分離科學(xué)實驗講義

1、固相萃取高效液相色譜法測定水溶液中的腺嘌吟核苷【實驗?zāi)康摹空莆展滔噍腿∏疤幚順悠返幕静襟E及方法熟悉高效液相色譜儀的一般使用方法【實驗原理】固相萃?。⊿PE）分離是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，使其與樣品 的基體或干擾化合物分離，然后再用適當(dāng)?shù)娜軇┫闯s質(zhì)，最后用適當(dāng)溶劑洗脫目標(biāo)化合物 從而達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的。腺嘌吟核昔是生物細(xì)胞維持生命活動的基本組成元素之一，參與DNA的代謝過程，在體 內(nèi)許多系統(tǒng)和組織有著廣泛的生理學(xué)作用，具有抗腫瘤、抗病毒、基因治療等多種生物活性。本實驗利用固相萃取一高效液相色譜的方法，實現(xiàn)了水溶液中的腺嘌吟核昔與其結(jié)構(gòu)類 相似物2-脫氧鳥嘌吟核

2、昔，鳥嘌吟核昔，胞7嘧啶核昔，尿嘧啶核昔，胸腺嘧啶核昔的定 量分離。當(dāng)樣品雜質(zhì)的極性目標(biāo)物的極性，用反相模式。采用固相萃取C18柱。洗脫劑的選擇，洗雜質(zhì)、目標(biāo)物時極性相似。目標(biāo)物與雜質(zhì)同時吸附，而樣品中雜質(zhì) 的極性目標(biāo)物的極性時，先用極性大的溶劑，將雜質(zhì)洗下來（15%甲醇），再用極性小的 溶劑洗脫目標(biāo)物（50%甲醇）。必須活化，才能與溶質(zhì)產(chǎn)生重線性。先用強(qiáng)溶劑預(yù)洗，以消除小柱上在生產(chǎn)或儲存過 程中可能帶入的污染物，避免在色譜圖上出現(xiàn)與樣品無關(guān)得雜質(zhì)峰。反相選甲醇。 然后 再用較弱的甲醇-水，洗脫潤濕小柱，從而保證樣品在柱上有足夠的保留與回收率。 潤 濕能打開卷曲在硅膠表面上的烷基鏈，使溶質(zhì)與鍵

3、合相之間充分接觸。上樣溶劑：水;淋洗：510弱溶劑（水-緩沖液或甲醇-水）；洗脫劑：溶劑強(qiáng)度上樣溶劑，用小體積 洗目標(biāo)產(chǎn)物。分別接洗脫后溶液，進(jìn)色譜C18柱，極性小的后出柱。【儀器和試劑】高效液相色譜儀；ODS色譜柱；固相萃取儀；C18固相萃取柱；腺嘌吟核昔（A），2-脫氧鳥嘌吟核昔（2-dG），鳥嘌吟核昔（G），胞嘧啶核昔（C），尿嘧 啶核昔（U），胸腺嘧啶核昔（T），甲醇，混合磷酸鹽緩沖液等?！緦嶒灢襟E】1.色譜條件色譜柱：ODS柱(250X4.6mmID, 5 m)；流動相：12.5%甲醇+PH4.0磷酸鹽緩沖液；檢測波長：260nm；柱溫：25C ；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：2

4、0p L。腺嘌吟 核苷tR： 10.6min, 2-脫氧鳥嘌吟核苷tR： 6.7min，鳥嘌吟核苷tR： 5.8min,胞嘧啶核苷tR： 3.4min，尿嘧啶核苷tR： 4.7min，胸腺嘧啶核苷tR： 8.0min。溶液的配制1.0mM/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別精密稱取鳥嘌吟核苷0.0071g, 2-脫氧鳥嘌吟核苷0.0067g,腺嘌吟核苷0.0067g,胞嘧啶核苷0.0061g,胸腺嘧啶核苷0.0061g,尿嘧啶核苷 0.0061g于25mL容量瓶中，用三蒸水定容至刻度，搖勻。20MM/L混和標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別精密吸取上述各標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.5mL于25mL容量瓶中，用三蒸 水定容，搖勻。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制

5、備精密吸取20p M/L混和標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用三蒸水逐級稀釋成10，5, 2.5, 1.0，0.5|J M/L，用微量注射器分別吸取上述各混和標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣20p L，記錄色譜圖。 以各核苷的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法回歸成線性方 程。固相萃取4.1固相萃取柱的活化 將C18固相萃取柱依次用10mL甲醇及10mL的純凈水活化。4.2上樣 取2mL樣品溶液，開啟真空系統(tǒng)，使溶液連續(xù)通過活化過的C18萃取柱，保持 流速1-2ml/min進(jìn)行固相萃取，收集上樣溶液。當(dāng)所有的樣品穿過萃取柱后，繼續(xù)真空抽 吸1min，使柱子干燥，關(guān)閉真空泵。4.3淋洗 開啟真空系統(tǒng)，用3mL1

6、5%甲醇淋洗C18萃取柱，收集淋洗樣品。4.4洗脫 開啟真空系統(tǒng)，用3ml50%甲醇洗脫MIP小柱，收集洗脫液。固相萃取樣品的檢測 用微量注射器吸取固相萃取樣品(上樣，淋洗，洗脫)，進(jìn)樣20 M L，記錄色譜圖，代人標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算腺嘌吟核苷的濃度。結(jié)果計算6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線對照品回歸方程相關(guān)系數(shù)(r2)AG2-dG6.2樣品濃度計算各樣品濃度（以M/L）CU2-dGTA上樣淋洗洗脫Total【注意事項】在活化及萃取過程中，不要讓萃取柱變干，柱床始終保持濕潤。固相萃取上樣時速度不宜過快，防止待測組分來不及與填料充分作用就從通道流失。固相萃取柱最好只用一次。因為從嚴(yán)格的意義上來說，很多物質(zhì)的吸附是不可逆的，一 次吸附，無法洗脫，若重復(fù)使用，可能影響下一次吸附。高效液相色譜在進(jìn)樣時，為保證進(jìn)樣準(zhǔn)確，進(jìn)樣時必須多取一些溶液，使溶液完全充滿 進(jìn)樣環(huán)?！舅伎碱}】本實驗依次用10mL甲醇及10mL的純凈水