分子生物學第三章生物信息的傳遞上課件

1、第三章 生物信息的傳遞（上）從DNA到RNA1、RNA的轉(zhuǎn)錄2、啟動子與轉(zhuǎn)錄起始3、原核生物與真核生物mRNA的特征比較4、終止與抗終止5、內(nèi)含子的剪接、編輯及化學修飾DNA序列是遺傳信息的貯存者，它通過自主復制得到永存，并通過轉(zhuǎn)錄生成信使RNA、翻譯生成蛋白質(zhì)的過程來控制生命現(xiàn)象。基因表達包括轉(zhuǎn)錄(transcription)和翻譯(translation)兩個階段。轉(zhuǎn)錄是指拷貝出一條與DNA鏈序列完全相同(U替換T)的RNA單鏈的過程，是基因表達的核心步驟；翻譯是指以新生的mRNA為模板，把核苷酸三聯(lián)遺傳密碼子翻譯成氨基酸序列、合成多肽鏈的過程，是基因表達的最終目的。與mRNA序列相同的那

2、條DNA鏈稱為編碼鏈(coding strand)或稱有意義鏈(sense strand)；另一條根據(jù)堿基互補原則指導mRNA合成的 DNA鏈稱為模板鏈(template strand)或稱反義鏈(antisense strand)。貯藏在任何基因中的生物信息都必須首先被轉(zhuǎn)錄生成RNA，才能得到表達。RNA主要以單鏈形式存在于生物體內(nèi)，其高級結(jié)構(gòu)很復雜，它們既擔負著貯藏及轉(zhuǎn)移遺傳信息的功能，又能作為核酶直接在細胞內(nèi)發(fā)揮代謝功能。RNA分子來自DNA。儲存于DNA雙鏈中的遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄酶促反應按照堿基互補配對的原則被轉(zhuǎn)化成為單鏈RNA分子。生物體內(nèi)共有3種RNA： 、信使RNA(messeng

3、er RNA，mRNA) 編碼特定蛋白質(zhì)序列； 2、轉(zhuǎn)移RNA(transfer RNA，tRNA)特異 性解讀mRNA中的遺傳信息、將其轉(zhuǎn)化成 相應氨基酸并將其加入多肽鏈中； 3、核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA)直 接參與核糖體中蛋白質(zhì)合成。 31 RNA的轉(zhuǎn)錄311 轉(zhuǎn)錄的基本過程無論是原核還是真核細胞，轉(zhuǎn)錄的基本過程都包括:模板識別、轉(zhuǎn)錄起始、通過啟動子及轉(zhuǎn)錄的延伸和終止。在原核生物中，模板識別階段主要指RNA聚合酶與啟動子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過程。轉(zhuǎn)錄起始前，啟動子附近的DNA雙鍵分開形成轉(zhuǎn)錄泡以促使底物核糖核苷酸與模板DNA的堿基配對。轉(zhuǎn)錄起始就是RN

4、A鏈上第一個核苷酸鍵的產(chǎn)生。 轉(zhuǎn)錄起始后直到形成9個核酸苷短鏈前是通過啟動子階段，此時RNA聚合酶一直處于啟動子區(qū)，新生的RNA鏈與DNA模板鏈的結(jié)合不夠牢固，很容易從DNA鏈上掉下來并導致轉(zhuǎn)錄重新開始。一旦RNA聚合酶成功地合成9個以上核苷酸并離開啟動子區(qū)，轉(zhuǎn)錄就進人正常的延伸階段。所以，通過啟動子的時間代表一個啟動子的強弱。一般說來，通過啟動子的時間越短，該基因轉(zhuǎn)錄起始的頻率也越高。RNA聚合酶離開啟動子，沿DNA鏈移動并使新生RNA鏈不斷伸長的過程就是轉(zhuǎn)錄的延伸。隨著RNA聚合酶的移動，DNA雙螺旋持續(xù)解開且新生RNA鏈的3末端不斷延伸，在解鏈區(qū)形成RNA-DNA雜合物。在解鏈區(qū)的后面D

