎn)品的菌落總數(shù)有什么意義？3、畫出平板傾注法測(cè)定菌落總數(shù)的示意圖。4、在測(cè)定菌落總數(shù)時(shí)

5、，如何選擇菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)？5、在菌落總數(shù)的檢驗(yàn)中，要注意哪些事項(xiàng)？6、在菌落總數(shù)的檢驗(yàn)中，如何根據(jù)樣品的特性選擇培養(yǎng)溫度和時(shí)間？第二節(jié) 食品中大腸菌群的檢驗(yàn)一、大腸菌群 1、 什么是大腸菌群？指一群需氧及兼性厭氧，在37能分解乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的革蘭氏染色陰性無芽胞桿菌。2、大腸菌群的組成:大腸埃希氏菌發(fā)屬、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬和陰溝腸桿菌。屬代表種致病性埃希氏菌屬 （Escherichia） 大腸埃希氏菌 (E.coli) 腸道外感染， 急性腹瀉 志賀氏菌屬 （Shigella） 痢疾志賀氏菌 (Sh.dysenteriae) 細(xì)菌性痢疾愛德華氏菌屬 （Edwardsiella） 遲純愛

6、德華氏菌 (E.tarda) 蛇類等血?jiǎng)游锏恼Ｄc道寄居菌，偶見于健康人或腹瀉者糞便內(nèi)沙門氏菌屬 （Salmonella） 傷寒沙門氏菌 (S.typhi) 腸熱癥、急性腸炎、敗血癥枸櫞酸桿菌屬 (Citrobacter) 弗勞地氏枸櫞酸桿菌 (C.freundii) 條件致病菌，引起繼發(fā)性感染克雷伯氏菌屬 (Klebsiella) 肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae) 肺炎，泌尿系、創(chuàng)傷感染 敗血癥等 陰溝腸桿菌(Enterobacter) 產(chǎn)氣桿菌 (E.aerogenes) 很少引起原發(fā)性感染哈夫尼亞菌屬 (Hafnia) 蜂窩啥夫尼亞菌 (H.alvei) 對(duì)人無致病性沙雷氏菌屬

7、 (Serrati) 粘質(zhì)沙雷氏菌 (S.marcescens) 條件致病菌，引起泌尿系， 呼吸道及創(chuàng)傷感染 變形桿菌屬 (Proteus) 普通變形桿菌 (P.vulgaris) 食物中毒，泌尿系、呼吸道感染 等耶爾森氏菌屬 (Yersinia) 鼠疫耶爾森氏菌 (Y.pestis) 鼠疫歐文氏菌屬 (Erwinia) 草原居民歐文氏菌 (E.herbicola) 植物寄生菌，曾從人體腸道及化膿扁桃體中分離到1、糞便污染的指標(biāo)菌：大腸菌群或大腸桿菌二、大腸菌群的測(cè)定意義2、以大腸菌群作為糞便指標(biāo)菌原因在糞便中數(shù)量最大；在外環(huán)境中存活的時(shí)間與致病菌大體相同；檢測(cè)方法簡(jiǎn)便容易。3、大腸菌群的測(cè)定

8、意義（1）、判斷食品中否受到糞便污染。（2）、有利于控制腸道傳染病的發(fā)生和流行。（3）、有利于控制食品在生產(chǎn)加工、運(yùn)輸、保存等過程中的衛(wèi)生狀況。三、大腸菌群的生物學(xué)特性1.形態(tài)與染色：革蘭氏染色陰性，無芽胞桿菌。2.發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣 3.培養(yǎng)特性：在瓊脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，常有金屬光澤；在麥康凱瓊脂上的典型菌落:呈桃紅色或中心桃紅、圓形，扁平，光滑濕潤。EMB平板照片及原理麥康凱瓊脂平板Age of culture is 24 h大腸桿菌、大腸菌群選擇性顯色培養(yǎng)基-COLI ID用于在37下對(duì)食品中大腸菌群和大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)、計(jì)數(shù)及大腸桿菌的

