第04章-定量分析樣品前處理課件

1、第四章 藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證第一節(jié) 定量分析樣品的前處理方法一、概述 目的：為滿足所選用的分析方法對(duì)試樣的要求, 使之處于可測(cè)定狀態(tài)。1、多數(shù)具有特殊結(jié)構(gòu)或取代基的化學(xué)原料藥可 不經(jīng)特殊處理，用適當(dāng)?shù)娜軇┤芙庵苯硬捎?滴定法、分光光度法或色譜法測(cè)定；2、藥物制劑排除處方組成中的干擾組分；3、含金屬或含鹵素、硫、磷、硒等特殊元素的 藥物依據(jù)其在藥物分子中結(jié)合狀態(tài)，進(jìn)行 前處理方法的選擇。含鹵素（金屬）有機(jī)藥物 藥物分子結(jié)構(gòu)中所含鹵素（金屬）直接與芳環(huán) 或脂肪鏈相連者。 *而不包括某些有機(jī)藥物的鹵酸鹽或氫鹵酸鹽。結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：CX（一）含金屬的有機(jī)藥物的結(jié)合形式 1、金屬離子不直接與C原子相連：

2、 通常為有機(jī)酸或酚類的金屬鹽或配位化合 物，常稱為含金屬的有機(jī)藥物； *若有機(jī)結(jié)構(gòu)部分不干擾測(cè)定，可不經(jīng)有機(jī)破壞 直接在溶液中進(jìn)行定性定量分析。 2、金屬離子直接與C原子以共價(jià)鍵相連： 稱為有機(jī)金屬藥物，需經(jīng)有機(jī)破壞使其轉(zhuǎn)變 成為無(wú)機(jī)鹽類后進(jìn)行分析。（二）鹵原子的結(jié)合形式（活潑性）鹵原子與碳原子直接相連 鹵原子的活潑性和它直接相連的烴基的結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系：（1）乙烯型鹵和芳鹵： 不活潑堿性溶液中加還原劑（如鋅粉）回流（2）烯丙型鹵和芐鹵： 活潑（3）鹵代烷型： 介于兩者之間 堿性溶液直接回流2. 分子中所含鹵原子的個(gè)數(shù) 分子中所含鹵原子的個(gè)數(shù)越多，活潑性越強(qiáng)，特別是同一碳上含多個(gè)鹵原子或一個(gè)苯環(huán)

3、上含多個(gè)鹵原子時(shí)，活潑性增強(qiáng)更加明顯。二、不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法（一）直接測(cè)定法 凡金屬原子不直接與碳原子相連的含金屬藥物或某些CM（金屬原子直接與碳原子相連）鍵結(jié)合不牢固的有機(jī)金屬藥物，在水溶液中可以電離，因而不需有機(jī)破壞，可直接選用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行測(cè)定。1.配位滴定法： 利用二價(jià)金屬離子可與乙二胺四乙酸二鈉形成配位化合物，可用乙二胺四乙酸二鈉直接滴定。如葡萄糖酸鈣的含量測(cè)定。 2.氧化還原滴定法： 利用不同價(jià)態(tài)的金屬離子的氧化還原性，選用適當(dāng)?shù)味ㄒ褐苯踊蜷g接滴定法測(cè)定含量。如富馬酸亞鐵的含量測(cè)定Ch.P (2005) 取本品約0.3g，精密稱定，加稀硫酸 15ml，加熱溶解后，放冷，加新沸過

4、的冷水50ml與鄰二氮菲指示液2 滴，立即用硫酸鈰滴定液(0.1mol/L)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1ml硫酸鈰滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于16.99mg 。原理Fe2+ + Ce4+ Ce3+ + Fe2+ Fe2+ - eFe3+紅色淺藍(lán)色OOCCHOHCCO+Fe2+（二） 經(jīng)水解后測(cè)定法 1.堿水解后測(cè)定法 本法是將含鹵素有機(jī)藥物溶于適當(dāng)溶劑（如乙醇）中，加入氫氧化鈉溶液（或一定量過量的硝酸銀滴定液）后，加熱回流使其水解，將有機(jī)結(jié)合的鹵素轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)機(jī)的鹵素離子，然后采用銀量法（Volhard法）測(cè)定。 本法適用于含鹵素有機(jī)藥物結(jié)構(gòu)中鹵素原子結(jié)合不牢固的藥物（如鹵原子和脂