5、NA模板與非模板鏈重新結(jié)合成為雙螺旋。當RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點時，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物分離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，DNA恢復成雙鏈狀態(tài)，而RNA聚合酶和RNA鏈都被從模板上釋放出來，這就是轉(zhuǎn)錄的終止。真核生物RNA聚合酶需要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(輔助蛋白質(zhì))按特定順序結(jié)合于啟動子上并形成復雜的前起始復合物。轉(zhuǎn)錄和翻譯的速度基本相等。312 轉(zhuǎn)錄機器的主要成分3121 RNA聚合酶以DNA序列為模板的RNA聚合酶主要以雙鏈DNA為模板，以4種為活性前體，催化RNA鏈的起始、延伸和終止，不需任何引物，催化生成與DNA模板鏈互補的RNA。312 轉(zhuǎn)錄機器的主要成分3121 RN

6、A聚合酶RNA或RNA-DNA雙鏈雜合體不能作為模板。大腸桿菌RNA聚合酶的主要成分與功能大多數(shù)原核生物RNA聚合酶的組成是相同的，大腸桿菌RNA聚合酶由2個亞基、一個亞基、一個亞基和一個亞基組成，稱為核心酶。加上一個亞基后則成為聚合酶全酶(holoenzyme) 。由和亞基組成了聚合酶的催化中心。亞基能與模板DNA、新生RNA鏈及核苷酸底物相結(jié)合。亞基與核心酶的組裝及啟動子識別有關，并參與RNA聚合酶和部分調(diào)節(jié)因子的相互作用。因子的作用是負責模板鏈的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，它使酶專一性識別模板上的啟動子。因子可以極大地提高RNA聚合酶對啟動子區(qū)DNA序列的親和力，同時使RNA聚合酶與模板DNA上非

7、特異性位點的結(jié)合降低。因子大大增加聚合酶對啟動子的親和力，并降低酶對非專一位點的親和力，使酶專一性識別模板上的啟動子。轉(zhuǎn)錄的起始是單個核苷酸與開鏈啟動子酶復合物相結(jié)合構(gòu)成新生RNA的5端，再以磷酸二酯鍵的形式與第二個核苷酸相結(jié)合，起始的終止反映在因子的釋放。當新生RNA鏈達到69個核苷酸時，能形成穩(wěn)定的酶DNARNA三元復合物，并釋放因子，轉(zhuǎn)錄進入延伸期。當聚合酶按5 3方向延伸RNA鏈時，解旋的DNA區(qū)域也隨之移動。聚合酶可以橫跨約40bp，而解旋的DNA區(qū)域大約是17bp。自由核苷酸能被聚合酶加到新生的RNA鏈上，并形成DNA-RNA雜合體。隨著聚合酶在模板上的運動，靠近3端的DNA不斷解

8、旋，同時在5端重新形成DNA雙鏈，將RNA鏈擠出DNA-RNA雜合體。RNA的3端大約有2030個核苷酸與DNA和聚合酶相結(jié)合。真核生物中共有3類RNA聚合酶，它們在細胞核中的位置不同，負責轉(zhuǎn)錄的基因不同。不同生物3類聚合酶的亞基種類和大小存在兩條普遍遵循的原則:一是聚合酶中有兩個相對分子質(zhì)量超過l105的大亞基；二是同種生物3類聚合酶有共享小亞基的傾向，即有幾個小亞基是其中3類或2類聚合酶所共有的。真核生物線粒體和葉綠體中還存在著不同的RNA聚合酶。線粒體RNA聚合酶只有一條多肽鏈，是已知最小的RNA聚合酶之一，與T7噬菌體RNA聚合酶有同源性。葉綠體RNA聚合酶比較大，結(jié)構(gòu)上與細菌中的聚合

9、酶相似，由多個亞基組成，部分亞基由葉綠體基因組編碼。 3122 轉(zhuǎn)錄復合物 啟動子選擇階段包括RNA聚合酶全酶對啟動子的識別，聚合酶與啟動子可逆性結(jié)合形成封閉復合物（closed complex）。3122 轉(zhuǎn)錄復合物伴隨著DNA構(gòu)象上的重大變化，封閉復合物轉(zhuǎn)變成開放復合物(open complex) ，聚合酶全酶所結(jié)合的DNA序列中有一小段雙鏈被解開。 強啟動子從封閉復合物到開放復合物的轉(zhuǎn)變是不可逆的，是快反應。開放復合物與最初兩個NTP相結(jié)合并在這兩個核苷酸之間形成磷酸二酯鍵后(RNA聚合酶、DNA和新生RNA)三元復合物。 真核生物轉(zhuǎn)錄起始復合物的分子量很大：RNA聚合酶、7種輔助因子，

