c2臨床遺傳學與分子生物學實驗診斷[131頁]課件

1、臨床遺傳學與分子生物學實驗診斷 clinical genetics and molecular diagnostics南方醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院臨床檢驗診斷學教研室彭永正2016.12.3012主要內(nèi)容第一節(jié) 染色體病檢查第二節(jié) 核酸和基因相關(guān)檢驗第三節(jié) 產(chǎn)前診斷第四節(jié) 新生兒疾病篩查3基本要求1、掌握 染色體數(shù)目異常性疾病，常用核酸分子雜交技術(shù)的基本方法及原理，實時熒光PCR技術(shù)的原理及特點，唐氏綜合征篩查項目及其臨床意義。2、熟悉 羊水檢查的項目及其臨床意義，新生兒篩查的項目及其臨床意義。3、了解 染色體結(jié)構(gòu)異常性疾病及染色體不穩(wěn)定綜合征。4基本概念醫(yī)學遺傳學（medical geneti

2、cs） 醫(yī)學和遺傳學相結(jié)合的一門邊緣學科，是遺傳學知識在醫(yī)學領(lǐng)域中的應(yīng)用。 醫(yī)學遺傳學不僅與生物學、生物化學、微生物及免疫學、藥理學、衛(wèi)生學等基礎(chǔ)醫(yī)學密切相關(guān),而且已經(jīng)深入臨床各學科之中。臨床遺傳學（clinical genetics） 研究臨床各種遺傳病的診斷、產(chǎn)前診斷、預防、遺傳咨詢和治療的學科。 5基本概念遺傳性疾病： 染色體?。╟hromosomal disease） 基因病（genic disease）絕大多數(shù)遺傳性疾病的發(fā)生都與基因的改變密切相關(guān)。 診斷：從基因水平找到相關(guān)證據(jù)。舉例 唐氏綜合征 染色體病 地中海貧血 基因病 遺傳性乳腺癌卵巢癌綜合征 基因病67Barts 水腫胎

3、重型地貧血患兒的肝大、脾大和頭顱變形（脾切除）8BRCA：遺傳性乳腺癌-卵巢癌綜合征 約5-6%的女性乳腺癌為遺傳性。 檢測乳腺癌的BRCA1/2狀態(tài)的意義:有BRCA1/2突變病的家族應(yīng)進行BRCA1/2基因突變的篩查（血樣本）所有BRCA1/2陽性家屬都應(yīng)按NCCN指南進行乳腺的全面檢測，預防性化療（他莫昔芬）或預防性手術(shù)（乳腺切除）。攜帶者有極高患乳腺癌（45-65%）和卵巢癌（11-39%）的風險！9第一節(jié) 染色體病檢查染色體病 染色體遺傳病的簡稱。主要是細胞中遺傳物質(zhì)的主要載體染色體的數(shù)目或形態(tài)、結(jié)構(gòu)異常引起的疾病。 分類：常染色體病 性染色體病常染色體病：常染色體異常引起，臨床表現(xiàn)

4、為先天性智力低下、發(fā)育滯后及多發(fā)畸形。如 13- 三體綜合征性染色體?。盒匀旧w異常引起，臨床表現(xiàn)為性發(fā)育不全、智力低下、多發(fā)畸形等。 如 45，X 綜合征染色體異常的發(fā)生率：自然流產(chǎn)胎兒 20%50% 新生兒 0.5%1%10一、染色體數(shù)目異常（一）唐氏綜合征 ( Down syndrome,DS) 1959年 法國又稱 21-三體綜合征、先天愚型、伸舌樣癡呆等，是一種最常見的染色體病，也是人類第一個被確診的染色體病。智力低下、特殊面容、 殘疾、學習障礙、 掌紋異常等。完全型21-三體易位型21-三體（3%4%）嵌合型21-三體（1%2%） 11唐氏綜合征患病概率：與人種、生活水準等沒有直接

5、聯(lián)系，約每600個新生兒中就有1個患唐氏綜合征。高齡初產(chǎn)婦會加劇嬰兒患唐氏綜合征的風險：隨著產(chǎn)婦年齡增加，卵子形成過程中引起染色體不分離現(xiàn)象的概率增高。妊娠期篩查：在妊娠早期和妊娠中期進行血清學篩查 。如果診斷為高危，可以進行羊膜穿刺抽取羊水進行染色體檢查來確診。羊水染色體檢查結(jié)果報告方式： 47，XN,+21 46,XN （產(chǎn)前診斷，正常核型）12羊水 (Amnion Fluid)60年代后期發(fā)展起來，至今最常用的（產(chǎn)前）。取樣時間： 15周，常用16-25周。取樣： 在超聲的監(jiān)控下，用細針穿入羊水池，抽取約 20ml 羊水于無菌離心管。 *無菌操作！盡快送實驗室培養(yǎng)。13唐氏綜合征患兒分型

6、1.完全型 21-三體 47，XX（XY），+21。占全部病例的92%以上 發(fā)生機制：親代（多數(shù)為母方）的生殖細胞染色體在減數(shù)分裂時不分離所致。雙親外周血淋巴細胞核型都正常。臨床上不易與易位型區(qū)分。14兒科Down Syndrome（Blood）核型：47,XY,+2115細胞周期 G1 phase S phase G2 phase M phase Cytokinesis - Interphase - - Cell division -16核型分析 （Karyotyping)G-400450條帶17染色體結(jié)構(gòu)，G-顯帶圖例：C 著絲粒 p 短臂S 隨體 q 長臂stk 隨體柄18命名 與 核型