5、肪碳原子相連者）。 原理 三氯叔丁醇在氫氧化鈉溶液中加熱回流水解，氯元素全部轉(zhuǎn)變成氯化鈉，然后用剩余滴定法，即于水解液中加硝酸酸化，再加入定量過量的硝酸銀滴定液，使Cl-生成AgCl沉淀，過量的硝酸銀，以Fe3+為指示劑，用硫氰酸銨液回滴定。 例:三氯叔丁醇的測(cè)定 Ch.P（2005）CCl3-C(CH3)2-OH + 4NaOH 回流(CH3)2-CO + 3NaCl + HCOONa + 2H2ONaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3 AgNO3 + NH4SCNAgSCN + NH4NO3（淡棕紅色）(Ksp=1.561010 )(Ksp=1.010-12 )Fe3+ + S

6、CN Fe (SCN) 2+ 2、酸水解后測(cè)定法 如硬脂酸鎂的測(cè)定 Ch.P（2005） 取本品約0.1g，精密稱定，精密加硫酸滴定液(0.05mol/L) 50ml，煮沸至油滴澄清，繼續(xù)加熱10min，放冷至室溫，加甲基橙指示液12滴，用氫氧化鈉滴定液 ( 0.1 mol/L ) 滴定。每1 ml 硫酸滴定液( 0.05mol/L )相當(dāng)于2.016mg的MgO。原理：Mg(C17 H35COO)2 + H2SO4 MgSO4 + 2 C17 H35COOH2NaOH + H2SO4 Na2SO4 + 2H2O (三) 經(jīng)氧化還原后測(cè)定法1.堿性還原后測(cè)定 鹵素結(jié)合于芳環(huán)上時(shí),由于分子中碘的

7、結(jié)合較牢固,需在堿性條件下加還原劑（如鋅粉）加熱回流，使結(jié)合的鹵素轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)機(jī)的鹵素離子，然后采用銀量法（Fajans法）測(cè)定。 本法適用于測(cè)定結(jié)構(gòu)中碘與苯環(huán)直接相連，且一個(gè)苯環(huán)上含多個(gè)碘原子的含鹵素有機(jī)藥物。 例 泛影酸的測(cè)定 Ch.P (2005) 取本品約0.4g，精密稱定，加氫氧化鈉溶液30ml與鋅粉1.0g，加熱回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗滌，濾過，燒瓶與濾器用水洗滌3次，每次15ml，洗液與濾液合并，加冰醋酸5ml與曙紅鈉指示液5滴，用硝酸銀滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硝酸銀滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于20.46mg的C11H9 I 3N2O4。COOHIN

8、HCOCH3IIH3COCHN+ 11NaOH + Zn回流COONaNH2 H2N+ 3NaI + 2CH3COONa+ 2Na2ZnO2 + H2O USP (24)、BP（1998） Ch.P(2005)收載的膽影酸、碘番酸、膽影葡胺、泛影葡胺、碘他拉酸等均采用同法測(cè)定。 2. 酸性還原后測(cè)定法 取本品的干燥品約0.4g，精密稱定，加鋅粉1g及冰醋酸10ml，加熱回流30min，放冷，冷凝管用水30ml洗滌，用脫脂棉過濾，燒瓶與脫脂棉用水洗滌2次，每次20ml，洗液與濾液合并，加四溴酚酞乙酯指示液1ml ，用硝酸銀滴定液(0.1mol/L)滴定。終點(diǎn)時(shí)黃色沉淀變?yōu)榫G色。每1ml硝酸銀滴定

9、液(0.1mol/L)相當(dāng)于19.031mg的C11H12 I 3NO2。例 碘番酸的測(cè)定 JP (13)3.利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測(cè)定含量 (1)含銻藥物 (2)含鐵藥物三、經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法 適用于金屬原子與碳原子結(jié)合牢固的有機(jī)金屬藥物,即采用上述方法難以將有機(jī)結(jié)合的待測(cè)原子轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓽y(cè)定的無(wú)機(jī)離子（或氧化物、無(wú)氧酸等）的有機(jī)金屬藥物。包括：濕法破壞和干法破壞兩種。(一) 濕法破壞即酸破壞法。依據(jù)所用試劑的不同（1）硝酸高氯酸法： 經(jīng)破壞后得到的無(wú)機(jī)金屬離子一般成高價(jià)態(tài)。*此法破壞能力強(qiáng)，反應(yīng)較劇烈，所以破壞時(shí) 不能將溶液蒸干，以免發(fā)生爆炸。*本法不適合含氮雜環(huán)類有機(jī)物，破壞不

