guan-3-動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)PPT103頁(yè)課件

1、第 3 章動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)動(dòng)物的細(xì)胞與組織培養(yǎng) 定義：從動(dòng)物體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)生理環(huán)境，在體外建立無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使之生存和生長(zhǎng)，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。1 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)群體培養(yǎng)（mass culture）：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，匯合（confluence）后形成均勻的單細(xì)胞層克隆培養(yǎng)（clonal culture）：培養(yǎng)高度稀釋的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱(chēng)為克隆。群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右） Definitions of Tissue Culture Termscell culture - the

2、maintenance and growing of dispersed cells outside the organism.Secondary cultureCells taken from a primary culture and passed or divided in vitro. These cells have a limited number of divisions or passages.tissue culture - the maintenance of a tissue or fragment in a way that may allow differentiat

3、ion and preservation of the architecture and/or function monolayer - single layer of cells growing on a surfaceorgan culture - maintenance of tissues, whole or parts of organs in a way that may allow differentiation and preservation of the architecture and/or functionexplant - an excised fragment of

4、 an organ which usually retains some degree of tissue architecture原代培養(yǎng) （primary culture）：即細(xì)胞或組織離開(kāi)機(jī)體后的首次培養(yǎng)。primary culture - started from cells, tissues or organs taken directly from an animal傳代（passage） ： 培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)到一定的密度后轉(zhuǎn)移到新的容器中培養(yǎng)或需要更換到新的培養(yǎng)液稱(chēng)為傳代或傳代培養(yǎng)。subculture - the transplantation of cells from one

5、 culture to another (passaging)細(xì)胞系（cell line）：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即成細(xì)胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系所組成。如果不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限，可稱(chēng)為有限細(xì)胞系。如果可以連續(xù)傳代則稱(chēng)為連續(xù)細(xì)胞株原代培養(yǎng)細(xì)胞成功傳代即為細(xì)胞系。cell line - arises from the primary culture at the time of the first subculture - finite life spancontinuous cell line - a cell line which has been transforme

6、d - infinite life span細(xì)胞株（cell strain）：從培養(yǎng)細(xì)胞中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。 克?。╟lone）：亦稱(chēng)無(wú)性系。指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。2 發(fā)展歷史動(dòng)物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)技術(shù)起源于19世紀(jì)所應(yīng)用的某些胚胎學(xué)技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)的奠基人是美國(guó)生物學(xué)家Harrison。在1907年采用蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法將蛙胚的神經(jīng)組織培養(yǎng)在淋巴液中，保持存活了幾周時(shí)間，并觀察到細(xì)胞突起的生長(zhǎng)過(guò)程。Harrison - - isolated pieces of frog embryonic tissue known to

7、 give rise to nerve fibres - grew them in frog lymph - observed outgrowth of axons over period of weeks in 1907. 法國(guó)學(xué)者Carrel功不可沒(méi)。他1923年設(shè)計(jì)的卡氏培養(yǎng)瓶，用雞胚抽提液培養(yǎng)心肌組織取得成功并維持34年之久,特別注意到實(shí)驗(yàn)中的無(wú)菌操作。表三、實(shí)驗(yàn)室中常用的幾種細(xì)胞系細(xì)胞系名稱(chēng)細(xì)胞類(lèi)型來(lái)源3T3成纖維細(xì)胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細(xì)胞Henrietta Lacks BHK21成纖維細(xì)胞敘利亞倉(cāng)鼠PtKl上皮細(xì)胞袋鼠L6成肌細(xì)胞大鼠PCI2嗜鉻細(xì)胞大鼠SP2漿細(xì)胞小鼠SP20

8、骨髓瘤漿細(xì)胞小鼠CHO卵巢細(xì)胞中國(guó)地鼠Henrietta Lacks, American black ,died of cancer of uterine cervix in 1951 3 應(yīng)用領(lǐng)域生產(chǎn)單克隆抗體和疫苗。組織與器官再生、培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞基因工程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的生物制品 （1）病毒疫苗：乙肝疫苗(HbsAg)、脊髓灰 質(zhì)炎疫苗(Polio)、狂犬疫苗(Rabies)等。（2）非抗體免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素（IFN ）、 白細(xì)胞介素（IL ）、B 細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （BCGF ）、巨噬細(xì)胞激活因子（MAN） T 細(xì)胞替代因子（TRF）等。（3）多肽生長(zhǎng)因子：神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF ）、 成纖維

9、細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、表皮生長(zhǎng)因 子（EGF）、血清生長(zhǎng)因子（SF）等。（4）酶類(lèi)：組織血纖維溶酶原激活劑（tPA ）等。（5）激素：紅細(xì)胞生成素（EPO）、促黃體生成素（LH）、促濾胞素（FSH）等。（6）腫瘤特異性抗原：癌胚抗原（CEA）等。（7）單克隆抗體（ MCAB ）。（8）病毒殺蟲(chóng)劑：桿狀病毒等。（9）皮膚移植：?jiǎn)渭?xì)胞培養(yǎng)等。 3.1.1 動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)問(wèn)題一與微生物、植物細(xì)胞相比，動(dòng)物細(xì)胞有哪些特殊之處？動(dòng)物細(xì)胞與微生物細(xì)胞相比，主要有以下不同：（1）動(dòng)物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大，無(wú)細(xì)胞壁。（2）動(dòng)物細(xì)胞倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢，易 受污染。（3）培養(yǎng)過(guò)程需氧量少，對(duì)機(jī)械攪拌或剪 切力敏

