地質(zhì)微生物學(xué)：第二章 地質(zhì)微生物學(xué)研究方法

1、第二章 地質(zhì)微生物學(xué)研究方法第一節(jié) 純培養(yǎng)與顯微技術(shù)第二節(jié) 地球微生物非分子學(xué)方法第三節(jié) 地球微生物分子學(xué)方法一 微生物的分離和純培養(yǎng) 1.無(wú)菌技術(shù) 2.用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng) 3.用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng) 4.單細(xì)胞（孢子）分離 5.選擇培養(yǎng)分離 6.微生物的保藏技術(shù) 7.菌種的衰退與復(fù)壯二 顯微鏡和顯微技術(shù) 1.顯微鏡的種類及原理 2.顯微觀察樣品的制備第一節(jié) 純培養(yǎng)與顯微技術(shù)微生物個(gè)體：小利用群體研究屬性群體形式繁衍、保存人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)繁殖得到的 微生物群體為培養(yǎng)物（culture）怎樣研究？培養(yǎng)物純培養(yǎng)物混合培養(yǎng)物純培養(yǎng)能較好地得到重復(fù)結(jié)果 ， 是微生物研究的重要技術(shù)之一只有一種微

2、生物的培養(yǎng)物稱為純培養(yǎng)物（pure culture）顯微技術(shù)是微生物研究的另一項(xiàng)重要技術(shù)微生物個(gè)體小怎樣觀察？一、微生物的分離和純培養(yǎng)1、無(wú)菌技術(shù)（aseptic technique) 分離、轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)時(shí)防止其他微生物污染的技術(shù)試管、燒瓶、培養(yǎng)皿（Petri dish）等常用器皿 滅菌方法有：高壓蒸汽滅菌、高溫干熱、煮沸1）、微生物培養(yǎng)常用器皿及滅菌 接種針或接種環(huán)分離或?qū)⑽⑸飶囊粋€(gè)培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn) 接到另一個(gè)，無(wú)菌操作?；鹧媾赃吇驘o(wú)菌箱或無(wú)菌室 進(jìn)行。 接種針采用迅速加熱和冷卻的鎳鉻合金制備 液體培養(yǎng)物用無(wú)菌移液管或移液槍2）、接種操作，最基本技術(shù)無(wú)菌操作臺(tái)厭氧培養(yǎng)箱火焰旁無(wú)菌區(qū)3）、微生物的培

3、養(yǎng)方法根據(jù)氧氣的需要與否分為兩大類： 好氧培養(yǎng) 厭氧培養(yǎng) 根據(jù)培養(yǎng)基的物理特性分為兩大類： 固體培養(yǎng) 液體培養(yǎng) 好氧培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)固體（好氧）培養(yǎng)液體（好氧）培養(yǎng)2、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng) 各種菌落菌落(colony)：?jiǎn)蝹€(gè)微生物在固體 培養(yǎng)基或內(nèi)層）生長(zhǎng)繁殖形成肉眼 可見(jiàn)的，有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞 生長(zhǎng)群體。 眾多菌落連成片為菌苔（lawn）各種微生物形成的菌落特征 不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)定的特征（形狀、顏色等），是微生物分類、鑒定的重要依據(jù)。 同一細(xì)菌在不同的培養(yǎng)基上形成不同的特征菌落 培養(yǎng)平板（culture plate）是被用于獲得微生物純培養(yǎng)的最常用的

4、固體培養(yǎng)基形式平板（plate）即培養(yǎng)平板（culture plate)。融化的固體培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平皿冷卻凝固后即為平板，用于分離、培養(yǎng)微生物。 1）、稀釋倒平板法 pour plate method 常用固體分離純培養(yǎng)方法： 2）、涂布平板法 spread plate method 3）、平板劃線分離法 streak plate method 4）、稀釋搖管法 dilution shake culture method 1）、稀釋倒平板法（pour plate method) 2）、涂布平板法(spread plate method) 稀釋平板法因?yàn)榧?xì)菌與50培養(yǎng)基混合導(dǎo)致某些熱敏感菌死亡，