7、 - ISCNInternational System for Human Cytogenetic Nomenclature46,XX or 46,XY46,XN （產(chǎn)前，正常核型）47,XY,+2145,X47,XXY19核型 cont.46,XX,ins(1;?)(p22;?) Insertion 插入46,XX,add(19)(p13) Addition 46,XX,del(7)(p11.2) Deletion46,XX,inv(3)(q21;q26.2) Inversion 46,XY,der(1)t(1;10)(q44;q22) Derivative Translocation46,

8、XY,dup(1)(q24q44) Duplication46,X,i(X)(q10) Isochromosome20核型 cont.45,XX,rob(14;21)(q10;q10) Robertsonian45,XX,der(13;21)(q10;q10) （Chromosomes 13-15, 21-22）45,XX,dic(13;13)(q14;q32) Dicentric46,XX,r(7)(p22q36) Ring47,XX,+mar Marker chr.其它：16qh+ Yqh- 21ps+ 21pss mat (Maternal) pat (Paternal)21唐氏綜合征患

9、兒分型2. 易位型 21-三體 多為羅伯遜易位（Robertsonian translocation） 只發(fā)生在近端著絲粒染色體的一種相互易位，亦稱著絲粒融合。這類患者的細胞內(nèi)除具有兩條完整的21號染色體外，還有一條由21號染色體易位到另一條D組或G組染色體上而形成的易位染色體。D組中以14號染色體為主，核型 46，XX（或XY），-14，+t（14q21q）；少數(shù)為15號。這種易位型患兒約半數(shù)為遺傳性，即親代中有14/21平衡易位攜帶者，核型為45，XX（或XY），-14，-21，+t（14q21q）。另一種為G/G易位，是由于G組中兩條21號染色體發(fā)生著絲粒融合，形成等臂染色體t（21q2

10、1q），或一條21號染色體易位到一條22號染色體上，形成 t（21q22q），較少見。22唐氏綜合征患兒分型3.嵌合型 21-三體 患兒臨床表現(xiàn)差異懸殊，視正常細胞所占的百分比而定，可以從接近正常到典型表型。患兒體內(nèi)同時含有正常的二倍體細胞和異常的21-三體細胞。發(fā)生機制 ：受精卵在早期分裂過程中染色體不分離引起。23（二）其它染色體數(shù)目異常性疾病1. 18- 三體綜合征（Edwards syndrome）僅次于唐氏綜合征的第二種常見染色體三體征。1960年首先報道，至今已有數(shù)百例報道。 三體型：47，XX（XY），+18 80% 嵌合型：46，XX（XY）/ 47，XX（XY），+18 20

11、%2. 13三體綜合征 1960年，Patau首先描述。 新生兒中發(fā)病率：1/25 000，女性明顯多于男性，患兒的畸形和臨床表現(xiàn)要比21-三體嚴重得多。染色體核型：多為單純的13-三體型 47，47，XX（XY），+13。極少數(shù)為易位型和嵌合型。24B-超異常AF核型：47,XX,+1325常染色體數(shù)量異常 cont. 22-三體綜合征易位型、嵌合體 先天性肛門閉鎖等26性染色體異常 cont.47,XXX47,XXY47,XYY 47，如 48,XXXX, 49，XXXXX等，罕見嵌合體 常見，對表型影響小46,XY 女性 （？）27二、染色體結(jié)構(gòu)異常（一）部分三體綜合征（二）部分單體綜合

12、征（三）9號染色體異常 - 最常見的結(jié)構(gòu)異常常被認為是“染色體的多態(tài)”289號染色體的異常，不一定有疾病表型?？赡艹霈F(xiàn)的表型： 特殊面容、腦癱、先心病、運動機能失調(diào)。29核型：46,XY,inv(9)(p12q13),?der(9)(q13)腦癱30二、染色體結(jié)構(gòu)異常（一）部分三體綜合征 由于某一常染色體的某一片段有三份而引起的染色體病，細胞染色體數(shù)是46或47條。122號染色體的部分三體綜合征都有報道。9 p部分三體綜合征，即在每一個體細胞中9號染色體短臂有三份的染色體病患者。常見特征為小頭、寬眼距、性腺發(fā)育不良、長手掌、短中指骨、小而發(fā)育不良的指甲、中度智力障礙、通貫手，少數(shù)患者在幼年死亡

13、，多數(shù)能活到成年。舉例：47，XX,+9q-3132（二）部分單體綜合征由于某一常染色體部分缺失而引起的染色體病，細胞染色體數(shù)是46條。核型：46，XX（XY），5p-。部分缺失可以是短臂部分缺失、長臂部分缺失或長短臂部分都有缺失而引起的環(huán)狀染色體。部分缺失種種雖然發(fā)生率不高，但缺失種類繁多，臨床癥狀也遠比部分三體綜合征嚴重，常于嬰幼兒期夭折。5p-綜合征，又叫貓叫綜合征，嬰兒期哭聲酷似貓叫，常伴有動脈導管未閉和免疫球蛋白缺乏。33核型的解釋：染色體的多態(tài)性 (Polymorphism)染色體結(jié)構(gòu)和著色強度存在非病理性差別，未發(fā)現(xiàn)多態(tài)直接導致有害的遺傳性狀。常見的多態(tài)：異染色質(zhì)區(qū)隨體臂間倒位結(jié)