10、完全。*適合：生物樣品和含動(dòng)植物藥制劑的破壞。 （2）硝酸硫酸法： 適合大多有機(jī)物質(zhì)的破壞，無(wú)機(jī)離子均氧化成高價(jià)態(tài)。 不適合能與硫酸形成不溶性鹽的金屬離子。（3）硫酸硫酸鹽法： 常用的硫酸鹽：硫酸鉀或無(wú)水硫酸鈉。加硫酸鹽的目的：提高硫酸的沸點(diǎn)，增強(qiáng)硫酸的氧化 破壞能力以使樣品破壞完全； 防止硫酸在加熱過程中過早分解成SO2而損失。 *金屬離子以低價(jià)態(tài)存在； 常用于：含砷或銻的有機(jī)藥物的破壞As3+Sb 3+； 凱氏定氮法氮測(cè)定法。（4）其它濕法： 硝酸硫酸高氯酸法； 硫酸氧化劑法（過氧化氫法、高錳 酸鉀）破壞后，金屬呈高價(jià)態(tài)。 HNO3-H2SO4-HClO4法、 H2SO4-H2O2法、 H

11、2SO4-KMnO4法。(二) 干法破壞 適用于濕法不易破壞完全的有機(jī)物以及某些不能用硫酸進(jìn)行破壞的有機(jī)藥物。 不適用于含易揮發(fā)性金屬（如汞、砷等）有機(jī)藥物的破壞。也稱堿破壞法 有機(jī)物Ca(OH)2或Na2CO3或MgNO3(MgO)小火灼燒，炭化，高溫?zé)胱疲耆一赃_(dá)分解。*加堿Ca(OH)2或Na2CO3或MgNO3(MgO)的目 的幫助灰化完全。*中國(guó)藥典有機(jī)藥物中砷鹽檢查堿破壞法。1）加熱灼燒時(shí)溫度在420以下，以免某些被測(cè)金屬化合物揮發(fā)； 2）灰化是否完全影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度； 如需檢查灰化放冷稍過量的稀鹽酸水 （1：3）或硝酸水（1：3），振 搖，若呈色或有不溶有機(jī)物，可 在水浴

12、上將溶液蒸干，小火炭化 后，再行灼燒。 3）本法破壞后，所得灰分往往不易溶解，但 此時(shí)切勿棄去。a.石灰法： 氫氧化鈣小火灼燒炭化后，500600熾灼完全灰化，待砷轉(zhuǎn)化為非揮發(fā)性的亞砷酸鈣Ca3(AsO3)2，再依法檢查。*本法操作簡(jiǎn)單，但應(yīng)注意完全灰化，否則可使 砷斑較淺且重現(xiàn)性差。b.無(wú)水碳酸鈉堿融法: 環(huán)狀結(jié)構(gòu)的有機(jī)酸堿金屬鹽苯甲酸鈉、對(duì)氨基水楊酸鈉，采用石灰法不能破壞完全，可采用此法。c.硝酸鎂乙醇溶液法： 熾灼破壞分解有機(jī)物，使砷轉(zhuǎn)化為非揮發(fā)性的砷酸鎂Mg(AsO4)2，殘?jiān)|(zhì)輕，HCl易溶。*本法操作簡(jiǎn)單，易于灰化，并且砷能定量回收。但應(yīng)注意灰化完全，使硝酸鎂完全分解為氧化鎂。*如

13、有硝酸鹽或亞硝酸鹽殘留，則在酸性溶液中生成硝酸和亞硝酸，影響砷化氫氣體的生成。(三) 氧瓶燃燒法 （1）原理 氧瓶燃燒法：將有機(jī)藥物放入充滿氧氣的密閉燃燒瓶中進(jìn)行燃燒，并將燃燒所產(chǎn)生的欲測(cè)物質(zhì)吸收于適當(dāng)?shù)奈找褐?，然后根?jù)欲測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)，采用適宜的分析方法進(jìn)行鑒別、檢查或含量測(cè)定 適用于含鹵素、硫、氮、硒等有機(jī)藥物的分析 本法特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速、破壞完全，尤其適用于微量樣品的分析 （ 2） 儀器與材料 儀器裝置 燃燒瓶為500、1000或2000ml無(wú)色、磨口、厚壁、硬質(zhì)玻璃錐型瓶；瓶塞空心，底部熔封鉑絲一根，下端呈螺旋狀或網(wǎng)狀稱樣用材料及稱樣 A. 固體樣品 無(wú)灰濾紙 B. 液體樣品 紙袋 C