5、及好氧菌埋在培養(yǎng)基中缺乏氧氣影響生長(zhǎng)，所以更常用涂布平板法。3）、平板劃線分離法（streak plate method） 接種環(huán)沾取少許微生物，在無(wú)菌平板扇形、平行等劃線，隨劃線次數(shù)增加而分散開(kāi)，得到單菌落。 平行劃線后細(xì)菌生長(zhǎng)情況平皿劃線分離法A.扇形劃線; B.連續(xù)劃線; C.方格劃線4）、稀釋搖管法(dilution shake culture method） 稀釋滾管法(dilution roll tube method）厭氧微生物可用此法進(jìn)行純培養(yǎng)分離。 操作：盛培養(yǎng)基試管加熱融化，冷卻至50， 待分離材料用這些試管梯度稀釋 ，搖勻，冷凝，石蠟封口 厭氧微生物分離裝置：厭氧罐厭氧手

6、套箱 有些微生物需液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)，原生動(dòng)物、藻類。通常采用稀釋法。3、液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng) 接種物在液體培養(yǎng)基中順序稀釋，高度稀釋，每個(gè)試管中分配不到一個(gè)。若稀釋后同一梯度的平行試管中大多數(shù)（95）沒(méi)有，那么有微生物的可能是純培養(yǎng)，否則可能性下降。稀釋法缺點(diǎn)分離的優(yōu)勢(shì)菌4、單細(xì)胞（單孢子）顯微分離顯微操作（毛細(xì)吸管、液滴），專業(yè)程度高顯微分離法直接分離單細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體培養(yǎng)獲得純培養(yǎng)5、選擇培養(yǎng) 對(duì)某微生物生長(zhǎng)需要了解后，設(shè)計(jì)適合其生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)基，抑制其他菌生長(zhǎng)，即使該微生物在混雜群體中很少也可分離。 選擇培養(yǎng)的方法：1）、選擇平板培養(yǎng)2）、富集培養(yǎng)1）、選擇平板培養(yǎng) 如：耐高溫菌采用高

7、溫篩選；蛋白酶產(chǎn)生菌加牛奶篩選； 抗抗生素可采用加抗生素篩選 待分離的微生物生長(zhǎng)，其它微生物的生長(zhǎng)被抑制特定的環(huán)境條件僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長(zhǎng)待分離微生物在群落中的數(shù)量大大增加從自然界中分離到所需的特定微生物2）、富集培養(yǎng) 微生物菌種保藏技術(shù)：為何保藏？如何保藏？性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學(xué)工作最重要的基本要求，否則 生產(chǎn)或科研都無(wú)法正常進(jìn)行。 要求：菌種不死，不污染，不變異6、微生物的保藏如何保藏？根據(jù)菌種特性和保藏目的不同， 給特定環(huán)境使其存活而得以延續(xù)連續(xù)移種或改變環(huán)境條件：干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營(yíng)養(yǎng)等保藏方法？1、傳代培養(yǎng)保藏2、冷凍保藏3、干燥保藏 斜面：可保存數(shù)周至數(shù)年，可

8、用石蠟或橡皮塞 封口，低溫延長(zhǎng)保存時(shí)間。 液體：菌苔制成菌懸液，低溫（懸液保藏法） 缺點(diǎn)：繁瑣、易污染、變異喪生原有特性。1）、傳代培養(yǎng)保藏斜面、半固體瓊脂柱、液體2）、冷凍保藏液氮保藏、低溫冰箱等 液氮可達(dá)196，效果較好保護(hù)劑：甘油、血清、脫脂牛奶等注意：速凍，減少冰晶損傷細(xì)胞3）、干燥保藏沙土管保藏、冷凍真空干燥保藏沙土管：產(chǎn)孢子菌。制成孢子懸液，加無(wú)菌沙土管，減壓抽干水分，石蠟封口，冰箱保存。 冷凍真空干燥：加保護(hù)劑樣品預(yù)先冷凍，真空冰升華去水，低溫保存，保存數(shù)十年，目前最普遍、最重要的方法，菌種保藏中心多采用此法。菌種保藏時(shí)采用不同手段保藏，防止某種方法失敗導(dǎo)致菌種喪失。方法名稱主要

9、措施適宜菌種保藏期評(píng)價(jià)冰箱保藏法（斜面） 冰箱保藏法（半固體） 石蠟油封藏法* 沙土保藏法 冷凍干燥法低溫 低溫 低溫、缺氧 干燥、無(wú)營(yíng)養(yǎng) 干燥、無(wú)氧、低溫、有保護(hù)劑各大類 細(xì)菌、酵母菌 各大類* 產(chǎn)孢子微生物 各大類36月 612月 12年 110年 515年以上簡(jiǎn)便 簡(jiǎn)便 簡(jiǎn)便 簡(jiǎn)便有效 簡(jiǎn)便有效菌種保藏方法比較 菌 連續(xù)在培養(yǎng)基上（內(nèi)） 移種 種 傳代培養(yǎng)保藏法 連續(xù)在活宿主上（內(nèi)）移種 保 生活態(tài) 固體斜面 藏 濕法 半固體瓊脂柱 方 液體介質(zhì)（蒸餾水、糖液、其它溶液） 法 休眠態(tài) 干法 藏在玻璃管內(nèi) 吸附在合適的載體上菌種保藏方法總結(jié)國(guó)內(nèi)外菌種保藏機(jī)構(gòu)中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)(CCC

