食品微生物學(xué)檢驗(yàn)GB-4789-系列知識(shí)點(diǎn)總結(jié)

1、食品微生物學(xué)檢驗(yàn) GB-4789-系 列知識(shí)點(diǎn)總結(jié) 作者:日期:食品微生物學(xué)檢驗(yàn)GB 4789系列知識(shí)點(diǎn)匯總GB 4789.1-2016食品衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn) 總則一、2016版總則變更內(nèi)容.刪除了標(biāo)準(zhǔn)中的英文名稱、起草單位變更為中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì) 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局。.刪除了規(guī)范性引用文件。.修改了實(shí)驗(yàn)室基本要求:產(chǎn)應(yīng)具有相應(yīng)的 微生物專業(yè)教育或培訓(xùn)經(jīng)歷 （如生物學(xué)、植物學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)與工程、食品質(zhì)量與安全等與微生物有關(guān)的相關(guān) 專業(yè)），具備相應(yīng)的資質(zhì)（應(yīng)有崗位上崗證、 生物安全上崗證和壓力容器上崗證），能夠 理解并正確實(shí)施檢驗(yàn)。人員修改為檢驗(yàn)人員啦掌握實(shí)驗(yàn)室生物安全操作

2、和消毒知識(shí)（相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及培訓(xùn)，如 GB 19489-2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求、消毒技術(shù)規(guī)范（2002）。應(yīng)在檢驗(yàn)過程中保持 個(gè)人整潔與衛(wèi)生，防止 人為污染樣品。+應(yīng)在檢驗(yàn)過程中遵守相關(guān)安全措施的規(guī)定, 確保自身安全。.有顏色視覺障礙的人員不能從事涉及辨色的實(shí)驗(yàn)（即無顏色視覺障礙）環(huán)境與設(shè)施-突出溫度、濕度和潔凈度。生物危害程度應(yīng)與實(shí)驗(yàn)室生物防護(hù)水平相適應(yīng)第一類:引起人和動(dòng)物非常嚴(yán)重疾病，國(guó)家未發(fā)現(xiàn)或已宣布消滅的微生物，如天花病毒。一第二類:引起任何動(dòng)物比較嚴(yán)重疾病，在人和人、人和動(dòng)物之間傳播如霍亂弧菌。病原微生物分類r第三類:引起疾病，但對(duì)人、動(dòng)物或者環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害如沙門氏菌、單增李斯

3、特氏菌。*第四類:通常不會(huì)引起人或動(dòng)物疾病的微生物Of 一級(jí)（BSL-1：操作第四類病原微生物（屬 于正壓，適用范圍如大腸埃希氏菌、枯草芽抱桿菌等。重要設(shè)備是超凈工作臺(tái)，它可以 保護(hù)樣品不受污染。）實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別一二級(jí)（BSL-2 :操作第三類病原微生物（屬于負(fù)壓，適用范圍如沙門氏菌、等致病菌。重要設(shè)備是II級(jí)生物安全柜。）一三級(jí)（BSL-3：操作第二類病原微生物四級(jí)（BSL-4 :操作第一類病原微生物消毒：是殺死微生物的物理或化學(xué)手段，但不一定殺死其中的抱子滅菌：是殺死和去除所有微生物及其中抱子的過程。廠 紫外線消毒（臭氧）環(huán)境：潔凈室消毒z膽熏蒸（如空間被霉菌污染可用甲醛熏蒸法消毒）一

4、消毒劑表面消毒L濕熱滅菌或常用高壓滅菌干熱滅菌（180 c微生物實(shí)驗(yàn)室消毒滅菌方式一平皿工器具滅菌和設(shè)備消毒1h或170c2h）廠濕熱滅菌或高壓滅菌1培養(yǎng)基和試劑火菌-煮沸火菌J過濾除菌紫外線消毒法：紫外燈管放射一定波長(zhǎng)，破壞細(xì)菌或病毒的DNA和 RNA,使他們喪失生存能力和繁殖能力，從而達(dá)到滅菌目的。紫外線 的特點(diǎn)是對(duì)芬胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞都能起作用，但細(xì)菌芬抱和霉菌芬胞對(duì)其 抵抗力大，且紫外線穿透力極低，所以只能用于表面滅菌，對(duì)固體物 質(zhì)滅菌不徹底。微生物實(shí)驗(yàn)室消毒處理方法：最佳殺菌波長(zhǎng)：260nm,需定期更換。有效殺菌距離p物品：25-60cmf空氣：V2m照射時(shí)間：燈亮5-7min后開始計(jì)算，