14、論 1.G顯帶數(shù)；2.培養(yǎng)方法；3.培養(yǎng)時間異態(tài)（Heteromorphism)34核型： 46,X,Yqh-,16qh+,21pstk+35三、 染色體不穩(wěn)定綜合癥 - DNA 復制或修復缺陷范科尼貧血 （Fanconi anaemia） 較罕見，具有全血細胞減少、骨髓再生障礙及伴有多發(fā)性畸形三聯(lián)征。Bloom綜合征 （Bloom syndrome）是一種典型的染色體斷裂綜合征，又稱面部紅斑侏儒綜合征?；颊咂つw對光敏感，手部與四肢可見毛細管擴張性紅斑。毛細血管擴張性共濟失調(diào)癥 （Ataxia telangiectasia）本病的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀主要為小腦性共濟失調(diào)，多數(shù)患者在36歲出現(xiàn)皮膚毛細管

15、擴張。上述三種綜合征均為常染色體隱性遺傳病。36第二節(jié) 核酸和基因相關(guān)檢驗1.人類的絕大多數(shù)疾病都與基因密切相關(guān)。外傷？2.基因的改變可以導致各種表型的改變，從而導致疾病發(fā)生。3.疾病診斷：表型診斷基因診斷4.相關(guān)技術(shù)：分子生物學，分子遺傳學5.直接檢測基因結(jié)構(gòu)及表達水平是否正常，從而對疾病做出準確地診斷。6.精準醫(yī)療的核心問題：精準診斷。37中心法則3839Personalized MedicineGenomic medicinePharmacogenetics/Pharmacogenomicsfor identifying:5R the right patient, right dose,

16、 right target, right drug, right time.40precision medicineMirnezami R, Nicholson J, Darzi A.Preparing for Precision Medicine.N Engl J Med 2012,366(6):489-491. Ultimately, precision medicine should ensure that patients get the right treatment at the right dose at the right time, with minimum ill cons

17、equences and maximum efficacy.An Informatics Research Roadmap to Facilitate Precision MedicineThe intent of precision medicine is to integrate individual genetic data with existing health information to predict disease risk, develop prevention strategies, accurately establish disease course and tail

18、or management plans. Precision Medicine Initiative (PMI)Clinical Chemistry Sep 2016，62 (9) 1282-128341一、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）由美國Centus公司的KaryMullis發(fā)明，于1985年由Saiki等在Science雜志上首次報道，是一種體外快速擴增DNA的技術(shù)。1.PCR的基本原理和過程PCR技術(shù)是在模板DNA、引物和4種脫氧單核苷酸存在的條件下依賴于耐高溫的DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。PCR以待擴增的DNA做為模板，以和模板正鏈和負鏈

19、末端互補的兩種寡聚核苷酸做為引物，經(jīng)過模板DNA變性、模板引物復性結(jié)合、并在DNA聚合酶作用下發(fā)生引物鏈延伸反應(yīng)來合成新的模板DNA。模板DNA變性、退火、引物延伸合成DNA這三步構(gòu)成一個PCR循環(huán)。每一循環(huán)的DNA產(chǎn)物經(jīng)變性又成為下一個循環(huán)的模板DNA。目的DNA的數(shù)量將以2n的形式累積，在2小時內(nèi)可擴增30(n)個循環(huán)，DNA量達原來的上百萬倍。42PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過程4344（二）特點優(yōu)點： 1.特異性強、靈敏度高、簡便快速； 2.可使用特定的低純度標本，如人的組織、細胞、毛發(fā)、血液、培養(yǎng)后的細菌和病毒等； 3.為臨床基因診斷最為廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一。缺點：特指普通PCR1.只能定性，

20、臨床需要的定量結(jié)果無法滿足；2.PCR產(chǎn)物采用電泳檢測，易引起擴增產(chǎn)物的交叉污染，增加了假陽性結(jié)果的可能性；3.采用的染色劑溴乙啶具有致癌性，可能危害工作人員及污染環(huán)境。45（三）臨床應(yīng)用廣泛應(yīng)用于微生物學、醫(yī)學及遺傳學的分子克隆、序列分析、基因突變、遺傳病、傳染病、血源篩查、法醫(yī)學鑒定及考古等多種領(lǐng)域。PCR及其相關(guān)技術(shù)在臨床遺傳學中得到廣泛應(yīng)用：1.PCR/RFLP(restriction fragment length polymorphism，限制性片段長度多態(tài)性)，PCR/SSP(sequence-specific primer，序列特異性引物)， PCR /SSCP(single-

21、strand conformation polymorphism,單鏈構(gòu)象多態(tài)性)等技術(shù)可用于HLA的基因分型。2.用于某些遺傳性疾病的診斷：鐮狀細胞貧血 珠蛋白基因第6位密碼子發(fā)生單個堿基突變 AT，谷氨酸被纈氨酸取代所致，導致基因內(nèi)部一個 Mst限制性酶切位點丟失，用PCR/RFLP技術(shù)，可將患者、突變攜帶者和正常人區(qū)別開來。46二、實時熒光PCR技術(shù)（一）原理 基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的原理。以TaqMan熒光標記探針為基礎(chǔ)的實時熒光PCR技術(shù)，在目前的臨床診斷中應(yīng)用最為廣泛。熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合