9、鑒定本培養(yǎng)基含有兩種顯色物質(zhì)，可以直接識(shí)別大腸菌群（coliforms）和鑒定大腸桿菌（Escherichia coli）,而不需附加任何試劑。菌落顏色 玫瑰紅 藍(lán)色 透明.-葡萄糖苷酶 + - - .-半乳糖苷酶 + + - .大腸桿菌 其它大腸菌群 其它革蘭氏陰性菌 .-半乳糖苷酶（+）大腸菌群存在 -半乳糖苷酶（+）大腸菌群存在-葡萄糖苷酶（+）大腸桿菌存在 -葡萄糖苷酶（-）無大腸菌群存在大腸桿菌平板菌落照片腸桿菌掃描電鏡照片.四、大腸菌群檢驗(yàn)方法及操作方法國家標(biāo)準(zhǔn)：三步法：乳糖膽鹽發(fā)酵試驗(yàn)分離培養(yǎng)證實(shí)試驗(yàn)(乳糖發(fā)酵試驗(yàn)) 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：兩步法：推測(cè)試驗(yàn)證實(shí)試驗(yàn)檢樣稀釋處理EMB等革蘭氏染

10、色乳糖發(fā)酵管革蘭氏陰性無芽胞產(chǎn)氣革蘭氏陽性大腸桿菌陰性大腸桿菌陰性報(bào)告不產(chǎn)氣乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)氣不產(chǎn)氣大腸桿菌陰性報(bào)告報(bào)告報(bào)告大腸桿菌陽性1:1001:10各加入1ml各加入10ml各加入1ml單料乳糖膽鹽發(fā)酵管單料乳糖膽鹽發(fā)酵管雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管初發(fā)酵檢樣稀釋檢樣量1g/ml檢樣量0.1g/ml檢樣量0.01g/mlEMB分離培養(yǎng)證實(shí)試驗(yàn)乳糖發(fā)酵管鏡檢查MPN表報(bào)告結(jié)果表1 糞大腸菌群在幾種常用分離培養(yǎng)上的菌落特征培養(yǎng)基菌落特征伊紅蘭培養(yǎng)基(EMB)紫黑色、有金屬光澤，紫黑色、不帶或略帶光澤，淡紫紅色、中心紫黑色、黑紅或深紫紅色品紅亞硫酸納(遠(yuǎn)藤氏平板)紫紅色、有金屬光澤，深紅色、不帶或略帶金

11、屬光澤，淡紅色、中心較深中國蘭平板深藍(lán)色，淺藍(lán)色、中心深藍(lán)色麥康凱平板(Mac C)桃紅色，粉紅色、中心桃紅色MPN法簡(jiǎn)介The Most Probable Number Method1g/ml檢樣中最近似值(MPN)表以1、0.1、0.01、各用3管。陽性管數(shù)MPN個(gè)/100 g/ml1g/ml30.1g/ml30.01g/ml300030001300026000390010300116001290013120020600219002212002315003090031130032160033190五、糞大腸菌群的檢驗(yàn)糞大腸菌群：系一群需氧及兼性厭氧，在44.5培養(yǎng)24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣

12、和分解色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。檢驗(yàn)方法檢樣產(chǎn)酸產(chǎn)氣查MPN表報(bào)告EMB 分離靛質(zhì)基試驗(yàn)陽性反應(yīng)方法一：45 EC肉湯發(fā)酵稀釋44乳糖膽鹽發(fā)酵方法二：檢樣稀釋36乳糖膽鹽發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣產(chǎn)酸產(chǎn)氣EMB 分離查MPN表報(bào)告1、從制備樣品勻液至稀釋完畢,全過程不得超過15min。2、對(duì)產(chǎn)酸但未看到氣泡的乳糖發(fā)酵，用手輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。 3、挑選菌落進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)時(shí)，最少要挑2個(gè)以上的典型菌落或非典型菌落進(jìn)行接種。4、不可用其他膽鹽代替指定的膽鹽。六、檢驗(yàn)注意事項(xiàng)EMB平板照片及原理靛基質(zhì)試驗(yàn)原理及照片七、大腸菌群快速檢驗(yàn)食品大腸菌群快速檢