14、. 軟膏類樣品：將適量樣品置不含被測(cè)成分的蠟油紙中包裹嚴(yán)密，外層再用無(wú)灰濾紙包裹吸收液 A. 作用：吸收液的作用是將樣品經(jīng)燃燒分解所產(chǎn)生的各種價(jià)態(tài)的鹵素、硫、氮、硒等，定量地吸收并轉(zhuǎn)變?yōu)橐欢ǖ谋阌跍y(cè)定的價(jià)態(tài)。氧氣B. 吸收液的選擇氟 水 （HF） 氯 NaOH溶液(HCl)溴 H2O2-NaOH(HBr) NaOH-硫酸肼飽和溶液碘 NaOH硫酸肼飽和溶液 (少量I2、HIO3、HIO；微量HI)硫 NaOH或H2O2 （SO3） 硒 硝酸溶液（SeO2少量SeO3 ）（3）操作方法燃燒瓶燃燒前的準(zhǔn)備 用洗液洗凈后，按各藥品項(xiàng)下的規(guī)定加入吸收液，將瓶口用水濕潤(rùn)，小心急速地通入氧氣1min，立即

15、用表面皿覆蓋瓶口。樣品的準(zhǔn)備 取樣品適量，精密稱定后按規(guī)定方法包裹，固定于鉑絲下端的網(wǎng)內(nèi)或螺旋處。樣品的燃燒 點(diǎn)燃包有供試品的濾紙尾部，迅速放入燃燒瓶中，按緊瓶塞，加水少量封閉瓶口，俟燃燒完畢（應(yīng)無(wú)黑色碎片），充分振搖，使生成的煙霧完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量沖洗瓶塞及鉑絲，合并洗液及吸收液，同法另做空白試驗(yàn)。然后按各藥品項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行鑒別、檢查或含量測(cè)定。根據(jù)被燃燒分解的樣品量選用適宜大小的燃燒瓶。（4）注意事項(xiàng) Ch.P（2005）規(guī)定的燃燒瓶體積為500、1000或2000ml三種，采用常量或半微量分析。 待分解樣品量 燃燒瓶的體積 35mg（微量分析） 150250m

16、l 2030mg（半微量分析） 300500ml 5060mg 1000ml 0.60.7g或更多 2000ml或特殊結(jié)構(gòu)的燃燒瓶正確選用燃燒瓶的目的在于： 樣品能在足夠的氧氣中燃燒分解完全；有利于將燃燒分解產(chǎn)物較快地吸收到吸收液中；防止爆炸的可能性。測(cè)定含氟有機(jī)藥物時(shí)，用石英制燃燒瓶鉑絲燃燒時(shí)起催化作用應(yīng)同時(shí)做空白試驗(yàn)燃燒時(shí)要注意防爆燃燒要完全燃燒產(chǎn)生的煙霧完全被吸收例 碘苯酯的含量測(cè)定 ChP（2000）原理 碘苯酯系有機(jī)碘化物，用氧瓶燃燒分解，轉(zhuǎn)變?yōu)榈饣?，繼而氧化為游離的碘，并被定量地吸收于吸收液中，和氫氧化鈉反應(yīng)，生成碘化物與碘酸鹽，加入溴-醋酸溶液，使全部轉(zhuǎn)變?yōu)榈馑猁}，過量的溴以甲

17、酸及通空氣去除。加入碘化鉀，使與碘酸鹽反應(yīng)析出游離碘，用硫代硫酸鈉液滴定，碘與淀粉結(jié)合所顯的藍(lán)色消失即為終點(diǎn) （5）應(yīng)用 取本品約20mg，精密稱定，照氧瓶燃燒法進(jìn)行有機(jī)破壞，用氫氧化鈉試液2ml與水l0ml為吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液(取醋酸鉀10g，加冰醋酸適量使溶解，加溴0.4ml，再加冰醋酸使成1000m1)l0ml，密塞，振搖，放置數(shù)分鐘，加甲酸約lml，用水洗滌瓶口，并通入空氣流約35min以除去剩余的溴蒸氣，加碘化鉀2g，密塞，搖勻，用硫代硫酸鈉滴定液(0.02Mol/L)滴定，至近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每lml的硫代硫酸

18、鈉滴定液(0.02mol/L)相當(dāng)于1.388mg的C19H29IO2。 滴定度的計(jì)算 放大反應(yīng)2mol碘苯酯1molI21molI21molNaIO+1molNaI1molNaIO1/3molNaIO3+2/3molNaImolNaI+Br2molNaIO3即2mol碘苯酯2molNaIO32mol NaIO3+10I-6molI2即2mol碘苯酯1molI2 6molI212molI12molNa2S2O3反應(yīng)摩爾比為1698：140. 氧瓶燃燒法中的裝置有A. 磨口硬質(zhì)玻璃錐形瓶B. 磨口軟質(zhì)玻璃錐形瓶C. 鉑絲D. 鐵絲E. 鋁絲96：133（99x：138）選擇氧瓶燃燒法所必備的實(shí)驗(yàn)