10、CM) 美國(guó)的典型菌種保藏中心(ATCC) 英國(guó)國(guó)家典型菌種保藏所（NCTC） 法國(guó)里昂巴斯德研究所（IPL） 1）、衰退（degeneration） 菌種在培養(yǎng)或保藏過(guò)程中，由于自發(fā)突變的存在，出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記的丟失等現(xiàn)象，稱為菌種的衰退。 7、菌種的衰退與復(fù)壯常見(jiàn)的衰退現(xiàn)象 菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變； 生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少； 抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。 代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對(duì)宿主寄生能力下降。防止菌種衰退的方法（1）控制傳代次數(shù) （2）選擇合適的培養(yǎng)條件； （3）采用不宜衰退的細(xì)胞進(jìn)行傳代（4）采用有效的菌種保藏方法。2）、菌種的復(fù)壯（rejuvenatio

11、n）使衰退的菌種恢復(fù)原來(lái)優(yōu)良性狀。 狹義的復(fù)壯：從衰退的群體中找出未衰退的體 廣義的復(fù)壯：利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選育優(yōu)良菌種。菌種的復(fù)壯措施（1）純種分離（2）通過(guò)寄主體內(nèi)生長(zhǎng)進(jìn)行復(fù)壯（3）淘汰已衰退的個(gè)體二、顯微鏡和顯微技術(shù)（一）、顯微鏡的種類及原理 1、普通顯微鏡 2、暗視野顯微鏡 3、相差顯微鏡 4、熒光顯微鏡 5、透射電子顯微鏡 6、掃描電子顯微鏡 7、掃描隧道顯微鏡（二）、顯微觀察樣品的制備 1、光學(xué)顯微鏡的制樣 2、電子顯微鏡的制樣決定顯微觀察效果重要因素：分辨率和反差 分辨率：辨別兩點(diǎn)之間最小距離的能力 反差：樣品與背景區(qū)別程度 （一）、顯微鏡種類和原理：1、普通顯微

12、鏡 機(jī)械裝置：鏡座、支架、載物臺(tái)、調(diào)焦螺旋 光學(xué)系統(tǒng)：物鏡、目鏡、聚光器 0.5 l 分辨率（最小可分辨距離）= n sin q 分辨率與所用波長(zhǎng)成反比！分辨率與數(shù)值孔徑值(n sin ) 0.5 l 分辨率（最小可分辨距離）= n sin q 浸沒(méi)油與玻璃的折射率相近很多原來(lái)由于在透鏡及載片表面的反射和折射而損失的 光線可以進(jìn)入物鏡，使照明亮度提高，改善觀察效果?？諝猓╪=1.0）、水（n=1.33）、香柏油（n=1.52）光學(xué)顯微鏡一般配置的最大放大倍數(shù)是多少？為什么？目鏡：10 15 ；物鏡： 100 ；總放大倍數(shù)10001500 如何實(shí)現(xiàn)光學(xué)顯微鏡一般配置的最大放大倍數(shù)？其原理？ 使用

13、油鏡，即在100 物鏡和載玻片之間滴加香柏油； 香柏油與玻璃折射率相近2、暗視野顯微鏡 活細(xì)菌在普通顯微鏡下是透明，觀察不清，采用暗視野顯微鏡，如：黑夜看星星就很清楚。無(wú)標(biāo)本時(shí)，視野黑暗。有標(biāo)本時(shí)，光線傾斜照在標(biāo)本上，標(biāo)本遇光發(fā)生反射和散射，散射的光進(jìn)入物鏡，物體明亮可見(jiàn)。 特殊聚光器實(shí)現(xiàn)斜射照明，給樣品照明的光線不直接穿過(guò)物鏡，而經(jīng)樣品反射或折射后進(jìn)入物鏡，使樣品與背景差別大，可以清楚看到透明微小顆粒。用于：生活細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性觀察。3、相差顯微鏡 光線透過(guò)透明標(biāo)本，波長(zhǎng)（顏色）和振幅（亮度）沒(méi)有多大變化，用普通顯微鏡觀察透明標(biāo)本，其形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)難以分辨。由于細(xì)胞各部分折射率和厚度不同，當(dāng)光線通