10、輔助因子又包含多個亞基。三元復合物可以進入兩條不同的反應途徑，一是合成并釋放29個核苷酸的短RNA轉(zhuǎn)錄物流產(chǎn)式起始.二是盡快釋放亞基，轉(zhuǎn)錄起始復合物通過上游啟動子區(qū)并生成由核心酶、DNA和新生RNA所組成的轉(zhuǎn)錄延伸復合物。轉(zhuǎn)錄的真實性取決于有特異的轉(zhuǎn)錄起始位點，轉(zhuǎn)錄起始后按照堿基互補原則準確地轉(zhuǎn)錄模板DNA序列及具有特異的終止部位。RNA的合成是在模板DNA的啟動子位點上起始的，而這個任務是靠因子來完成的。RNA聚合酶的核心酶雖可合成RNA，但不能找到模板DNA上的起始位點。核心酶的產(chǎn)物是不均一的，因為它沒有固定的起始位點，而且DNA兩條鏈都可作為模板。只有帶因子的全酶才能專一地與DNA上的啟

11、動子結(jié)合，選擇其中一條鏈作為模板，合成均一的產(chǎn)物。因子的作用只是起始而已，一旦轉(zhuǎn)錄開始，它就脫離了起始復合物，而由核心酶負責RNA鏈的延伸。因此，聚合酶全酶的作用是啟動子的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，而核心酶的作用是鏈的延伸。轉(zhuǎn)錄延伸復合物是轉(zhuǎn)錄循環(huán)中一個十分重要的環(huán)節(jié)。與轉(zhuǎn)錄起始復合物相比，延伸復合物極為穩(wěn)定，可以長時間地與DNA模板相結(jié)合而不解離。只有在它遇到轉(zhuǎn)錄終止信號時，RNA聚合酶才停止加入新的核苷酸，RNADNA雜合物解離，釋放轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并導致聚合酶本身從模板DNA上掉下來。32 啟動子與轉(zhuǎn)錄起始大腸桿菌RNA聚合酶與啟動子的相互作用主要包括啟動子區(qū)的識別、酶與啟動子的結(jié)合及因子的結(jié)合與解離。

12、321 啟動子區(qū)的基本結(jié)構(gòu)啟動子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確地結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。321 啟動子區(qū)的基本結(jié)構(gòu)基因的特異性轉(zhuǎn)錄取決于酶與啟動子能否有效地形成二元復合物，所以，RNA聚合酶如何有效地找到啟動子并與之相結(jié)合是轉(zhuǎn)錄起始過程中首要解決的問題。轉(zhuǎn)錄的起始是基因表達的關鍵階段，而這一階段的重要問題是RNA聚合酶與啟動子的相互作用。啟動子的結(jié)構(gòu)影響了它與RNA聚合酶的親和力，從而影響了基因表達的水平。轉(zhuǎn)錄單元(transcription unit)是一段從啟動子至終止子(terminator) 的DNA序列。RNA聚合酶從轉(zhuǎn)錄起點開始

13、沿模板前進到終止子為止，轉(zhuǎn)錄出一條RNA鏈。在細菌中，一個轉(zhuǎn)錄單元可以是一個基因，也可以是幾個基因。轉(zhuǎn)錄起點是指與新生RNA鏈第一個核苷酸相對應DNA鏈上的堿基，研究證實通常為一個嘌呤。常把起點前面，即5末端的序列稱為上游(upstream)，而把其后面即3末端的序列稱為下游(downstream)。啟動子區(qū)是RNA聚合酶的結(jié)合區(qū)，啟動子區(qū)有什么結(jié)構(gòu)特點呢?Pribnow設計了一個實驗，他把RNA聚合酶全酶與模板DNA結(jié)合后，用DNaseI水解DNA，然后用酚抽提，沉淀純化DNA后得到一個被RNA聚合酶保護的DNA片段，約有4144個核苷酸對。他分析發(fā)現(xiàn)，在被保護區(qū)內(nèi)有一個由5個核苷酸組成的共

14、同序列，是RNA聚合酶的緊密結(jié)合點，現(xiàn)在稱為Pribnow區(qū)(Pribnow box)，這個區(qū)的中央大約位于起點上游10bp處，所以又稱10區(qū)。科學家在啟動子的35bp附近找到了另一段共同序列:TTGACA。經(jīng)過數(shù)年的努力，確證絕大部分啟動子都存在這兩段共同序列，即10bp處的TATA區(qū)和35bp處的TTGACA區(qū)。-10位的TATA區(qū)和-35位的TGACA區(qū)是RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合位點，能與因子相互識別而具有很高的親和力。 在真核生物基因中，位于轉(zhuǎn)錄起始點上游2530bp處的共同序列TATAAA，也稱為TATA區(qū)。另外，在起始位點上游-70-78bp處還有另一段共同序列CCAAT，這是與