22、酶不僅具有53方向的聚合酶活性，同時還具有53核酸外切酶活性，可以切割聚合延伸過程中遇到的與靶序列結(jié)合的寡核苷酸探針，利用Taq酶的這一特性，可以檢測靶序列的擴增。47二、實時熒光PCR技術(shù)Taqman熒光探針是在其5端標記一個熒光報告基團， 3端有一個淬滅劑。據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，完整的Taqman熒光探針因熒光基團和淬滅劑距離很近而使熒光基團發(fā)射出的熒光被淬滅，只有當探針被降解時，熒光報告基團和淬滅劑分離，這時熒光才能發(fā)射出來。熒光信號變量與擴增產(chǎn)物變量成正比，根據(jù)實時擴增曲線，可對原始模板定量。Ct值：指熒光強度大于最小檢測水平（即熒光閾值）時的PCR循環(huán)數(shù)，它是獲得準確且重現(xiàn)性好的數(shù)

23、據(jù)的基礎(chǔ)。為實時熒光PCR的基本參數(shù)。起始模板量越多，熒光信號顯著高于背景信號所需的PCR循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越??；反之則越大。4849熒光定量標準曲線50（二）實時熒光PCR的特點1.全封閉反應(yīng)，無需擴增后處理，大大減少了擴增產(chǎn)物污染的可能性；2.特異性強，靈敏度高；3.采用對數(shù)期分析，摒棄終點數(shù)據(jù)，定量準確，重復性好；4.定量范圍寬，可達到10個數(shù)量級；5.儀器在線實時檢測，結(jié)果直觀，避免人為判斷；6.可實現(xiàn)一管雙檢或多檢；7.操作安全，簡便快速；8.利用自動化和聯(lián)網(wǎng)管理。51（三）實時熒光PCR的臨床應(yīng)用應(yīng)用范圍越來越廣，如病原微生物的核酸定量 mRNA表達研究 等位基因的差異分析 石蠟

24、包埋組織的基因表達等。實時熒光PCR對實驗室空間和人員操作的要求相對較低， 且易于定量，尤其適用于核酸分子的臨床檢測。52三、其它核酸與基因檢測的基本技術(shù)（一）限制性酶切限制性內(nèi)切酶是存在于原核細胞中能特異地識別雙鏈DNA分子中的特殊序列，并對其進行剪切的一類酶。不同種類的生物體之間DNA的堿基序列存在很大差異，同種生物的不同個體之間DNA的堿基序列也存在一定的差異。基因突變限制性片段長度多態(tài)性：染色體DNA上疾病基因座位的遺傳標志用途：連鎖分析、基因定位和親子鑒定等。53三、其它核酸與基因檢測的基本技術(shù)（二）核酸分子雜交技術(shù)最經(jīng)典的基因分析和基因檢測方法。是指具有一定互補序列的兩種核酸單鏈在

25、液相或固相體系中按堿基互補配對原則合成異質(zhì)雙鏈的過程。雜交：DNA與DNA，DNA與RNA，RNA與RNA之間進行，特定序列，可定性或定量。1.印跡雜交法：Southern雜交法檢測DNA Northern雜交法檢測RNA2.斑點雜交法：由Southern雜交法衍生而來54三、其它核酸與基因檢測的基本技術(shù)（三）凝膠電泳技術(shù)分離、鑒定和純化DNA片段的最常用方法。1.瓊脂糖凝膠電泳：DNA的分離范圍較廣 （1） 普通凝膠電泳 200 bp20 kb的DNA （2）脈沖場凝膠電泳 數(shù)kb數(shù)百kb2.聚丙烯酰胺凝膠電泳 能分離相差1 bp的DNA片段，分辨率高， 可適用于5bp500bp DNA片段

26、。55第三節(jié) 產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷出生缺陷 嚴重危害人民的身體健康和生命。由于它的種類多、發(fā)病率高，給社會帶來的負擔大，已成為醫(yī)學難題之一。遺傳病 多數(shù)缺乏有效的治療方法?？稍斐珊蟠l(fā)病。我國每年新增的出生缺陷 120萬。預防與治療： 1. 婚前檢查，孕前咨詢 2.產(chǎn)前診斷 （超聲，實驗診斷） 3. 出生后治療 或 宮內(nèi)治療 56主要英語詞匯genetic disease(遺傳病)Down syndrome（DS,唐氏綜合征）neural tube defect(NTD,神經(jīng)管畸形)multiple of median(MOM,中位數(shù)值的倍數(shù))Pregnancy-associated plasm

27、a protein A (PAPP-A,妊娠相關(guān)血漿蛋白A）noninvasive prenatal testing(NIPT,無創(chuàng)產(chǎn)前檢測)thalassemia(地中海貧血) 57產(chǎn)前診斷的概念和目的概念 產(chǎn)前診斷是在遺傳咨詢的基礎(chǔ)上，應(yīng)用現(xiàn)代生物學、生物化學、免疫遺傳學、細胞遺傳學、分子遺傳學技術(shù)對胚胎和胎兒的直接檢測，或通過母體的檢查，預測胎兒在子宮內(nèi)的生長發(fā)育情況，診斷胎兒是否有遺傳缺陷及先天畸形，以便早期發(fā)現(xiàn)和處理。目的 通過對母體和胎兒的早期監(jiān)測，及早預防和發(fā)現(xiàn)并發(fā)癥，減少不良影響。58全國首例！廣東實現(xiàn)不開刀給腹中胎兒做心臟手術(shù) 2016.10.1459短暫的20分鐘手術(shù)全程由