13、驗(yàn)方法：TTC顯色法；DC試管法；紙片法。（一）食品飲料大腸菌群快速檢驗(yàn)紙片使用方法：1.樣品稀釋同國標(biāo)法2.接種： 飲料和飲用水采用原液、1:10、 1:100三個(gè)稀釋度，固體食品采用1:1 、1:10和1:100三個(gè)稀釋度。用1亳升滅菌吸管吸取1亳升同一稀釋度的稀釋液均勻涂布到袋中的紙片上，做三個(gè)重復(fù)。3.培養(yǎng)：將接種好的紙片輕輕壓平（可疊放），在36下培養(yǎng)1524h觀察結(jié)果。4.結(jié)果判定:紙片上出現(xiàn)紫紅色斑點(diǎn),其周圍有黃圈者,為陽性.紙片為一種著色,無菌落生長者為陰性.紙片呈紫蘭色,有紫紅色斑點(diǎn)，其周圍地黃圈者陰性.酸性食品接種后,紙片變黃,經(jīng)培養(yǎng)后無紫紅色斑點(diǎn)為陰性（二）餐具大腸菌群快

14、速檢驗(yàn)(紙片法)使 用 方 法 ：1. 采樣610份。碗、盤、杯等每份貼紙片兩張，用無菌生理鹽水濕潤紙片后，立即貼于食具內(nèi)側(cè)表面，30秒后取下，置于原塑料袋內(nèi)?？曜右?只為一份樣品，用吸管吸取生理鹽水濕潤紙片后，立即將筷子進(jìn)口端（約5cm）抹拭兩張，放入原塑料袋內(nèi)。2.將已采樣的紙樣置于37C培養(yǎng)15小時(shí).紙片在黃色背景上出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)為陽性，紙片在紫蘭色背景上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，但周圍沒有黃暈均為大腸菌群陰性。同一份樣品兩張紙片均是陰性為合格。食品冷飲大腸菌群檢驗(yàn)紙片冷飲、乳制品和調(diào)味品等大腸菌群的測(cè)定食品飲料大腸菌群快速檢驗(yàn)紙片飲料、食用純水和糕點(diǎn)的大腸菌群測(cè)定餐具大腸菌快速檢驗(yàn)紙片餐具衛(wèi)生消毒效

15、果檢測(cè)大腸菌群測(cè)試片適用于需要對(duì)大腸菌群準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的樣品，如消毒牛乳、冷飲和調(diào)味品等。 八、水的大腸菌群檢驗(yàn)大腸菌群MPN/100mL細(xì)菌總數(shù) CFU/mL 生活飲用水 3 /L100 瓶裝飲用純凈水 3 20 飲用天然礦泉水罐裝產(chǎn)品 050地面水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 10000個(gè)/L 準(zhǔn)備加氯消毒后供飲用的水 1000準(zhǔn)備加氯消毒后供飲用的水 10000游泳池水 1001000（一）、水樣的采集 1、自來水（未含氯）：龍頭火燒滅菌，暢流510后取樣。2、地面水源水：江湖河，水庫，水池等。浸入水下20cm下取樣。水井50cm下取樣。3、漂白粉處理的水樣：自來水，游泳池水，應(yīng)在瓶內(nèi)加入0.03g硫代硫酸鈉/5

16、00ml，或2ml 1.5%硫代硫酸鈉液/500ml，除氯。4、運(yùn)送：2小時(shí)內(nèi)送到檢驗(yàn)室。610，6h,立即檢驗(yàn).5、檢驗(yàn)前：將水樣振搖510分鐘。（二）、生活飲用水或食品生產(chǎn)用水的檢驗(yàn)（大腸菌群 ） 各加10ml各加100ml水樣初發(fā)酵三料乳糖膽鹽50毫升裝三料乳糖膽鹽5毫升裝EMB分離36培養(yǎng) 24h復(fù)發(fā)酵乳糖發(fā)酵鏡檢36培養(yǎng) 24h大腸菌群檢索表（飲用水） 100ml陽性管數(shù)10ml陽性管數(shù)012每L水中大腸菌群數(shù)03411138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069230（三）、瓶裝礦泉水的檢驗(yàn)（大腸菌群 ） 原水樣雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管10毫升裝37培養(yǎng) 24h產(chǎn)酸產(chǎn)氣者亮綠乳糖膽鹽發(fā)酵管37培養(yǎng) 48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣者查表報(bào)告各加入