5、 30min （無人條件下打開） 適用范圍：室內(nèi)空氣、物體表面。注意事項(xiàng)：人員需在關(guān)閉紫外燈至少30min后方可入內(nèi)作業(yè)。檢驗(yàn)用品-增加附錄A和一次性用品。附錄A微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢驗(yàn)用品和設(shè)備高壓鍋 滅菌效果評(píng)價(jià)方法 武化學(xué)指示劑：即化學(xué)指示卡/膠帶，使 用方便，高壓后可立即得知檢測(cè)結(jié)果。f生物指示劑：準(zhǔn)確性高，高壓后需要培 養(yǎng)后才得知檢測(cè)結(jié)果。培養(yǎng)基和試劑質(zhì)控-GB4789.28-2013質(zhì)控菌株-新增實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定的野生菌株。.修改了樣品采集采樣原則：樣品的采集應(yīng)遵循隨機(jī)性、代表性的原則；采樣過程遵循無菌操作程序，防止一切可能的外來污染。采樣方案：根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康?、食品特點(diǎn)、批量、檢驗(yàn)方法、

6、微生物的威海程度等確定采樣方案。采樣方案分為二級(jí)好三級(jí)采樣方案。二級(jí)采樣方案設(shè)有n、c和m值, 三級(jí)采樣方案設(shè)有n、c、m和M值。（其中n表示桶一批次產(chǎn)品應(yīng)采集的樣品件數(shù)；c表示最大可允許超出m值得樣品數(shù)；m表示微生物 指標(biāo)可接受水平限量值（三級(jí)采樣方案）或最高安全限量值（二級(jí)采樣 方案）；M表示微生物指標(biāo)的最高安全限量值。）注意事項(xiàng)：按照二級(jí)采樣方案設(shè)定的指標(biāo)，在 n個(gè)樣品中，允許有w c個(gè)樣品其相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值大于 m值。按照三級(jí)采樣方案設(shè)定的指標(biāo)，在n個(gè)樣品中，允許全部樣品中相應(yīng) 微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值w m值；允許有w c個(gè)樣品其相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn) 值在m值和M值之間；不允許有樣品相應(yīng)微

7、生物指標(biāo)檢驗(yàn)值大于M值。.修改了檢驗(yàn)一“樣品檢驗(yàn)”.修改了生物安全和質(zhì)量控制（優(yōu)化）.修改了記錄與報(bào)告檢驗(yàn)過程中應(yīng)即時(shí)、客觀地記錄觀察到的現(xiàn)象、結(jié)果和數(shù)據(jù)等信息。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按照檢驗(yàn)方法中規(guī)定的要求，準(zhǔn)確、客觀地報(bào)告檢驗(yàn)結(jié)果。.修改了檢驗(yàn)后樣品的處理檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告后，被檢樣品方能處理；檢出致病菌的樣品要經(jīng)過無害化處理；檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告后，剩余樣品和同批產(chǎn)品不進(jìn)行微生物項(xiàng)目的復(fù)檢。二、2016版總則具體要求各種微生物危害分類采樣分級(jí)危害程度微生物學(xué)指標(biāo)三級(jí)食品保質(zhì)期菌落總數(shù)、霉菌和酵母間接才旨示菌大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希 氏菌、腸桿菌科、金黃色葡萄球菌中等程度局限傳播葡萄球菌腸毒素、副溶血性弧菌、蠟