28、超聲影像定位操作此例“胎心術(shù)”，全球能施行的不超過10家醫(yī)院，不僅填補了我國胎兒心臟病宮內(nèi)介入治療的空白，也標志著廣東省人民醫(yī)院心血管病研究所開創(chuàng)了胎兒嚴重先天性心臟病治療新的里程碑。 甜杏仁大小穿刺路徑：孕肚子宮壁羊膜腔胎兒胸壁胎心右心室胎心肺動脈瓣遺傳咨詢 genetic counselling由從事醫(yī)學遺傳的專業(yè)人員或咨詢醫(yī)師，對咨詢者就其提出的家庭中遺傳性疾病的發(fā)病原因、遺傳方式、診斷、預后、復發(fā)風險、防治等問題予以解答，并就咨詢者提出的婚育問題提出醫(yī)學建議。遺傳咨詢是預防遺傳性疾病十分重要的環(huán)節(jié)。60遺傳咨詢的對象遺傳性疾病高風險人群1.夫婦雙方或家系成員患有某些遺傳病或先天畸形者，

29、曾生育過遺傳病患兒或先天畸形兒的夫婦；2.不明原因智力低下或先天畸形兒的父母；3.不明原因的反復流產(chǎn)或有死胎、死產(chǎn)等病史的夫婦；4.孕期接觸不良環(huán)境因素及患有某些慢性病的夫婦；5.常規(guī)檢查或常見遺傳病篩查發(fā)現(xiàn)異常者；6.其它需要咨詢者，如婚后多年不育的夫婦，或35歲以上的高齡孕婦。61遺傳咨詢必須遵循的原則1.盡可能收集證據(jù)原則：盡可能地獲得正確的診斷2.非指令性原則：患者及其家屬有選擇權(quán)3.尊重患者原則：將咨詢者本人的利益放在第一位4.知情同意原則：醫(yī)師應(yīng)本著科學、負責的態(tài)度，告知真相5.守密和信任原則：未經(jīng)許可的情況下，決不能將遺傳檢查結(jié)果告知除親屬外的第三者62一、產(chǎn)前篩查（prenat

30、al screening）產(chǎn)前篩查是在妊娠婦女中采用簡便、可行、無創(chuàng)的檢查方法，對其子代發(fā)病率高、病情嚴重的遺傳性疾?。ㄈ缣剖暇C合征）或先天畸形（如神經(jīng)管畸形）進行篩查，檢出子代具有出生缺陷的高風險人群，篩查出可疑者再進一步確診。產(chǎn)前篩查是防治出生缺陷的重要步驟。篩查步驟 1.首先采用經(jīng)濟、簡便、無創(chuàng)傷及安全的生化檢測進行初步檢查，篩查出高風險人群； 2.再采用各種產(chǎn)前診斷方法對高風險人群進行確診試驗。63產(chǎn)前篩查方案應(yīng)符合WHO標準1.疾病定義明確，臨床診斷可靠，疾病回嚴重危害人類健康，甚至可能致命。2.疾病的流行率相對較高且清楚，且患病者和非患病者在人群中的分布情況明確。3.疾病的治療有效

31、。4.具有經(jīng)濟效益，篩查所需要的費用低，其帶來的經(jīng)濟和社會效益超過了其給患者和家屬帶來的心理副作用。5.篩查方法簡單安全。6.具備篩查儀器且容易安裝。7.有敏感性高和特異性好的確診方法配合，并且容易被患者接受。64特別強調(diào)1.產(chǎn)前篩查試驗不是確診試驗，篩查陽性結(jié)果意味患病風險升高，并非診斷疾??；2.篩查陰性結(jié)果提示風險無增加，并非正常。3.篩查結(jié)果陽性的患者需進一步進行確診試驗，染色體病高風險患者需要行胎兒染色體核型分析。65二、唐氏綜合征篩查妊娠蛋白 高危妊娠婦女血漿中出現(xiàn)與妊娠相關(guān)的多種含量較高的蛋白質(zhì)，而在非孕婦血漿中含量甚微，并且其含量隨孕周增加而變化，這些蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為妊娠蛋白。其來源

32、于胎兒、胎盤和母體。當胎兒和孕婦出現(xiàn)異常時，妊娠蛋白也發(fā)生改變。篩查項目 AFP，fE3，HCG，inhibin A（抑制素A），PAPP-A。中位數(shù)的倍數(shù)（multiple of the unaffected population median,MoM） 由于各個實驗室報告的數(shù)值不同，為了便于比較，所以采用就診孕婦該生化標記物的濃度除以同一實驗室相同孕周的正常孕婦的某種生化指標的中位數(shù)而得到MoM作為檢驗結(jié)果的標準，正常人群為1.0 MoM。66（一）血清學篩查（非整倍體染色體異常）1. 妊娠中期血清學篩查 （三聯(lián)）（四聯(lián)） AFP -1522周；無腦、脊柱裂 （DS： AFP） HCG -

