siRNA制備方法比較說課材料

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。siRNA制備方法比較-siRNA制備方法比較siRNA制備方法的具體介紹其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA，而用這種方法制備一份混合有各種siRNA“混合雞尾酒”就可以避免這個缺陷。選擇通常是2001000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA，然后用RNaseIII(orDicer)在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，方法和單一的siR

2、NA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。dsRNA消化法的主要優(yōu)點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時間和金錢（注意：通常用RNAseIII通常比用Dicer要便宜）。不過這種方法的缺點也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因?，F(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常不會造成影響。最適用于：快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個基因功能缺失的表型不適用于：長時間的研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進(jìn)行研究，特別是基因治療前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRN

3、As轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)。而采用siRNA表達(dá)載體和基于PCR的表達(dá)框架則屬于：從轉(zhuǎn)染到細(xì)胞的DNA模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNAs。這兩種方法的優(yōu)點在于不需要直接操作RNA。體內(nèi)表達(dá)：siRNA表達(dá)載體多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴三種RNA聚合酶III啟動子(polIII)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA,shRNA)在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNApolIII啟動子是由于它可以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短

4、發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的polIII啟動子下游。由于涉及到克隆，這個過程需要幾周甚至數(shù)月的時間，同時也需要經(jīng)過測序以保證克隆的序列是正確的。siRNA表達(dá)載體的優(yōu)點在于可以進(jìn)行較長期研究帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。病毒載體也可用于siRNA表達(dá)，其優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細(xì)胞進(jìn)行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的種種不便,而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定。最適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默。不適用于：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費(fèi)時、繁瑣的工作）。體內(nèi)表達(dá)：si

5、RNA表達(dá)框架siRNA表達(dá)框架(siRNAexpressioncassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達(dá)模版，包括一個RNApolIII啟動子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個RNApolIII終止位點，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無需事前克隆到載體中。和siRNA表達(dá)載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費(fèi)時的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時間。因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點，那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構(gòu)建si

6、RNA表達(dá)載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達(dá)siRNA和長效抑制的研究。這個方法的主要缺點是（1）PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中；（2）不能進(jìn)行序列測定，PCR和DNA合成時可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)果不理想。最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子。不適用于：長期抑制研究，（如果克隆到載體后就可以了）。siRNA（小的干擾RNA）是在RNA干擾過程中人工體外合成的小片段RNA，由約20個堿基對組成，包括5個磷酸鹽，2個核苷和3個懸臂。siRNA直接轉(zhuǎn)染可以方便地實現(xiàn)順時基因沉默，通常持續(xù)時間在3天-7天左右，因目標(biāo)基因差別而異。對于一些半衰期很長的蛋白，要想觀察蛋白表達(dá)下降

7、對細(xì)胞表型的長期影響就需要長期研究目標(biāo)基因沉默的效果，shRNA表達(dá)載體是更適合的選擇。shRNA(shorthairpinRNA)就是目標(biāo)siRNA與其反向互補(bǔ)序列之間由特定的連接序列間隔，得到的RNA兩端反向互補(bǔ)退火，與連接序列形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，類似發(fā)夾。攜帶目標(biāo)基因shRNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)導(dǎo)到目標(biāo)細(xì)胞中，載體表達(dá)shRNA并被Dicer酶切割為siRNA，就可以引發(fā)目標(biāo)基因的沉默。shRNA表達(dá)載體可分為質(zhì)粒載體和病毒載體。化學(xué)合成siRNA的優(yōu)點：1.獲得siRNA產(chǎn)物最直接，并且是最可控制的一種合成發(fā)法；2.從設(shè)計到應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)的周期可以短到24h之內(nèi)；3.雖然費(fèi)用較高，但是性價比優(yōu)于其他方法；4.產(chǎn)量的數(shù)量級可由微克至數(shù)克不等；5.是一種設(shè)計長度最靈活的方式（2-80bp）；6.沒有序列限制；7.純化過程不是必需的；8.可插入各種有益的修飾。shRNA載體的優(yōu)點：1.shRNA載體能夠更有效阻遏相應(yīng)基因的表