8、樣芽胞桿菌、產(chǎn)氣夾饃梭菌二級(jí)中等程度廣泛傳播沙門氏菌、諾如病毒、腸出血大腸埃柞氏困嚴(yán)重程度O1型霍亂、肉毒梭菌單核細(xì)胞增生李斯特氏菌嬰兒食品沙門氏菌赫爾阪崎腸桿菌在中等以上甚至嚴(yán)重危害的情況下，使用二級(jí)采樣方案。對(duì)健康危害低的，則建議使用三級(jí)采樣方案。分級(jí)抽樣方案：同批食品總微生物數(shù)量一般是正態(tài)分布， 表明同批次具有均一性。但對(duì)于單一檢樣來說，微生物分布或數(shù)量一般不會(huì)均勻（液態(tài)食品除外）。這樣的不均一型造成中驗(yàn)結(jié)果判讀困難。N越大越準(zhǔn)確，但是應(yīng)考慮適度嚴(yán)格性的要求。三、2016版總則相關(guān)質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制示意圖實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)能力驗(yàn)證陽(yáng)性加標(biāo)質(zhì)控樣品人員比對(duì)技術(shù)考核檢驗(yàn)人員的質(zhì)量控制（實(shí)施考核

9、、監(jiān)督方式）：.問答、試題.盲樣測(cè)試.加標(biāo)測(cè)試.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部人員對(duì)比raH刖!林發(fā)薪.復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)：A煌綠乳糖膽鹽肉湯BGLB成分：蛋白月東、乳糖、牛膽粉溶液、0.1%煌綠水溶液）的作用：蛋白月東在培養(yǎng)基中作為基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供細(xì)菌生長(zhǎng)所需的碳源、氮牛膽鹽和煌綠抑制革蘭氏陽(yáng)性菌及非大腸菌群的革蘭氏陰性菌的 生長(zhǎng)。乳糖作為可發(fā)酵的碳水化合物。B、接種方式：1環(huán)產(chǎn)氣的LST+10mlBGLGC 培養(yǎng)條件：36C, 48 2h。D結(jié)果觀察：小導(dǎo)管是否產(chǎn)氣。.結(jié)果報(bào)告表大腸菌群最可能數(shù)MPN僉索表陽(yáng)性管數(shù)MPN95%M信限陽(yáng)性管數(shù)MPN95%可信限0.100.010.001下限上限0.100.010.001

10、下限上限0001100420-注1:本表采用3個(gè)稀釋度0.1g (ml)、0.01g (ml)、0.001g (ml),每個(gè)稀釋度接種 3管。注2：表內(nèi)所列檢樣量如改用1g (ml)、0.1g (ml)、0.01g (ml)時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用 0.01g (ml)、0.001g (ml)、0.0001g (ml)時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高10倍，其余類推。根據(jù)陽(yáng)性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中含菌量的最近似數(shù)值。MPN僉索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用其他稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。平板計(jì)數(shù)法，僉樣 25g ( ml )10母梯需同時(shí)用生理選擇2 3個(gè)適宜違續(xù)稀釋

11、度的361C18-24h計(jì)數(shù)典型BGLB 361C24-48h.培養(yǎng)基：結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA 原理：乳糖作為可發(fā)酵碳源；膽鹽和結(jié)晶紫抑制革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng);中性紅為酸堿指示劑。大腸菌群特點(diǎn)：紫紅色菌落，周圍紅色膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm 更大。培養(yǎng)基傾注方法：每個(gè)平皿傾注15-20ml,凝固后再加3-4ml覆蓋, 防止菌落蔓延生長(zhǎng)，影響結(jié)果。.平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15-150CFU之間的平板計(jì)數(shù)。分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑菌落（如菌落直徑較典型菌落 ?。Ｗ畹拖♂尪绕桨宓陀?5CFUW記錄具體菌落數(shù)。.驗(yàn)證試驗(yàn)從VRBAT板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，少于