33、1416周；18-三體，（DS：） uE3 （DS：） 抑制素A（1522周；DS陽性檢出率70%，NTD85%） 2. 妊娠早期 PAPPA-A, HCG 二聯(lián)篩查 (713周） DS: PAPP-A671.甲胎蛋白（alpha fetoprotein,AFP）來源：早孕期 卵黃囊；晚孕期胎兒肝臟。 胎兒血清中最常見的球蛋白。變化規(guī)律：孕婦血清中的AFP在早、中孕期逐漸增加， 在孕2832周時達到相對穩(wěn)定期。 當胎兒出現(xiàn)開放性神經(jīng)管缺陷或腹壁缺陷時，羊水和母體血清中AFP顯著升高。臨床應(yīng)用 （1）開放性神經(jīng)管缺陷的診斷 母體血清 AFP2.0 MoM （2）唐氏綜合征 母體 AFP35歲孕婦

34、產(chǎn)前血清篩查（唐篩）高危 （一般在1518周內(nèi)進行）有既往史，習慣性流產(chǎn)，家族病史超聲發(fā)現(xiàn)胎兒異常其它：如智力不全，外表異常，工作、意外、或環(huán)境引起染色體異常等 （羊水）73染色體檢查（婦產(chǎn)科）不孕不育者習慣性流產(chǎn)異常胎兒的異常原因調(diào)查家族病史表型懷疑有染色體異常者工作，意外，或環(huán)境引起染色體異常 （如接觸 射線，大量有毒物質(zhì)等） （靜脈血）74染色體檢查（兒科）新生兒染色體缺陷 0.2 %特殊面容、體表和內(nèi)臟畸形、皮紋異常、多病重病、發(fā)育遲緩、智力低下、行為障礙、性發(fā)育異常 75染色體異常的來源先天的 來自父母，出生前的病變，等后天的 環(huán)境因素等 （后天性遺傳?。┦裁磿r候發(fā)生？減數(shù)分裂胚胎發(fā)

35、育早期 - 染色體不穩(wěn)定時期腫瘤細胞離體培養(yǎng)其它時候76（一）染色體的顯帶技術(shù)與核型分析培養(yǎng)細胞 + 秋水仙素 （破壞紡錘體）低滲液處理乙酸-甲醇 固定制片G-顯帶 （G banding, 用Giemsa 染色） （分辨率5-10 Mb）（其它顯帶方法還有 R-顯帶，C-顯帶，Q-顯帶等）*高分辨率顯帶，一般指 550850條帶 G-顯帶 （分辨率2-4 Mb）77細胞遺傳學檢查 常用細胞產(chǎn)前：羊水（絨毛膜，臍血）其它：外周血；骨髓（活檢的組織，如皮膚，腫瘤；等）78（二）羊水 (Amnion Fluid)60年代后期發(fā)展起來，至今最常用的（產(chǎn)前）。取樣時間： 15周，常用16-25周。取樣：

36、 在超聲的監(jiān)控下，用細針穿入羊水池，抽取約 20ml 羊水于無菌離心管。 *無菌操作！盡快送實驗室培養(yǎng)。79（三） 絨毛（CVS）70年代發(fā)展起來的。取樣時間： 常用于9-12周。 取樣： 經(jīng)腹，或經(jīng)子宮頸，吸取2550mg絨毛于 培養(yǎng)液。80絨毛 cont.直接收獲 分裂相少，質(zhì)量差長期培養(yǎng) 培養(yǎng)瓶法，或原位培養(yǎng)法。原位培養(yǎng)需要用胰蛋白酶和膠原酶處理，分離單細胞。與羊水細胞培養(yǎng)類似。 染色體分析與羊水相似。81（四） 臍血80年代發(fā)展起來的。取樣時間： 20周以上。 取樣： 在超聲的監(jiān)控下，用細針穿入臍帶。82臍血 cont.按常規(guī) PHA 刺激外周血T-細胞方法，培養(yǎng)三天。 （或再添加 P

37、okeweed 刺激B-細胞）需要鑒別檢查母血污染。類似常規(guī)外周血分析，G-顯帶300-500條帶， 或高分辨率550-700條帶。83羊水：流產(chǎn)率最低，成功率最高，受母血污染影響小，容易大量培養(yǎng)，染色體質(zhì)量高，分析較容易。絨毛：培養(yǎng)所需人工多，程序復雜，部分異常結(jié)果需要羊水檢查驗證。有可能會引發(fā)肢體畸形胎兒（特定靶標檢查）。臍血：成功率偏低，易受母血污染。但培養(yǎng)容易，時間較短，可做高分辨分析 （常用于復查）。84二、常用分子細胞遺傳學方法（一）FISH - fluorescence in situ hybridization 熒光原位雜交FISH 的衍生技術(shù)：SKY - Spectral K

38、aryotyping = Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization (M-FISH) 光譜核型分析CGH Comparative genomic hybridization 比較基因組雜交85FISH 圖例 - 最常用于白血病和腫瘤細胞檢測86（二）PCR國內(nèi)廣泛采用： 檢測缺失、突變基因 各種病原體（三）DNA測序 - 通常結(jié)合PCR（四）Micro-Array - DNA copy number CMA - chromosomal microarray 染色體微陣列87三、植入前診斷8 個細胞期，取 12 個細胞檢查FISH or PCR （