19、物品A. 磨口硬質(zhì)玻璃錐形瓶B. 鉑絲C. 普通濾紙D. 氫氣 E. 無(wú)灰濾紙99：76氧瓶燃燒法測(cè)定含氯有機(jī)藥物時(shí)所用的吸收液多數(shù)為A. H2O2溶液B. H2O2NaOH溶液C. NaOH溶液D硫酸肼飽和液E. NaOH硫酸肼飽和液99：134. 氧瓶燃燒法可用于A. 含鹵素有機(jī)藥物的含量測(cè)定B. 醚類藥物的含量測(cè)定C. 檢查甾體激素類藥物中的氟D. 檢查甾體激素類藥物中的硒E. 芳酸類藥物的含量測(cè)定第二節(jié) 常用定量分析方法一、化學(xué)分析法包括重量分析和滴定分析所用儀器簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，主要用于制劑中含量較高的一些成分或礦物藥 制劑中的無(wú)機(jī)分析靈敏度低，操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，專屬性不高，對(duì)微量成分

20、測(cè)定的準(zhǔn)確性不理想（一）重量分析法 分為揮發(fā)法，萃取法和沉淀法。揮發(fā)法：測(cè)定具有揮發(fā)性或定量轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性物質(zhì)的組分含量萃取法：根據(jù)被測(cè)組份在互不相溶的兩相中溶解度不同，達(dá)到分離的目的沉淀法：將被測(cè)組份定量專為難溶性化合物，測(cè)定其含量的方法，適用于制劑中純度較高的成分。（二）滴定分析法分為酸堿滴定，沉淀滴定，配位滴定，氧化還原滴定等酸堿滴定法適用于中藥制劑中所含的生物堿，有機(jī)酸組分的含量沉淀法分為銀量法，四苯硼鈉法和亞鐵氰化鉀法等，中藥用于測(cè)定生物堿，生物堿的氫鹵酸鹽以及含鹵素的其他有機(jī)成分的含量。常用的配位滴定法包括EDTA法和硫氫酸銨法，用于測(cè)定鞣質(zhì)、生物堿及含有Ca2+、Mg2+、Fe3+

21、，Hg2+等礦物類制劑的含量氧化還原滴定法適用于測(cè)定具有氧化還原性的物質(zhì)。 是中藥及其制劑含量測(cè)定的常用方法，具有靈敏度高，精度好，造作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。 要求被測(cè)組分本身或其顯色產(chǎn)物對(duì)可見-紫外光具有選擇性吸收。 按測(cè)定波長(zhǎng)不同可分為單波長(zhǎng)光度法和計(jì)算分光光度法。二、可見-紫外分光光度法（一）單波長(zhǎng)光度法 測(cè)定前，必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶崛?，凈化，或采用專屬的顯色反應(yīng)等步驟來(lái)排除干擾。 選擇max進(jìn)行定量分析，而共存組分在此波長(zhǎng)處基本無(wú)吸收。 吸收度讀數(shù)控制在0.3-0.7之間。1. 吸收系數(shù)法 按各品種項(xiàng)下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，再以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數(shù)計(jì)算含量。用本法

22、測(cè)定時(shí)，吸收系數(shù)通常應(yīng)大于100，并注意儀器的校正和檢定。 2 對(duì)照品比較法 按各品種項(xiàng)下的方法，分別配制供試品溶液和對(duì)照品溶液，對(duì)照品溶液中所含被測(cè)成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測(cè)成分規(guī)定量的10010,所用溶劑也應(yīng)完全一致。3.標(biāo)準(zhǔn)曲線法 先配制一系列濃度不同濃度的對(duì)照品溶液,在相同條件下測(cè)定吸收度,繪制A/C曲線或求出其回歸直線方程（r0.999）,即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下測(cè)定供試品的吸光度,求得供試品中被測(cè)組分的濃度或含量. 在比色法中最常用.（二）計(jì)算分光光度法 供試液中若有兩種（兩種或兩種以上）組分共存，其紫外光譜彼此發(fā)生不同程度的重疊時(shí)，則可通過測(cè)定多個(gè)波長(zhǎng)處的吸收度，根據(jù)吸收度的

23、加和性，采用適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)處理方式進(jìn)行多組分的同時(shí)測(cè)定，或者用其排除共存組分的干擾，測(cè)定其中某個(gè)組分。 三.薄層色譜掃描法 系指用一定波長(zhǎng)的光照射在薄層板上，對(duì)薄層色譜中可吸收紫外光或可見光的斑點(diǎn)，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)用于藥品的鑒別、檢查或含量測(cè)定。 同HPLC相比：具有實(shí)驗(yàn)成本低，流動(dòng)相的選擇與更換方便等優(yōu)點(diǎn)是藥物制劑中常用的分析方法之一2005版中國(guó)藥典中有35中中成藥的含量測(cè)定才有薄層掃描法（一）基本原理一般是指波層色譜斑點(diǎn)的色譜掃描固定波長(zhǎng)，斑點(diǎn)移動(dòng)，測(cè)定A-l或F-l曲線根據(jù)波層掃描的測(cè)定方式可分為薄層吸收掃描法和薄層熒光掃描法1.薄層吸收掃描