12、10個(gè)菌落的挑取全部典型和可疑菌落。移種于BGL附湯管，361C培養(yǎng)24-48h,觀察產(chǎn)氣凡BGL明湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。.平板計(jì)數(shù)的報(bào)告BGLB陽(yáng)性管數(shù)比例乘以計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)， 乘以稀釋倍數(shù)，即為每g(ml)樣品中大腸菌群數(shù)。例如：樣品稀釋度典型和可疑菌落數(shù)選取驗(yàn)證菌落BGLB陽(yáng)性管結(jié)果 CFU/g(ml)10-4100106100*(6/10)*104=6.0*10510-100010注意事項(xiàng)：樣品PH調(diào)節(jié)方法：添加NaOH調(diào)節(jié)在36 士 1C培養(yǎng)24-48h的意義：24h為預(yù)判，若預(yù)判未產(chǎn)氣繼續(xù)培 養(yǎng)到48h最終確定結(jié)果。若典型菌落和可疑菌落超過10個(gè)，應(yīng)挑取10個(gè)典型和可

13、疑菌落接 種驗(yàn)證；若少于10個(gè)菌落的則挑取全部典型和可疑菌落接種進(jìn)行驗(yàn)證。 定大腸菌群。若BGL的湯變成黃綠色，則產(chǎn)酸導(dǎo)致。大腸菌群類細(xì)菌可發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣,因此主要看小導(dǎo)管產(chǎn)氣情況來確在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)中，經(jīng)?？梢钥吹皆谛?dǎo)管內(nèi)有極微小的氣泡， 有 時(shí)可以看到沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。如果對(duì)產(chǎn)氣不明顯的乳糖發(fā) 酵現(xiàn)象有疑問，可以輕輕拍打試管，如有氣泡沿管壁上浮，即可能有 氣體產(chǎn)生。GB 4789.4-2016食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)一、沙門氏菌簡(jiǎn)介.細(xì)菌學(xué)分類：腸桿菌科沙門氏菌屬下設(shè) 6個(gè)亞屬：I、II、IV、V、VI 及III （原亞利桑那菌屬）。.致病性：胃腸炎、傷寒、敗血癥（傷寒氏沙門易患

14、敗血癥）等人類疾病，嚴(yán)重時(shí)能導(dǎo)致死亡。.種類：種類繁多，抗原結(jié)果復(fù)雜，在ANTIGENICFORMULAE OF THE SALMONELLA SEROVAR2007 9th edition）中已公布了 257辦血清型。.感染途徑：食物，主要是生肉和生蛋。.生物學(xué)特征：形態(tài)特征：革蘭氏陰性、短桿菌，無芽抱，一般無莢膜；除雞沙門氏菌和雛沙門氏菌外都有周身鞭毛，運(yùn)動(dòng)力特強(qiáng)。需氧或兼性厭氧，10-42C都可以生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為37C,最適 PH6.878。綜上所述：沙門氏菌為革蘭氏陰性、需氧或兼性厭氧、無芽抱的短桿菌。二、沙門氏菌的檢驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)樣品處理I25g (ml)樣品+225mlBPW

15、36 1 C 1 8-18hIm1ml前增菌液+10mlTTB1ml前增菌液+10mlSC4 421C. 18-24h 1I361C. 18-24h選BSXLD (或HE、沙門顯色培養(yǎng)基)361C, 40-48h J36TC 18-24h挑取引島I洛沙門菌非沙門白菌多價(jià)皿清鑒定 f血清學(xué)分型（選做）TSI,賴氨酸，NA,靛基質(zhì)，尿素（PH7.2）, KCN生化鑒定H2S+H2S+H2S-反應(yīng)試劑盒或靛基質(zhì)-靛基質(zhì)+靛基質(zhì)-結(jié)果全自動(dòng)微尿素-尿素-尿素-與左生物生化KCN-KCN-KCN-側(cè)描述鑒定系統(tǒng)+賴氨酸+賴氨酸+賴氨酸+/-不符甘露醇+、山梨醇+ONPG-血潔牛報(bào)告JILL in J1.前增菌注意事項(xiàng)：若樣品為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻即可。如需測(cè)定 PH值，用1mol/L無菌NaOH或