39、靶向，如家族遺傳病等）四、 母血中的胎兒成分1.胎兒DNA占孕婦血漿DNA的5%，可用于分子遺傳學分析。（盧煜明（LO Yuk Ming Dennis） NIPT 之父 88Cell-Free Fetal DNA Testing for Prenatal Diagnosis. Drury S1, Hill M1, Chitty LS2 Adv Clin Chem. 2016;76:1-35.Prenatal diagnosis and screening have undergone rapid development in recent years, with advances in mol

40、ecular technology driving the change. Noninvasive prenatal testing (NIPT) for Down syndrome as a highly sensitive screening test is now available worldwide. Noninvasive prenatal diagnosis (NIPD) can now be performed for definitive diagnosis of some recessive and X-linked conditions, rather than just

41、 paternally inherited dominant and de novo conditions. NIPD/T offers pregnant couples greater choice during their pregnancy as these safer methods avoid the risk of miscarriage associated with invasive testing. As the cost of sequencing falls and technology develops further, there may well be potent

42、ial for whole exome and whole genome sequencing of the unborn fetus using cell-free DNA in the maternal plasma.892.母血中的胎兒細胞從母血中能夠收集到數(shù)十個胎兒成紅細胞，可做分子細胞生物學分析。 （尚未實際應(yīng)用）Cell free DNA for the diagnosis of aneuploid and maternally inherited diseases is difficult. Fetal cells in maternal blood are an ideal s

43、olution for this limitation; Fetal cells is not limited to large fragment gene sequencing; Support various molecular biology techniques for the ease of analysis.W.-L. Cheng et al. / Taiwanese Journal of Obstetrics & Gynecology 54 (2015) 343-34990第四節(jié) 新生兒疾病篩查先天性甲狀腺功能低下B. 苯丙酮尿癥篩查C. 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查1995

44、年6月頒布母嬰保健法將上述3種疾病列入篩查范圍。D. 先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥篩查E. 地貧篩查 2009年，湖南篩查44萬新生兒：A=211；B=1091新生兒疾病篩查概述新生兒疾病篩查（neonatal screening） 系指對一系列危害嚴重的先天性、遺傳性疾病，在新生兒期未出現(xiàn)臨床癥狀前，用實驗手段檢查出來。明確診斷后，經(jīng)及早治療，可以避免因病情發(fā)展而造成的患兒機體不可逆損傷及功能障礙，減少發(fā)生殘疾，降低小兒病死率及預防某些中老年疾病。 該項工作是一項提高人口素質(zhì)的重大舉措，近年在我國迅速推廣，并發(fā)揮了巨大作用。 目前，篩查均采用新生兒出生后足跟采血的干血滴紙片進行。 92一、促甲狀腺

45、激素（thyroid-stimulating hormone,TSH）檢測先天性甲狀腺功能低下（congenital hypothyroidism,CH） 由于胚胎期和出生前后甲狀腺軸的發(fā)生、發(fā)育和功能代謝異常，引起出生后甲狀腺功能低下。其主要臨床表現(xiàn)為體格和智能發(fā)育障礙，是小兒常見的內(nèi)分泌疾病。 特點 血清 T4降低、TSH 明顯升高。主要原因 甲狀腺發(fā)育不良、缺如或異位，其次為甲狀腺激素合成障礙和下丘腦-垂體性甲狀腺功能減退。93TSH檢測方法 出生23天的新生兒干血滴紙片初篩TSH，結(jié)果20mU/L時，再檢測血清甲狀腺素（T4）、TSH以確診。方法評價 簡便，假陽性和假陰性率均較低，為患

46、兒早期確診、避免神經(jīng)精神發(fā)育嚴重缺陷的極佳防治措施。 任何新生兒篩查結(jié)果可疑或臨床可疑的小兒都應(yīng)檢測血清T4、TSH 濃度。促甲狀腺素釋放激素（thyrotropin-releasing hormone,TRH）刺激試驗: 用于T4、TSH 均低，懷疑TRH、TSH分泌不足。 未出現(xiàn)TSH 高峰 考慮垂體病變 TSH峰值出現(xiàn)時間延長 考慮下丘腦病變 94二、苯丙氨酸檢測苯丙酮尿癥（phenylketonuria,PKU）是一種常見的氨基酸代謝病，是由于苯丙氨酸代謝途徑的酶缺陷，使得苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)變成酪氨酸，導致苯丙氨酸及其酮酸蓄積并從尿中大量排出。臨床主要表現(xiàn)為智能低下，驚厥發(fā)作和色素減少。特

47、點 本病為少數(shù)可治性遺傳性代謝病之一，上述癥狀經(jīng)飲食控制治療后可逆轉(zhuǎn)，但智能發(fā)育落后難以轉(zhuǎn)變，應(yīng)力求早期診斷、治療，以避免神經(jīng)系統(tǒng)的不可逆損傷。 患兒早期無癥狀或癥狀不典型，必須借助實驗室檢測。檢測方法 三氯化鐵試驗 現(xiàn)已很少應(yīng)用 1961 Guthrie 細菌抑制法測定血中苯丙氨酸 簡單易行，結(jié)果更可靠?？莶輻U菌生長試驗采血 時間 新生兒喂奶3天后，盡快采血。95三、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase,G-6-PD）檢測小兒紅細胞G-6-PD缺乏癥是一種遺傳性溶血性疾病。本病為X-連鎖不完全顯性遺傳病，男性的發(fā)病率高于女性。雜合子具有不