15、原核生物中-35bp區(qū)相對應的序列，稱為CAAT區(qū)(CAAT box)。3.2.2 啟動子區(qū)的識別RNA聚合酶是通過氫鍵互補的方式識別啟動子的。堿基中的某些基團是氫鍵受體和氫鍵供體處于DNA雙螺旋的大溝或小溝內(nèi)，因此都具有特定的方位.3.2.2 啟動子區(qū)的識別酶分子中也有處于特定空間構(gòu)象的氫鍵受體與供體，當它們與啟動子中對應的分子在一定距離內(nèi)互補時，就形成氫鍵，相互結(jié)合。3.2.3 酶與啟動子區(qū)的結(jié)合RNA聚合酶閉合雙鏈DNA二元閉合復合物二元開鏈復合物。酶與啟動子結(jié)合的主要區(qū)域在解鏈區(qū)(-9+13)上游。RNA聚合酶既是雙鏈DNA結(jié)合蛋白，又是單鏈DNA結(jié)合蛋白。DNA開鏈是按照DNA模板序

16、列正確引入核苷酸底物的必要條件。3.2.4 -10區(qū)與-35區(qū)的最佳間距在原核生物中，-35區(qū)與-10區(qū)之間距離大約是1619bp，小于15bp或大于20bp都會降低啟動子活性，并基因的表達水平。因為增減bp ，-35區(qū)相對于-10區(qū)旋轉(zhuǎn)（增減一個bp會使兩者之間的夾角發(fā)生360的變化）產(chǎn)生超螺旋結(jié)構(gòu)的改變。在細菌中常見兩種啟動子突變，一種叫下降突變(down mutation)，如果把Pribnow區(qū)從TATAAT變成AATAAT就會大大降低其結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平。另一類為上升突變(up mutation)，即增加Pribnow區(qū)共同序列的同一性，提高基因的轉(zhuǎn)錄水平。 325 增強子及其功能增

17、強子是在SV40轉(zhuǎn)錄單元轉(zhuǎn)錄起始位點上游約200bp處有兩段72bp長的重復序列。325 增強子及其功能增強子非啟動子，但能增強或促進轉(zhuǎn)錄的起始。除去增強子會降低基因轉(zhuǎn)錄水平。保留其一或?qū)⑵洳逯罝NA分子的任何部位，可保持基因的正常轉(zhuǎn)錄。這種能強化轉(zhuǎn)錄起始的序列為增強子或強化子(enhancer)。后來在許多基因的啟動區(qū)中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了增強子的存在。增強子可能通過模板結(jié)構(gòu)的改變，使得RNA聚合酶易與模板DNA相結(jié)合，啟動基因轉(zhuǎn)錄。 3.2.6 真核生物啟動子對轉(zhuǎn)錄的影響啟動子是確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始的DNA序列。1979年美國科學家Goldberg注意到真核生物由RNA聚合酶II催化轉(zhuǎn)錄的DNA

18、序列5上游區(qū)有一段與原核生物Pribnow區(qū)相似的富含TA的保守序列。由于該序列前4個堿基為TATA，所以又稱為TATA區(qū)(TATA box)。 3.2.6 真核生物啟動子對轉(zhuǎn)錄的影響啟動子是確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始的DNA序列 (TATA box)。 真核啟動子具有共同結(jié)構(gòu)模式： 1）真核基因的啟動子在-25-35區(qū)含有 TATA序列； 2）在-70-80區(qū)含有CCAAT序列(CAAT box)； 3）在-80-110含有GCCACACCC或 GGGCGGG序列(GC box)。TATA區(qū)上游的保守序列稱為上游啟動子元件(upstream promoter element，UPE)或稱上游激

