TIMP4基因的克隆、原核表達及活性測定

1、TIMP-4基因的克隆、原核表達及活性測定【摘要】目的:接納RT-PR法獵取TIP-4基因，并通過原核表達獵取具有生物活性的TIP-4交融卵白。要領:從SD大鼠心肌構造中提取總RNA，使用RT-PR法擴增出TIP-4基因，經(jīng)基因序列闡發(fā)后構建表達載體PET-28a(+)-TIP-4，轉化大腸桿菌BL21，IPTG誘導TIP-4的表達。使用N2+-NTA純化和復性后，按照其骨血瘤細胞遷徙本領的影響檢測其活性。效果:克隆到編碼序列完全準確的大鼠TIP-4基因，能在大腸桿菌中得到高效表達，表達產(chǎn)物占全菌總卵白的23.5%，N2+-NTA純化和復性后，純度達90%以上。純化后的交融卵白使骨血瘤細胞株的

2、遷徙本領得到明顯按捺。結論:通過基因克隆和原核表達的方法可以大量得到具有生物活性的TIP-4交融卵白?！娟P鍵詞】TIP-4基因克隆基因表達免疫活性Keyrds:TIP-4;genelne;expressin;viabilityassay如今對惡性腫瘤的治療尚缺乏非常有用的方法，其重要緣故原由在于腫瘤具有侵襲、轉移和基因變異等特性，對腫瘤侵襲轉移機制方面的研究成為腫瘤治療的關鍵。構造基質(zhì)布局的粉碎和腫瘤新生血管的形成是腫瘤生長、轉移得以實現(xiàn)的先決條件?；|(zhì)金屬卵白酶atrixetallprteinase，P為一類卵白水解酶家屬，它能落解多種膠原卵白、纖維毗連卵白和彈性卵白等血管基膜和基質(zhì)布局，為

3、腫瘤的生長、轉移制造符合的情況。金屬卵白酶構造按捺劑tissueinhibitrfatrixetallprteinase，TIP的創(chuàng)造是腫瘤研究上的一大打破，它是P的自然按捺劑，如今按照創(chuàng)造的時間挨次別離稱為TIP14。國表里對付TIP-4的成效已經(jīng)有了一些研究，但效果有所差異。Jiang等1的研究創(chuàng)造，TIP-4可以按捺乳腺癌細胞的凋亡，而更多的實行表白TIP-4為腫瘤生長的按捺因素2，3。為進一步開展對TIP-4在骨血瘤和軟骨血瘤方面的作用及其機制的研究，以及對其在其他范疇的成效，本實行接納分子生物學的基因克壟表達和純化等本領，力圖獵取具有生物活性的TIP-4交融卵白，為以后的研究打下基矗

4、1資料和要領1.1質(zhì)料1.2要領上游引物：5TGGAATTATGTGGGAGT3ERI卑劣引物：5GAAAGTTGATATTGGTATG3HindIII取逆轉錄產(chǎn)物2.0l為模板，按通例PR反響條件，先將樣品于94變性5in，參加2.5u的PyrbestDNA聚合酶，按以下參數(shù)循環(huán)35次：94變性1in，58退火1in，72延伸40s，末了一個循環(huán)后，72延伸10in，4保存。直接在Ni2+-NTA柱上復性5。先用10倍柱體積的復性緩沖液A洗滌，再用15倍柱體積的復性緩沖液B洗滌。末了用洗脫緩沖液洗脫目的卵白。純化的TIP-4經(jīng)卵白質(zhì)濃度測定后，-70保存。esternblt闡發(fā)區(qū)分：用10%

5、丙烯酰胺凝膠舉行SDS電泳(每孔加TIP-4純化交融卵白20l)，電泳后將卵白轉移至硝酸纖維膜上，切取條帶后在4條件下以的TIP-4單克隆抗體(1:100Siga)孵育24h，漂洗后以帶有辣根過氧化物酶的二抗37孵育30in，4-氯-1-萘酚Siga顯色。1.3統(tǒng)計學處置懲罰要領接納t查驗舉行統(tǒng)計查驗。2效果2.1TIP-4基因的得到新生4dSD大鼠心肌細胞構造總RNA，經(jīng)甲醛變性電泳，紫外檢測儀下可見齊備的28s，18srRNA，表白提取的總RNA質(zhì)量可靠，未出現(xiàn)落解。RT-PR擴增得到巨細約680bp的特異條帶，巨細與猜測效果同等見圖2。接納此片斷平端克隆入載體pBSK(+)，轉化感覺態(tài)T