48、同的表現(xiàn)度，男性雜合子和女性純合子均發(fā)病。女性雜合子亦可發(fā)病，取決于其缺乏G-6-PD的紅細胞數(shù)量在紅細胞群中所占的比例。實驗室檢查 可定性 定量檢測G-6-PD活性。96四、質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)-新生兒疾病篩查串聯(lián)質(zhì)譜為新生兒篩查帶來了巨大發(fā)展，實現(xiàn)了“一種方法檢測多種疾病”。串聯(lián)質(zhì)譜有更高的準確性，且有更高的實效性。它可以同時檢測包括氨基酸病、有機酸代謝紊亂、脂肪酸氧化缺陷在內(nèi)的50種遺傳代謝病，大大提高了篩查效率。Tandem mass spectrometry newborn screening for inborn errors of intermediary metabolism: abn

49、ormal profile interpretationExpanded newborn screening for inherited metabolic disorders using tandem mass spectrometry is widely used around the world. In contrast to conventional screening methods, tandem mass spectrometry does not measure single analytes but identifies and quantifies metabolite p

50、rofiles; one single blood spot analyzed provides information of about 60 metabolites including amino acids, acylcarnitines and related ratios that enable the diagnosis of approximately 50 different diseases. Curr Med Chem. 2012;19(26):4511-22.98第五節(jié) 地中海貧血的篩查99100101102103 地中海貧血是由于珠蛋白基因的缺失或缺陷使某種珠蛋白鏈合成

51、受到抑制而引起的溶血性貧血，為單基因遺傳病。 主要有兩種類型: -地中海貧血 -地中海貧血地中海貧血-概念104本病遍布世界各地，以地中海地區(qū)、中非洲、亞洲、南太平洋地區(qū)發(fā)病較多在全球范圍內(nèi)，地貧的年受累妊娠數(shù)為13,466，地貧的年受累妊娠數(shù)為42,409全球每年重型地貧的發(fā)生人數(shù)為56,000，其中包括30,000例需輸血的重型患者以及5500例致死型重型水腫胎我國的高發(fā)區(qū)主要分布于長江以南各省區(qū)，其中廣西、廣東和海南三?。▍^(qū)）為我國發(fā)生率最高的地區(qū) 地中海貧血-流行病學105全球地中海貧血分布情況(Modell B. Bull World Health Organ, 2008, 86:4

52、80487)106中國南方和地貧的人群攜帶率(Xu XM, J Clin Pathol. 2004, 57:517-22 ; Xiong F, Clin Genet, 2010 )107地貧基因型與表型的關(guān)系綜合征 臨 床 特 征 臍血Hb 基因缺失數(shù)目地貧2 無貧血，RBC正常 12% (Hb Barts) 1 （靜止型）地貧1 小細胞低色素貧血 510% (Hb Barts) 2（標準型） HbH 病 小細胞低色素 530% (Hb H和 中度溶貧,包涵體 Hb Barts) 3 水腫胎 致死性貧血 Barts為主, 少量 (宮內(nèi)或出生時死亡) Hb H 和 Hb Portland 4 1

53、08靜止型地貧分子基礎(chǔ)： 4個基因中有1個缺失（突變）基因型：-/（ -3.7/或 4.2/ ） 或T/（ CS/或 QS/ ）定義：由于缺失一個-基因而引起的-地貧。109靜止型地貧診斷依據(jù)1.臨床表現(xiàn)：無任何癥狀2.血常規(guī):Hb正常,或MCV82 fl、MCH27 pg3.Hb分析： 新生兒：0.5%2% Hb Barts 成 人：正常4.基因診斷：DNA分析110標準型地中海貧血 定義：由于缺失兩個-基因而引起的-地貧。 分子基礎(chǔ)：4個基因中有2個缺失標準型-1或稱 東南亞型（-SEA）標準型-2基因型：- -/（標準型-1） -/- （標準型-2） （兩種類型只有通過基因診斷才能區(qū)分）

54、111標準型地中海貧血診斷依據(jù)1.臨床表現(xiàn)：一般無癥狀2.血常規(guī)：MCV 82 fl和/或MCH 27 pg，Hb 正常或輕度下降 （注：也可提示缺鐵性貧血）3. 血象：小細胞低色素性貧血，少數(shù)紅細胞內(nèi)可見亨氏小體 4.Hb分析：新生兒：Hb Barts 2%10% 成年人：HbA22.5% 5.基因診斷：DNA分析112HbH病診斷依據(jù)臨床表現(xiàn)：嬰兒出生時貧血較輕或無貧血，此后逐漸加重，通常為輕度至中度貧血，可伴有肝脾腫大，偶有黃疸。Hb H 病通常不影響日常生活，發(fā)育正常。但個體差異很大。血常規(guī)：MCV 82 fL，MCH 27 pg，Hb輕至中度貧血，有時Hb正常。血涂片：紅細胞低色素性，大小不均，有異常形態(tài)紅細胞，紅細胞包涵體生成實驗陽性（即紅細胞內(nèi)可見亨氏小體）。Hb分析： 新生