葉綠素a、b含量測定

1、葉綠素a、b含量測定【實驗原理】如果混合液中的兩個組分，它們的光譜吸收峰雖然有明顯的差異，但吸收曲線彼 此有些重疊，在這種情況下要分別測定兩個組分，可根據(jù)Lambert-Beer定律， 通過代數(shù)方法，計算一種組分由于另一種組分存在時對光密度的影響，最后分別 得到兩種組分的含量。葉綠素a和b的吸收光譜曲線，葉綠素a的最大吸收峰在663nm，葉綠素b在 645nm，吸收曲線彼此又有重疊。根據(jù)Lambert-Beer定律，最大吸收光譜峰不同的兩個組分的混合液，它們的 濃度C與光密度OD之間有如下的關(guān)系：0%弋氏1 +硅燦0七弋、+硅乩（2）式中：Ca為組分a的濃度，g/L；Cb為組分b的濃度，g/L

2、；0D1為在波長扃（即組分a的最大吸收峰波長）時，混合液的光密度0D值； 0D2為在波長灼（即組分b的最大吸收峰波長）時，混合液的光密度0D值； ka1為組分a的比吸收系數(shù)，即組分a當濃度為1g/L時，于波長扃時的光密度 0D值；ka2為組分a （濃度為1g/L），于波長&時的光密度0D值；kb1為組分b （濃度為1g/L），于波長從時的光密度0D值；kb2為組分b的比吸收系數(shù)，即組分b當濃度為1g/L時，于波長灼時的光密度 0D值；從文獻中可以查到葉綠素a和b的80%丙酮溶液，當濃度為1g/L時，比吸收系 數(shù)k值如下：波長（nm）葉綠素a葉綠素b66382.049.2764516.7545.

3、60將表中數(shù)值代入上式（1）、（2），則得:OD663 = 82.04xCa+9.27xCbOD645=16.75xCa+45.60 xCb經(jīng)過整理之后，即得到下式:Ca=0.0127 OD663-0.00269 OD645C：=0.0229 OD645-0.00468 od663如果把Ca, Cb的濃度單位從原來的g/L改為mg/L,則上式可改寫為下列形式： Ca=12-7 OD663-2-69 OD645（3）Cb = 22-9 OD645-4-68 OD663（4）CT= Ca+ Cb = 8.02 OD663 + 20.21 OD645（5）（5）式中CT為總?cè)~綠素濃度，單位為mg/L

4、。利用上面（3）、（4）、（5）式，即可計算出葉綠素a和b及總?cè)~綠素的濃度（mg/L）。附注由于葉綠素a和b吸收峰的波長相差僅18nm （663-645nm）,對儀器的波長精確度要求較高， 一般低級類型的分光光度計難以滿足要求，至少要中級或高級類型的。而有時還由于儀器受振等原因，會 使儀器的標稱波長與實際波長不符，測定的正確性就差了。如果對測定結(jié)果發(fā)生疑問時，不妨用已知波長 的濾光片驗證一下，儀器的波長是否正確，如無濾光片，可用商品葉綠素a或b （廠家會標明Amax數(shù)據(jù)）， 對儀器的波長進行驗證。由于所需的葉綠素a或b的量很少，又無正確濃度要求，因此不妨自行制備，用 紙層析法很快就能分離得到。

5、【器材與試劑】實驗儀器高級型分光光度計、離心機、臺天平、剪刀、研缽、漏斗、移液管實驗試劑丙酮、碳酸鈣3.實驗材料植物葉片【實驗步驟】色素的提取：取新鮮葉片，剪去粗大的葉脈并剪成碎塊，稱取0.5 g放入研 缽中加純丙酮5 mL，少許碳酸鈣和石英砂，研磨成勻漿，再加80%丙酮5 mL， 將勻漿轉(zhuǎn)入離心管，并用適量80%丙酮洗滌研缽，一并轉(zhuǎn)入離心管，離心后棄 沉淀，上清夜用80%丙酮定容至20 mL。測定光密度：取上述色素提取液1 mL，加80%丙酮4 mL稀釋后轉(zhuǎn)入比色 杯中，以80%丙酮為對照，分別測定663nm、645nm處的光密度值。按公式（3）、（4）、（5）分別計算色素提取液中葉綠素a、葉綠素b、及葉 綠素a+b的濃度。再根據(jù)稀釋倍數(shù)分別計算每g鮮重葉片中色素的含量。【注意事項】由于植物葉子中含有水分，故先用純丙酮進行提取