Endostatin基因轉(zhuǎn)染人臍帶血CD34-造血干細胞的研究課件

1、Endostatin基因轉(zhuǎn)染人臍帶血CD34+造血干細胞的實驗研究江蘇省腫瘤醫(yī)院內(nèi)科 朱梁軍 馮繼鋒立項依據(jù) 新生血管形成決定著腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，拮抗腫瘤新生血管形成是治療腫瘤的有效途徑之一。 血管內(nèi)皮抑制素(Endostatin)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的強效血管生成抑制因子，它能特異性抑制腫瘤血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，從而抑制腫瘤新生血管形成。 人類造血干細胞是良好的基因轉(zhuǎn)移靶細胞，來源廣泛，取材方便，適用于體外培養(yǎng)，擴增量大，目的基因在體外易于導入。 為探討轉(zhuǎn)染人Endostatin基因療法對腫瘤生長的抑制作用，我們利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將人Endostatin基因?qū)肴四殠а狢D34+造

2、血干細胞中，并應用PCR及Western bolt方法檢測人Endostatin的轉(zhuǎn)染和表達。材料 質(zhì)粒PLNCX-endo含有人Endostatin的全長cDNA，由第二軍醫(yī)大學南京軍醫(yī)學院徐根興教授惠贈。 包裝細胞PA317、NIH3T3細胞由第二軍醫(yī)大學微生物教研室惠贈。 限制性內(nèi)切酶Hind，Cla購自GIBCO公司，Endostatin單抗購自西安今邁生物工程公司，PCR試劑盒及PCR引物由上海生物工程公司合成。 新生兒臍帶血由南京市鼓樓醫(yī)院婦產(chǎn)科提供。方法 1、 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體擴增及鑒定：重組質(zhì)粒PLNCX/Endo轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5，擴增；堿裂解法小量提取質(zhì)粒經(jīng)Hind

3、和Cla酶切鑒定。 2、 包裝細胞PA317的轉(zhuǎn)染及病毒液制備：用電穿孔法將25ug重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入PA317細胞，孵育24小時后加入G418 500g/ml篩選，2周后抗性克隆開始出現(xiàn)，挑選克隆擴大培養(yǎng)，收集病毒上清，細胞株凍存。過濾并濃縮病毒上清液，-70保存?zhèn)溆?。用NIH3T3細胞進行病毒滴度測定。方法3、 CD34+干細胞的分離純化：無菌選取順產(chǎn)新生兒臍血，迅速置于盛有肝素抗凝液的儲血袋中，密閉袋口備用。8小時內(nèi)經(jīng)Mini-MACS分離純化，純度達到90%以上。從1108的界面細胞，平均可以分離獲得（520）105CD34+干細胞。4、將人臍帶血CD34+細胞與生長因子IL-3（50

4、ng/ml）、IL-6（50ng/ml）、和人干細胞因子（SCF 50ng/ml）預培養(yǎng)48小時，8000r/min離心10min后收集細胞，然后重懸于收集的PLNCX/Endo病毒上清液中，與相同濃度的生長因子和無菌的Polyrane混合共同孵育，反復進行四次，用G418進行篩選，獲得轉(zhuǎn)染成功的CD34+細胞。方法 5、轉(zhuǎn)染細胞的檢測: PCR檢測Endostatin：選用PLNCX通用引物 E1 5-AGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCG-3 E2 5-ACCTACAGGTGGGGTCTTTCATTCCC-3 提取CD34+/Endo和CD34+/PLNCX細胞基因組DNA，

5、以其為模板，加入引物E1和E2，置50ulPCR擴增體系，按94 5min, 94 1min，60 1min，72 1min，共進行30個循環(huán)，最后72延伸10min， 1.5%凝膠電泳分析產(chǎn)物。方法 6、Western blot: CD34+/Endo和CD34+/PLNCX細胞接種于6孔板，2 5105個/孔，培養(yǎng)24h，用1ml無血清培養(yǎng)劑替換原培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集培養(yǎng)上清，濃縮50倍后行Western blot印跡分析。方法 7、統(tǒng)計學分析: 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)標準差表示，比較采用團體檢驗。結(jié)果圖1. 經(jīng)Mini-MACS分離純化CD34+干細胞的FACS分析結(jié)果圖2 擴增質(zhì)粒酶切