14、過(guò)時(shí)，直射光和衍射光光程有差別，而人眼看不到，但是可通過(guò)相差顯微鏡看到。 相差顯微鏡采用特殊光學(xué)裝置：環(huán)狀光闌和相差板，利用光的干涉，將光的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭梢?jiàn)的振幅差（明暗），使能不染色而看到活細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的某些顯微結(jié)構(gòu)。其發(fā)明人F.Zernike因此獲1953年諾貝爾物理獎(jiǎng)。 相板上和環(huán)狀光闌相對(duì)應(yīng)的環(huán)狀部分大多數(shù)是涂的吸收膜和推遲相位膜，其他部分完全透明。從標(biāo)本上射過(guò)來(lái)的光線，衍射光部分穿過(guò)透明區(qū)；直射光則穿過(guò)相板的環(huán)狀部分，光強(qiáng)度減弱，相位也適當(dāng)改變。一般所用的相板推遲相位1/4，吸收80的直射光，這樣，就使直射光和衍射光的強(qiáng)度接近，而相位差則增大或減少。由于透明標(biāo)本內(nèi)部構(gòu)造的折射率不

15、同，產(chǎn)生衍射光的相位就會(huì)有不同程度的推遲，衍射光和直射光的干涉作用將相位差變成振幅差。正相差-衍射光推遲1/4波長(zhǎng)負(fù)相差-直射光推遲1/4波長(zhǎng)4、熒光顯微鏡 熒光素吸收uv放出波長(zhǎng)較長(zhǎng)的可見(jiàn)光，因此在uv照射下，發(fā)熒光的物體會(huì)在黑暗背景顯現(xiàn)為光亮有色物體，為熒光顯微技術(shù)原理。在免疫學(xué)和分子生物學(xué)應(yīng)用廣泛。5、透射電子顯微鏡（簡(jiǎn)寫(xiě)TEM）用波長(zhǎng)短的電磁波取代可見(jiàn)光，使分辨率提高。工作原理類似，因光源不同，有區(qū)別: 1）電子若遇空氣中分子會(huì)發(fā)生偏轉(zhuǎn)使物象不清楚，因此鏡筒高真空 2)電子帶電荷，電鏡是用電磁圈使之聚焦 3)電子像人眼看不到，用熒光屏顯示或感光膠片記錄大腸桿菌 透射電子顯微鏡圖電子顯微

16、鏡的分辨能力遠(yuǎn)高于光學(xué)顯微鏡6、掃描電子顯微鏡（SEM） 掃描電子顯微鏡大腸桿菌掃描電鏡圖工作原理與光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡不同，是電子束掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，電子產(chǎn)生多少與標(biāo)本表面立體形貌有關(guān)。電子經(jīng)探測(cè)器收集，經(jīng)光電倍增管和放大器，產(chǎn)生樣品立體圖像于熒光屏上。 主要用于：樣品表面結(jié)構(gòu)7、掃描隧道顯微鏡（STM）80年代出現(xiàn)的，原理：利用量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)。 其橫向分辨率：0.10.2nm，縱向分辨率：0.001nm 這種分辨率足以對(duì)單個(gè)原子觀察。 利用這種顯微鏡直接觀察蛋白質(zhì)、DNA、RNA等以及CM、virus等結(jié)構(gòu)。掃描隧道顯微鏡下的DNA（二）、顯微樣品制備樣品好壞直接

17、影響觀察結(jié)果。 考慮因素：根據(jù)所用顯微鏡特點(diǎn)采用合適制樣方法，盡可能使樣品生理結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，采用各種方法提高反差。顯微樣品制備之 光學(xué)顯微鏡制樣光學(xué)顯微鏡制樣活體觀察染色壓滴法懸滴法菌絲埋片法活菌死菌美藍(lán)染色簡(jiǎn)單染色鑒別染色革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢染色 特點(diǎn)：避免染色對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，用于運(yùn)動(dòng)性、攝食特性、生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中形態(tài)變化等觀察 壓滴法：菌懸液滴載玻片，加蓋玻片直接觀察 懸滴法：蓋玻片滴一滴菌懸液，反轉(zhuǎn)置于特制凹載玻片直接觀察 菌絲埋片法：無(wú)菌小玻璃紙鋪平板表面，涂布孢子懸液，培養(yǎng)后，取下玻璃紙置于載玻片，觀察 光學(xué)顯微鏡樣品制備活體觀察 活體觀察難看到微生物的細(xì)致形態(tài)和結(jié)構(gòu)，需染色觀察。