24、法 適用于在可見、紫外區(qū)有吸收的物質(zhì)，及通過色譜前或色譜后衍生成上述化合物的樣品組分，可分別以氘燈和鎢燈為光源，在200-800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)選擇合適波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。 斑點(diǎn)中物質(zhì)的濃度與吸光度的關(guān)系需要用Kubelka-Munk理論及曲線來(lái)描述 Kubelka-Munk理論以斑點(diǎn)的相對(duì)反射率和相對(duì)透光率表示薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度，說明了固定相的散射參數(shù)SX對(duì)斑點(diǎn)中物質(zhì)的濃度與吸收度間關(guān)系的影響，從而獲得不同散射參數(shù)SX時(shí)斑點(diǎn)的A-KX理論曲線，即Kubelka-Munk曲線。 Kubelka-Munk曲線時(shí)薄層掃描法進(jìn)行定量分析的理論依據(jù) 2.薄層熒光掃描法 適用于本身具有熒光或經(jīng)過適當(dāng)處理后可產(chǎn)

25、生熒光的物質(zhì)的測(cè)定，光源用訕燈或汞燈，采用直線式掃描。 專屬性強(qiáng)，靈敏度比吸收法高1-3個(gè)數(shù)量級(jí)，最低可測(cè)到10-50pg樣品，但使用范圍窄 當(dāng)溶液濃度很稀時(shí)(ECl0.05)，熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)I0及物質(zhì)的濃度C的關(guān)系為F=2.3KI0ECl或F=KCK為常數(shù)（與熒光效率有關(guān)），L為薄層板厚度，E為吸光系數(shù) Kubelka-Munk理論不適用于薄層熒光掃描，無(wú)需進(jìn)行曲線校直 用薄層熒光掃描進(jìn)行定量分析時(shí)，用斑點(diǎn)熒光強(qiáng)的的積分值與斑點(diǎn)中組分的含量代替上式中的F與C進(jìn)行運(yùn)算。（二）定量分析方法1.方法學(xué)考察（1）工作曲線目的是：檢驗(yàn)所選擇的散射參數(shù)SX是否合適考察工作曲線是否通過原點(diǎn)，以便確定采

26、用一點(diǎn)法或兩點(diǎn)法定量確定點(diǎn)樣量的線性范圍（2）分離度： 用于限量檢查和含量測(cè)定時(shí)，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度，分離（R）的計(jì)算公式為：R=2（d2-d1）/(W1+W2) 式中：d2為相鄰兩峰中后一峰與原點(diǎn)的距離；d1為相鄰兩峰中前一峰與原點(diǎn)的距離； W1及W2為相鄰兩峰各自的峰寬。 除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.0。（3）重復(fù)性 同一供試品溶液在同一薄層板上平行點(diǎn)樣的待測(cè)成分的峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于3.0%；需顯色后測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于5.0%。（4）準(zhǔn)確度考察 常用加樣回收率來(lái)衡量，其值應(yīng)在95%-105%之間，測(cè)定數(shù)據(jù)一般為5-6個(gè)（5）統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn) 包括F檢驗(yàn)和

27、t檢驗(yàn)2.定量方法（1）外標(biāo)法（2）內(nèi)標(biāo)法（3）回歸曲線定量法外標(biāo)一點(diǎn)法外標(biāo)兩點(diǎn)法四、氣相色譜法（一）基本原理 氣化后的試樣被載氣帶入色譜柱，由于各組分在兩相間的作用不同，在色譜柱中移動(dòng)有快有慢，經(jīng)一定柱長(zhǎng)后得到分離，以此被載氣帶入檢測(cè)器，將各組分濃度或質(zhì)量變化轉(zhuǎn)化為電信號(hào)變化記錄為色譜圖，利用色譜峰保留值進(jìn)行定性分析，利用峰面積或峰高進(jìn)行定量分析。 (1) 色譜柱的理論板數(shù)(n) n（ ）tR=5.54tRW1/2=16（ ）tR W（ ）2.速率理論H=A+B/u+Cu3.分離度 2(tR2tR1) R W1W2 4.系統(tǒng)適應(yīng)性（1）色譜柱的理論塔板數(shù)（2）分離度 R1.5（3）重復(fù)性 2