19、活序列(upstream activating sequence，UAS)。原核基因啟動區(qū)范圍較小，TATAAT (Pribnow區(qū))的中心位于-10，上游只有TTGACA區(qū)(-35區(qū))作為RNA聚合酶的主要結(jié)合位點，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。真核基因的調(diào)控區(qū)較大，TATA A/TA區(qū)位于-20-30，-40-110區(qū)為上游激活區(qū)，CAAT區(qū)(-70-78區(qū))，大多基因還擁有GC區(qū)和增強子區(qū)。TATA區(qū)主要作用是使轉(zhuǎn)錄精確地（特異位點）起始，若除去TATA區(qū)或進行堿基突變，RNA產(chǎn)物起始點不固定。CAAT區(qū)或GC區(qū)是決定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)率高低的。CAAT區(qū)和GC區(qū)主要控制轉(zhuǎn)錄起始頻率，基本不參與起始位點的確定，

20、CAAT區(qū)對轉(zhuǎn)錄起始頻率的影響最大。在TATA區(qū)和相鄰的UPE區(qū)之間插入核苷酸也會使轉(zhuǎn)錄減弱。盡管這3種啟動子區(qū)序列都有著重要功能，但并不是每個基因的啟動子區(qū)都包含這3種序列。真核細胞中存在著大量特異性或組成型表達的、能夠與不同基因啟動子區(qū)UPE相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。基因轉(zhuǎn)錄實際上是RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動子區(qū)各種調(diào)控元件相互作用的結(jié)果。3.3 原核與真核生物mRNA的特征比較mRNA在大腸桿菌細胞內(nèi)占總RNA的2%左右(tRNA占16%，而rRNA則占80%以上)。3.3 原核與真核生物mRNA的特征比較科學家很早就猜想生物細胞內(nèi)存在能將遺傳信息從DNA上轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)分子上的信使(或

21、稱模板) 。但由于mRNA在細菌細胞內(nèi)的半衰期很短，直到20世紀70年代初才首次將這一重要物質(zhì)從細胞中分離出來?，F(xiàn)已清楚，許多基因的mRNA在體內(nèi)還是相當穩(wěn)定的，半衰期從幾個小時到幾天不等。目前，人們己能從幾乎所有生物體內(nèi)分離純化編碼任何蛋白質(zhì)的mRNA。mRNA在所有細胞內(nèi)執(zhí)行著相同的功能，即通過密碼三聯(lián)子翻譯生成蛋白質(zhì)，但其生物合成的具體過程和成熟mRNA的結(jié)構(gòu)在原核和真核細胞內(nèi)是不同的。真核細胞只有成熟的mRNA 、相對分子質(zhì)量明顯變小并經(jīng)化學修飾的mRNA才能進入細胞質(zhì)參與蛋白質(zhì)的合成。所以，真核細胞mRNA的合成和功能表達發(fā)生在不同的空間和時間范疇內(nèi)。原核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯

22、不僅發(fā)生在同一個細胞空間里，而且這兩個過程幾乎是同步進行的，蛋白質(zhì)合成往往在mRNA剛開始轉(zhuǎn)錄時就被引發(fā)。一個原核細胞的mRNA(包括病毒)有時可以編碼幾個多肽，而一個真核細胞的mRNA最多只能編碼一個多肽。原核生物常以AUG作為起始密碼子，有時GUG或UUG也作為起始密碼子；真核生物幾乎永遠以AUG作為起始密碼子。331 原核生物mRNA的特征1 原核生物mRNA的半衰期短 細菌基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯是緊密相聯(lián)的，基因轉(zhuǎn)錄一旦開始，核糖體就結(jié)合到新生mRNA鏈的5端，啟動蛋白質(zhì)合成，而此時該mRNA的3端還遠遠沒有轉(zhuǎn)錄完全。331 原核生物mRNA的特征1 原核生物mRNA的半衰期短在電子顯微鏡下

23、，我們可以看到一連串核糖體緊緊跟在RNA聚合酶后面。絕大多數(shù)細菌mRNA的半衰期很短，mRNA降解緊隨著蛋白質(zhì)翻譯過程發(fā)生。轉(zhuǎn)錄開始1 min后，降解就開始了，當mRNA的5端開始降解時，其3端部分仍在合成或被翻譯。mRNA的降解速度大概是轉(zhuǎn)錄或翻譯速度的一半。因為基因轉(zhuǎn)錄和多鏈肽延伸的速度基本相同，所以細胞內(nèi)某一基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的多少決定于轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始效率。以大腸桿菌色氨酸合成酶基因為例，平均每分鐘約有15次轉(zhuǎn)錄起始，這些mRNA鏈從生成到降解平均被翻譯10次，所以，穩(wěn)定狀態(tài)下細胞中每分鐘生成150個多肽。2、原核生物mRNA多以多順反子存在 細菌mRNA可同時編碼不同蛋白質(zhì)。編碼多個