6、G1，挑取重組子，經(jīng)ERI和Hind雙酶切斷定，瓊脂糖電泳見圖3，表白插入片斷巨細與猜測巨細同等。對重組質(zhì)粒中插入片斷測序，效果表白分散的TIP-4基因序列與GeneBank(gi:48255910)頒發(fā)的序列同等。2.2TIP-4的誘導表達、純化及復性接納IPTG誘導表達后創(chuàng)造，在分子量約23kD處有明顯的卵白表達條帶，該卵白巨細與理論盤算值根本同等，凝膠主動掃描闡發(fā)表現(xiàn)，其占BL21細菌總卵白的23.5%，根本是以包容體情勢存在。將大量誘導的BL21細菌超聲破裂、洗滌、溶解、純化、復性后，經(jīng)SDS電泳，考馬斯亮藍染色闡發(fā)，除TIP-4特異條帶外，根本無其他條帶，薄層掃描效果可見純度達90%

7、以上，詳見圖4、圖5。顛末esternblt闡發(fā)后表現(xiàn)所獲得的卵白質(zhì)與TIP-4抗體具有特異性作用，為TIP-4卵白見圖6。2.3TIP-4的活性測定atrigel顛末重修后在聚碳酸酯膜外貌形成雷同自然基底膜布局，對其的侵襲本領可以表現(xiàn)出腫瘤細胞的侵襲力。本研究中表現(xiàn)，TIP-4交融卵白使骨血瘤細胞侵入基底膜本領受到顯著影響，浸入的細胞數(shù)為61.35.2比較組為80.57.6，其按捺率到達25.1%(見表1)。3討論TIP-4是1996年JhnGreene等7接納已表達序列標記(expressedsequenetag，EST)序列測定的要領研究P的按捺物TIP時創(chuàng)造的，屬于TIP家屬成員中的一

8、員，按照創(chuàng)造的先后挨次而被定名為TIP-4。厥后通過免疫組化、Nrthen-Blt，RT-PR及原位雜交等要領來研究創(chuàng)造，TIP-4的構造表達相政府限，在腎臟、胰腺、結腸及直腸中的表達量非常低，在肝臟、腦、肺、甲狀腺、小腸等構造中根本無表達，但在心臟有大量的轉錄和翻譯。鑒于此，我們選擇用成熟SD大鼠的心肌細胞作為基因的構造泉源，參考GeneBank(gi:48255910)頒發(fā)的序列，應用DNAstar生物軟件方案引物，用RT-PR要領分散到了TIP-4目的基因，經(jīng)序列測定表現(xiàn)分散得到的TIP-4目的基因與文獻報道同等。這意味著在SD大鼠的心肌細胞中確實有TIP-4RNA表達，而且該研究中所接

9、納的引物方案準確且條件符合。研究中把分散到的目的基因克隆至pET-28a(+)表達載體，以大腸桿菌BL21為宿主菌舉行表達，創(chuàng)造在BL21中TIP-4的表達量可占全菌總卵白的23.5%，且根本上是以包容體的情勢存在。由于TIP-4的N端交融了6His，以是表達產(chǎn)物在溶解后接納N2+-NTA柱來純化。本研究中接納直接在N2+-NTA柱上舉行復性，使傳統(tǒng)的透析復性、稀釋復性等要領存在的服從低、喪失量大的缺點得到了很大的落服。用得到的TIP-4卵白參加造就基中創(chuàng)造，TIP-4卵白對骨血瘤的侵襲力產(chǎn)生了較大的影響，按捺率到達25.1%，這意味著所得到的TIP-4卵白具有按捺骨血瘤侵襲本領的生物學活性，

10、從而為后續(xù)的TIP-4的布局和成效研究提供了基?！緟⒖嘉墨I】1蔣曉山,黃信孚,李吉友,等.金屬卵白酶構造按捺物與乳腺癌轉移及預后的干系J.中華外科雜志,2000,38(4):291-293.2FisherKE,PpA,Kh,etal.Turellinvasinfllagenatriesrequiresrdinatelipidagnist-induedG-prtEinandebrane-typeatrixetallprteinase-1-dependentsignalingJ.laner,2022,5(12):69.3aJ,hiarelli,KzarekarP,etal.ebranetype1-

11、atrixetallprteinaseprteshuanprstateanerinvasinandetastasisJ.ThrbHaest,2022,93(4):770-778.4薩姆布魯克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T主編.金冬雁,黎孟楓主譯.分子克隆實行指南.北京:科學出書社,1999:16-87.5FrankenKL,HiestraHS,vaneijgaardenKE,etal.Puri-fiatinfhis-taggedprteinsbyibilizedhelateaffin-ityhratgraphy:ThebenefitsfrtheusefrganislventJ.PrteinExprPurif,2000,18(1):95-99.6hyeldinA,DalgardL,LuH,etal.Survivalandinva-sivenessfas