28、.0%（4）拖尾因子 0.95-1.05（二）實(shí)驗(yàn)條件的選擇1.固定相的選擇2.柱溫的選擇3.載氣的選擇4.其他條件的選擇5.檢測(cè)器（三）定量分析方法（1）內(nèi)標(biāo)法加校正因子（2）外標(biāo)法（3）歸一法（4）標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法五、高效液相色譜法 （一）基本原理 (1) 色譜柱的理論板數(shù)(n) n（ ）tR=5.54tRW1/2=16（ ）tR W（ ）2.速率理論H=A+Cu（二）實(shí)驗(yàn)條件的選擇 . 色譜柱選擇 . 流動(dòng)相選擇 . 洗脫方式 . 檢測(cè)器 . 前處理（三）法分類及方法.鍵合相色譜法.膠束色譜法.反相鍵合相色譜.正相鍵合相色譜.離子對(duì)色譜法.離子抑制色譜法六、熒光分析法七、原子吸收分光光度法

29、定量分析方法的特點(diǎn)一、容量分析法 用原料藥精制品(含量99.5)或?qū)φ掌房疾旆椒ǖ木芏?，相?duì)標(biāo)準(zhǔn)差一般應(yīng)不大于0.2；進(jìn)行回收率試驗(yàn)。回收率一般在99.7100.3之間。 (一)容量分析法的特點(diǎn)(二)容量分析法的計(jì)算問題二、光譜分析法(一)UV-可見分光光度法 用適當(dāng)濃度的精制品進(jìn)行測(cè)定，其RSD一般不大于1。制劑的測(cè)定，回收率一般應(yīng)在98102之間。 線性：吸光度A一般在0.20.7，濃度點(diǎn)n5。用濃度c對(duì)A作線性回歸處理，得一直線方程，r應(yīng)大于0.999(n5)，方程的截距應(yīng)近于零。(二)熒光分析法 1.特點(diǎn) 2.熒光分析儀 3.含量測(cè)定三、色譜分析法(一) HPLC法：要求RSD2，回

30、收率98102之間。 線性范圍：用精制品配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度點(diǎn)n應(yīng)為57，用濃度c對(duì)峰高h(yuǎn)或被測(cè)物的響應(yīng)值之比進(jìn)行回歸處理，建立回歸方程，r應(yīng)大于0.999，截距應(yīng)趨于零。 專屬性：要考查輔料、有關(guān)物質(zhì)或降解產(chǎn)物對(duì)主藥的色譜峰是否有干擾，如有干擾應(yīng)設(shè)法排除(二)氣相色譜法 1.對(duì)儀器的一般要求 2.系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 3.測(cè)定法第三節(jié) 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證 一)目的 證明所采用的分析方法適合于相應(yīng)的檢測(cè)要求，方法驗(yàn)證過程和結(jié)果均應(yīng)記載在藥品標(biāo)準(zhǔn)起草和修訂說明中。 二 ) 用 途（一）藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草時(shí)，分析方法需 經(jīng)驗(yàn)證。（二）藥物合成方法變更、制劑的組分 變更、原分析方法進(jìn)行修訂時(shí)， 分

31、析方法需經(jīng)驗(yàn)證。三)需驗(yàn)證的分析項(xiàng)目1. 鑒別試驗(yàn)；2. 雜質(zhì)定量或限度檢查；3. 原料或制劑中有效成分含量測(cè)定；4. 制劑中其它成分（降解產(chǎn)物、防腐劑等）的測(cè)定；5. 溶出度、釋放度等功能檢查中的溶出量等的測(cè)試方法。 驗(yàn)證內(nèi)容有：準(zhǔn)確度、精密度（重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性）、專屬性、檢測(cè)限、定量限、線性、范圍和耐用性四 ) 驗(yàn)證內(nèi)容 一、 準(zhǔn)確度（accuracy） 準(zhǔn)確度是指用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，用百分回收率表示。 測(cè)定回收率R（recovery）的具體方法可采用“回收試驗(yàn)法”和“加樣回收試驗(yàn)法”。 回收試驗(yàn) 空白+已知量A的對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測(cè)定，測(cè)定值為M 加樣