24、蛋白質(zhì)的mRNA為多順反子mRNA。多順反子mRNA是一組相鄰基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物, 這一組基因被稱為一個操縱子。單順反子mRNA為只編碼一個蛋白質(zhì)的mRNA。所有mRNA都被分成3部分 編碼區(qū)、位于AUG之前的5端上游非編碼區(qū)以及位于終止密碼子之后不翻譯的3端下游非編碼區(qū)。編碼區(qū)始于起始密碼子AUG，經(jīng)一連串編碼氨基酸的密碼子直至終止密碼子。對第一個順反子來說，一旦mRNA的5端被合成，翻譯起始位點即可與核糖體相結(jié)合，而后面幾個順反子翻譯的起始就會受其上游順反子結(jié)構(gòu)的調(diào)控。一種情況是，第一個蛋白質(zhì)合成終止以后，核糖體分解成大、小亞基，脫離mRNA模板，第二個蛋白的翻譯必須等到新的小亞基和大亞基與該

25、蛋白起始密碼子相結(jié)合后才可能開始。另一情況是前一個多肽翻譯完成以后，核糖體大、小亞基分離，小亞基不離開mRNA模板，而是迅速與游離的大亞基結(jié)合，啟動第二個多肽的合成。在噬菌體RNA中，一個順反子的翻譯有時完全取決于它前面順反子的翻譯，因為噬菌體RNA往往形成復雜的二級結(jié)構(gòu)，只有第一個翻譯起始位點是暴露的，在這個順反子翻譯產(chǎn)生多肽的過程中，核糖體的運動破壞了后續(xù)順反子的二級結(jié)構(gòu)，使起始位點較容易與核糖體相結(jié)合形成起復合物 。3. 原核生物mRNA的5端無帽子結(jié) 構(gòu)，3端無或者只有較短的poly (A)結(jié)構(gòu)。 3.3.2 真核生物mRNA的特征凡是編碼功能蛋白的真核基因都通過RNA聚合酶進行轉(zhuǎn)錄。

26、真核基因幾乎都是單順反子，只包含一個蛋白質(zhì)的信息，其長度在幾百到幾千個核苷酸之間。3.3.2 真核生物mRNA的特征一個完整基因包括編碼區(qū)(coding region)，和不編碼氨基酸的5和3端的特異性序列。基因的分子生物學定義是:產(chǎn)生一條多肽鏈的功能RNA所必需的全部DNA核苷酸序列!真核生物mRNA結(jié)構(gòu)上的最大特征是5端的帽子及3的poly(A)結(jié)構(gòu)。真核生物mRNA的5端的帽子真核生物的mRNA(不包括葉綠體和線粒體)5端都是經(jīng)過修飾的，基因轉(zhuǎn)錄一般從A起始，第一個核苷酸保留了5端的三磷酸基團并能通過其3-OH位與下一個核苷酸的5磷酸基團形成二酯鍵，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的起始序列為pppApNpNp

27、但如果在體外用核酸酶處理成熟mRNA;其5端并不產(chǎn)生預期的核苷三磷酸，而產(chǎn)生以5 5三磷酸基團相連的二核苷酸，5終端是一個在mRNA轉(zhuǎn)錄后加上去的甲基化鳥嘌呤 。mRNA5端加“G”的反應是由腺苷酸轉(zhuǎn)移酶完成的，這個反應非常迅速，很難測得5端存在自由三磷酸基團。即mRNA幾乎一誕生就戴上帽子的。mRNA的帽子結(jié)構(gòu)常常被甲基化。第一個甲基出現(xiàn)在所有真核細胞的mRNA中，稱為零號帽子(cap0)。 第二個核苷酸(原mRNA5第一位)的2-OH位上加另一個甲基。有這個甲基的結(jié)構(gòu)稱為1號帽子(cap1)，真核生物中以這類帽子結(jié)構(gòu)為主。在某些生物細胞內(nèi)，mRNA鏈上的第三個核苷酸的2-OH位也可能被甲基