6、鑒定 1.Hind 單酶切 2.Cla單酶切 3.Hind 及Cla雙酶切 4.Mark550bp重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的擴增及鑒定：重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)Hind及Cla雙酶切，行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在550bp處有特異性條帶出現(xiàn)，說明逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上存在人Endostatin基因結(jié)果 圖3 .轉(zhuǎn)染細胞PCR擴增表達 Mark 2.CD34+/endo細胞3.未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的CD34+細胞 382bp 600bp 400bp 550bp轉(zhuǎn)染細胞的鑒定: CD34+/Endo和CD34+細胞基因組DNA行PCR檢查示，僅CD34+/Endo細胞DNA中有550的特異性擴增條帶結(jié)果 圖4 轉(zhuǎn)染細胞En

7、dostatin蛋白表達 1. CD34+細胞濃縮培養(yǎng)上清液 2. CD34+/endo細胞濃縮培養(yǎng)上清3. 蛋白質(zhì)分子量圖-14kd-24kd-20kd轉(zhuǎn)染細胞蛋白表達鑒定：CD34+/endo細胞72濃縮培養(yǎng)上清用Endostatin單抗行Western blot印跡分析,證實這一條帶為Endostatin蛋白討論 Endostatin是1997年由美國哈佛大學醫(yī)學院的OReilly等從小鼠血管內(nèi)皮細胞瘤(EOMA)的培養(yǎng)上清中提取出的一種新的強效血管生成抑制因子。它由內(nèi)生性膠原羧基端184個氨基酸殘基構(gòu)成，相對分子質(zhì)量為20103。體內(nèi)外實驗表明，Endostatin能特異性抑制血管內(nèi)皮

8、細胞增殖，對轉(zhuǎn)移性腫瘤和原發(fā)性腫瘤的種植瘤均有顯著的抑制作用且無明顯毒副反應。 Collagen的結(jié)構(gòu)及Endostatin的位置討論 Endostatin作用的對象是基因組遺傳相對穩(wěn)定，很少發(fā)生突變的血管內(nèi)皮細胞，所以Endostatin在用于腫瘤治療時,可以避免長期應用后耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生。 目前Endostatin應用于臨床治療腫瘤還有較大困難，主要因為Endostatin缺乏天然折疊結(jié)構(gòu)，是一個極不穩(wěn)定的蛋白，其在體外活性極易喪失。 應用基因工程技術(shù)， 目前很難制備大量具有較高活性的蛋白。此外, Endostatin治療腫瘤是一個長期過程，不但會給病人帶來沉重的經(jīng)濟負擔，反復注射治療也給病

9、人帶來極大的不便 。討論 近年來在干細胞支持下的大劑量化療目前在臨床上已得到廣泛應用，在部分實體瘤的治療中取得了十分理想的效果。 目前研究表明，人類造血干細胞具有多種分化潛能，分化增殖能力強，可向不同的細胞系分化，因此可作為多種目的基因的靶細胞。 造血干細胞來源廣泛，取材方便，適用于體外培養(yǎng)，擴增量大，目的基因在體外易于導入。在細胞因子的剌激下，目的基因?qū)爰湫纬筛?祖細胞的頻率高達30%，甚至有報道達80%。 造血干細胞生命周期長，體外培養(yǎng)可生存達3-4個月，有利于目的基因的長期表達。導入目的基因的人外周血造血干細胞經(jīng)過體外擴增后可安全回植到體內(nèi)或植入到組織配型相同的受體內(nèi)并存活。 討論 轉(zhuǎn)基因療法在理論上是一個較為可行和理想的選擇。這樣機體可自主產(chǎn)生高活性蛋白,不存在人工合成時經(jīng)常出現(xiàn)的內(nèi)毒素污染的問題，而且一次性治療目的基因可在體內(nèi)較長時間內(nèi)穩(wěn)定表達。目前已有一些在小鼠模型中成功應用病毒作為載體進行抗腫瘤血管形成的報道。在現(xiàn)有的多種基因轉(zhuǎn)導方式中，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的基因轉(zhuǎn)染為最常用。 討論 由于逆轉(zhuǎn)錄病毒能整合到宿主細胞染色體中，因而目的基因能隨宿主細胞分裂而遺傳給子代，在宿主細胞中能獲得長期穩(wěn)定表達。 在本實驗中，我們應用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體將人內(nèi)抑素的基因?qū)肴四殠?/p>