32、回收試驗(yàn) 已準(zhǔn)確測(cè)定藥物含量P的真實(shí)樣品+已知量A的對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測(cè)定，測(cè)定值為M 數(shù)據(jù)要求 規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測(cè)定結(jié)果評(píng)價(jià)，如制備三個(gè)不同濃度樣品各測(cè)三次。1. 含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度 原料藥可用已知純度的對(duì)照品或樣品進(jìn)行測(cè)定，或用本法所得結(jié)果與已建立準(zhǔn)確度的另一方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。 制劑可用含己知量被測(cè)物的各組分混合物進(jìn)行測(cè)定，即采用在空白輔料中加入原料藥對(duì)照品的方法。 如不能得到制劑的全部組分，可向制劑中加入已知量的被測(cè)物進(jìn)行測(cè)定，或與另一個(gè)已建立準(zhǔn)確度的方法比較結(jié)果。 中藥分析的準(zhǔn)確度一般用加樣回收試驗(yàn)衡量。中藥回收率一般要求在95105%范圍內(nèi)，有些方法操作步驟繁多時(shí)，可

33、要求在90110%范圍內(nèi)。RSD一般在3%以內(nèi)。 2雜質(zhì)定量測(cè)定的準(zhǔn)確度 可向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。如果不能得到雜質(zhì)或降解產(chǎn)物，可用本法測(cè)定結(jié)果與另一成熟的方法進(jìn)行比較。二、精密度（precision） 精密度是指在規(guī)定條件下，同一個(gè)均勻樣品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。用偏差（d）、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)（變異系數(shù)，CV）表示。 偏差（d）：測(cè)量值與平均值之差標(biāo)準(zhǔn)（偏）差（SD或S）相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)（偏）差（RSD），也稱變異系數(shù)（CV） 1. 重復(fù)性 在相同條件下，由同一個(gè)分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度；在規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測(cè)定結(jié)果評(píng)價(jià)，如制備三個(gè)不

34、同濃度樣品各測(cè)三次或把被測(cè)物濃度當(dāng)作100%，至少測(cè)6次進(jìn)行評(píng)價(jià)。 2. 中間精密度 同一實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備所得結(jié)果的精密度?？疾祀S機(jī)變動(dòng)因素的影響。變動(dòng)因素為不同日期、不同分析人員、不同設(shè)備 3. 重現(xiàn)性 不同實(shí)驗(yàn)室，不同分析人員測(cè)定結(jié)果的精密度。當(dāng)分析方法將被法定標(biāo)準(zhǔn)采用時(shí)，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)。如建立藥典分析方法時(shí)通過協(xié)同檢驗(yàn)得出重現(xiàn)性結(jié)果，協(xié)同檢驗(yàn)的過程、重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說明中。 三、專屬性（specificity） 指有其他成分（雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在情況下采用的方法能準(zhǔn)確測(cè)定出被測(cè)物的特性，能反映該方法在有共存物時(shí)對(duì)供試物準(zhǔn)確而專屬的測(cè)定能力。是指

35、該法用于復(fù)雜樣品分析時(shí)相互干擾程度的度量。四、 檢測(cè)限（limit of detection， LOD） 檢測(cè)限系指試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低量。是限度試驗(yàn)參數(shù)，無(wú)需定量測(cè)定。常用%、ppm、ppb表示。1非儀器分析目視法 用已知濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。 2信噪比法 用于能顯示基線噪音的分析方法（儀器分析方法），是把已知低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，算出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。一般以信噪比（S/N）31或21時(shí)的相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測(cè)限。3數(shù)據(jù)要求 應(yīng)附測(cè)試圖譜，說明測(cè)試過程和檢測(cè)限結(jié)果。 五、定量限（1imit of quan

36、titation，LOQ） 指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，結(jié)果應(yīng)具有一定準(zhǔn)確度和精密度。常用%、ppm、ppb表示。 常用信噪比法確定定量限，一般以信噪比（S/N）為101時(shí)相應(yīng)的濃度或注入儀器的量進(jìn)行確定，也可用儀器所測(cè)空白背景響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的10倍為估計(jì)值，再經(jīng)試驗(yàn)確定。 六、 線性 在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)試結(jié)果與試樣中被測(cè)物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。 數(shù)據(jù)要求：應(yīng)列出回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性圖。七、范圍 指達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性的條件下，測(cè)試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。八、 耐用性 指測(cè)定條件稍有變動(dòng)時(shí)，結(jié)果不受影響的承受程度，為常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。是衡量實(shí)驗(yàn)室和工作人員之間在正常情況下實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性的尺度。 2. 雜質(zhì)的限量檢查除專屬性、檢測(cè)限、耐用性外，其它都不要求。雜質(zhì)的定量測(cè)定除檢測(cè)限外，其它都要求。 3. 含量測(cè)定及溶出量測(cè)定除檢測(cè)限、定量限外，其它都要求。（九）應(yīng)用 1. 鑒別試驗(yàn)除專屬性、耐用性外，其它都不要求。99：73. 精密度是指（B） A. 測(cè)得的測(cè)量