18、染色前需要對(duì)樣品固定，目的：殺死細(xì)菌使菌體黏附在玻片上；還可增加對(duì)染料的親和力。 常用：酒精火焰加熱和化學(xué)固定兩種方法 光學(xué)顯微樣品制備染色觀察大腸桿菌革蘭氏染色 枯草桿菌革蘭氏染色電鏡制樣顯微樣品制備之 樣品觀察前要固定和干燥，一般要重金屬鹽染色或噴鍍，提高反差，使電子圖像清晰。透射電鏡制樣 覆蓋有支持網(wǎng)的載網(wǎng)（一般為銅網(wǎng)、不銹鋼、金、銀等） 負(fù)染技術(shù)： 電子密度高、本身不顯示結(jié)構(gòu)、與樣品幾乎不反應(yīng)的物質(zhì)，如：磷鎢酸鈉進(jìn)行染色。 重金屬鹽不被樣品吸附沉積在四周，若樣品具有表面結(jié)構(gòu)，重金屬鹽就進(jìn)入表面凹陷部分，通過(guò)散射電子能力差異把樣品外形和表面結(jié)構(gòu)襯托出來(lái)。 負(fù)染技術(shù)簡(jiǎn)便易行，病毒、細(xì)菌鞭毛

19、、離體細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和核酸可用此方法觀察。投影技術(shù)： 真空蒸發(fā)設(shè)備將鉑或鉻等對(duì)電子散射能力強(qiáng)的金屬原子，由樣品斜上方噴鍍，提高樣品反差?？捎糜诓《?、細(xì)菌鞭毛、離體細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和核酸等觀察。 超薄切片技術(shù)： 微生物個(gè)體雖小，微弱電子束無(wú)法透過(guò)整體標(biāo)本，需制成100納米以下的超薄切片才能看清內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)?；静僮鬟^(guò)程：取樣、固定、脫水、浸透與包埋、切片、撈片、染色、觀察。 透射電鏡制樣 第二節(jié) 地球微生物非分子學(xué)方法一 具有地質(zhì)作用的微生物的檢測(cè)和分離 1.現(xiàn)場(chǎng)觀察地球微生物事件 2.分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)二 樣品 1.地面/地下樣品 2.水樣樣品 3.樣品中活性物質(zhì)的分離和鑒定 原位地質(zhì)微生物活性

20、研究 進(jìn)行中的地質(zhì)微生物活動(dòng)的原位考察 自然界中的地質(zhì)微生物學(xué)過(guò)程模擬 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)物的研究一 具有地質(zhì)作用的微生物的檢測(cè)和分離 1.現(xiàn)場(chǎng)觀察地球微生物事件 為了檢測(cè)地質(zhì)微生物的活性,可視途徑包括肉眼觀察、光學(xué)顯微鏡觀察、透射電鏡觀察。 藻類、地衣-直接觀察；土壤、泥沙中-掩埋載玻片、毛細(xì)管，熒光顯微鏡；微生物化石-透射電鏡和掃描電鏡。 2.分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè) 分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，可以定位和計(jì)量環(huán)境樣品中的微生物，甚至包括雖然存活但在實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有純培養(yǎng)的微生物。二 樣品1.地面/地下樣品 對(duì)于地下3000-4000或者更深的巖石樣品，要通過(guò)特殊的鉆取裝置。2.水樣樣品 需要特殊裝置。范多恩采水器，可以獲得任何給定深度處的樣品。尼斯金采水器。 水底的泥沙樣品，采用挖泥機(jī)或取芯裝置。 3. 樣品儲(chǔ)存 如不能立即檢測(cè)，需要冷凍。 4.樣品中活性物質(zhì)的分離和鑒定 富集跟純培養(yǎng)范多恩采水器，尼斯金采水器。、原位地質(zhì)微生物活性研究 沉積層中遠(yuǎn)古時(shí)代地質(zhì)微生物活動(dòng)，；利用生物標(biāo)志化合物推測(cè)以前發(fā)生過(guò)的地質(zhì)微生物活動(dòng)。葉綠素、脂類、胡蘿卜素、甲基藿烷 同位素識(shí)別發(fā)生在地質(zhì)史的過(guò)去的地質(zhì)微生物活動(dòng)。生物對(duì)