28、化，被稱為2號帽子（cap2），占有帽mRNA總量的10%15%。 帽子結(jié)構(gòu)使mRNA免遭核酸酶的破壞。當珠蛋白mRNA5端的7-M-G被除去后，該mRNA分子的翻譯活性和穩(wěn)定性都明顯下降。有帽子結(jié)構(gòu)的mRNA更容易被蛋白質(zhì)合成的起始因子所識別，從而促進蛋白質(zhì)的合成。mRNA5端甲基化的帽子是翻譯所必須的。甲基化的帽子結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)合成起始信號的一部分。多數(shù)真核生物mRNA有poly(A)尾巴除組蛋白基因外，真核生物mRNA的3末端都有poly(A)序列，其長度因mRNA種類不同而變化，一般為40200個。poly(A)序列是在轉(zhuǎn)錄后加上去的，是在細胞核中的不均一核RNA階段加上的。 真核基因的

29、3末端poly(A)起始位點上游1530bp處有一段保守序列AAUAAA，這對初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的準確切割及加poly(A)是必需的。點突變實驗將AAUAAA的基因序列AATAAA變?yōu)锳AGAAA，發(fā)現(xiàn)mRNA的剪接加工受阻，沒有功能性mRNA產(chǎn)生。RNA聚合酶是真核細胞核中轉(zhuǎn)錄RNA的酶。RNA聚合酶在poly(A)起始位點不終止而繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，大多基因初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物擁有該位點下游052kb核苷酸序列。加poly(A) 需內(nèi)切酶切開mRNA 3端的特定部位，然后由poly(A)合成酶催化多聚腺苷酸的反應。 poly(A)為mRNA進細胞質(zhì)所必需，可提高mRNA在細胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。mRNA剛進胞質(zhì)時其po

30、ly(A)較長，隨著時間延長，poly(A)逐漸變短消失，mRNA開始降解。真核生物mRNA大都具poly(A)尾巴，這一特性已被廣泛應用于分子克隆。常用寡聚dT片段與mRNA上的poly(A)相配對，作為反轉(zhuǎn)錄酶合成第一條cDNA鏈的引物。但細胞中還有1/3 mRNA無poly(A)的， mRNA帶有poly(A)的稱為poly(A)+，而沒poly(A)的稱為poly(A)。約1/3的poly(A)mRNA編碼了不同形式的組蛋白，其余2/3的poly(A)mRNA帶有與poly(A)+組分相同的遺傳信息。3.4 終 止RNA聚合酶啟始轉(zhuǎn)錄后沿模板53方向移動并合成RNA鏈，直到碰上終止信號

31、時才與模板脫離并釋放新生RNA鏈。發(fā)生終止時，RNA-DNA雜合體的氫鍵被破壞，模板DNA鏈與有義鏈重新組合成DNA雙鏈。341 由基因序列決定的終止終止位點上游存在富含GC堿基的二重對稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)。終止位點前有一段48個A的序列，故其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3端為寡聚U，該結(jié)構(gòu)決定轉(zhuǎn)錄的終止。當RNA出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)會導致RNA聚合酶的暫停，破壞RNA-DNA雜合鏈5端的正常結(jié)構(gòu)。寡聚U的存在使雜合鏈的3端部分出現(xiàn)不穩(wěn)定的rUdA區(qū)域。兩者共同作用使RNA從三元復合物中解離出來。終止效率與二重對稱序列和寡聚U的長短有關，隨發(fā)卡式結(jié)構(gòu)(至少6bp)和寡聚U序列(至少4個U)

32、長度的增加，終止效率越高。3.4.2 依賴于因子的終止因子是NTP酶，它催化NTP的水解促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復合物中解離出來而終止轉(zhuǎn)錄。依賴于因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)DNA序列無共性，因子不能識別終止位點。因子附著在新生的RNA鏈上，沿53 朝RNA聚合酶移動，達RNA的3-OH端后取代終止位點上的RNA聚合酶，使之從模板DNA上釋放出來，同時釋放mRNA，完成轉(zhuǎn)錄過程。35 內(nèi)含子的剪接、編輯及化學修飾35l RNA中的內(nèi)含子真核斷裂基因表達伴隨著RNA的剪接過程,從mRNA前體中切除內(nèi)含子(intron)的非編碼區(qū)，并使外顯子(exon)的編碼區(qū)拼接成成熟mRNA。真核基因大多是斷裂的，即一個基因可由多個內(nèi)含子和外顯子間隔排列而成。內(nèi)含子在真核基因中所占的比例很高，可超過99%。核不均一RNA(hnRNA) 5加“帽”和3加尾剪接可讀框(open reading frame，ORF)