10、感。（4）動(dòng)物細(xì)胞間主要以聚集體形式存在。（5）原代細(xì)胞一般繁殖50代左右即退化 死亡。3.1.2 體外培養(yǎng) 原代培養(yǎng)（亦稱(chēng)初代培養(yǎng)）傳代培養(yǎng)（亦稱(chēng)繼代培養(yǎng)）。Primary Cultureretention of the 3D shapeoutgrowth and migration of cells3.1.3 動(dòng)物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)的生長(zhǎng)特性 體外培養(yǎng)細(xì)胞類(lèi)型1 粘附型細(xì)胞 anchoragedependent 粘附生長(zhǎng)是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長(zhǎng)發(fā)育的基本存在方式。粘附有兩種含義：一是細(xì)胞之間相互接觸；二是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合。 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞是必須附壁即附著在固

11、體表面生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞布滿表面后即停止生長(zhǎng)，這時(shí)若取走一片細(xì)胞，存留在表面上的細(xì)胞就會(huì)沿著表面生長(zhǎng)而重新布滿創(chuàng)面, 稱(chēng)為單層附壁培養(yǎng)。 細(xì)胞貼壁延展過(guò)程Contact inhibitionWhen cells contact each other, they cease their growth. Cells arrest in G0 phase of the cell cycle.Transformed cells will continue to proliferate and pile up each other.體外培養(yǎng)細(xì)胞類(lèi)型（形態(tài)）1 成纖維型2 上皮型3 游走型4 多形型（一）成纖維

12、細(xì)胞型細(xì)胞 Fibroblast外形與體內(nèi)成纖維細(xì)胞形狀相似，細(xì)胞大致呈梭形或不規(guī)則形。前者貼壁后呈長(zhǎng)梭形，圓形細(xì)胞核位于中央，胞質(zhì)外伸出23個(gè)長(zhǎng)短不同的突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀、漩渦狀走向。多數(shù)細(xì)胞之間排列疏散，有較大的細(xì)胞間隙。有時(shí)也相互平行排列，成群細(xì)胞呈現(xiàn)放射狀、旋渦狀等形式。心肌，平滑肌、血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)常呈此類(lèi)型。（二）上皮型細(xì)胞 Epithelial cell類(lèi)似上皮細(xì)胞的細(xì)胞，特點(diǎn)是：扁平狀，形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞貼壁后呈三角形及不規(guī)則扁平的多角形，中央有扁圓形核，生長(zhǎng)時(shí)彼此緊密連接成單層細(xì)胞。因?yàn)橄嗷頂D而呈現(xiàn)“鋪路石狀” 。皮膚的表皮細(xì)胞、消化道與呼吸道的上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)

13、胞、消化腺上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等， Hela（三）游走型細(xì)胞 wandering分散生長(zhǎng)，一般不連接成片形成群落；細(xì)胞胞質(zhì)常伸出偽足和突起；在培養(yǎng)器皿壁上生長(zhǎng)位置不固定，呈活躍的游走和變形運(yùn)動(dòng)，速度快且方向不規(guī)則。該類(lèi)細(xì)胞不穩(wěn)定，外形不規(guī)則且不斷變化，當(dāng)細(xì)胞密度增大、連接成片時(shí)，形狀類(lèi)似于成纖維樣細(xì)胞型或上皮細(xì)胞型。表現(xiàn)這種細(xì)胞形態(tài)的主要是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞，如顆粒性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞等。 （四）多形型細(xì)胞 Polymorphic多形型細(xì)胞是一些形態(tài)上不規(guī)則的細(xì)胞。多形型細(xì)胞不常見(jiàn)，只有某些像神經(jīng)組織細(xì)胞等難以確定其穩(wěn)定形態(tài)的，才可歸于多形細(xì)胞。體外培養(yǎng)呈

14、現(xiàn)多形型細(xì)胞的細(xì)胞最常見(jiàn)的是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 影響細(xì)胞形態(tài)的因素能夠影響細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的主要因素包括：血清成分、培養(yǎng)基成分及添加成分、培養(yǎng)基的酸堿度、氣相環(huán)境、溫度等。例如，一些已分化的細(xì)胞在有無(wú)血清的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，形態(tài)特征就會(huì)有所差異。形態(tài)會(huì)因條件而改變（來(lái)源、生長(zhǎng)條件和功能狀態(tài)不同）。 2 非粘附型細(xì)胞（懸浮型細(xì)胞）體外生長(zhǎng)不貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)，因此也叫懸浮型細(xì)胞。一些在體內(nèi)原本就以懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)的細(xì)胞或微生物，當(dāng)接種于體外環(huán)境中也可以以懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。血液白細(xì)胞、淋巴組織細(xì)胞，某些腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系等都屬此類(lèi)細(xì)胞。這類(lèi)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)是胞體始終為球形。懸浮培養(yǎng)類(lèi)似微

15、生物的深層培養(yǎng)。由于是懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞密度一般都較高，培養(yǎng)的效率也高、操作也容易。這種方法有多方面的優(yōu)越性，易于大規(guī)模生產(chǎn)，便于過(guò)程的控制。可惜能在懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)的細(xì)胞種類(lèi)有限，且不太方便觀察。 3.2 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 的基本技術(shù)3.2.1 體外培養(yǎng)的條件3.2.1.1 與微生物細(xì)胞培養(yǎng)相比動(dòng)物 細(xì)胞培養(yǎng)的特殊性大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞只有附著在固體或半固體的表面才能生長(zhǎng)。 動(dòng)物細(xì)胞對(duì)于營(yíng)養(yǎng)要求更加苛刻，除氨基酸、維生素、鹽類(lèi)、葡萄糖或半乳糖外，還需要血清。 對(duì)于培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)性更差，對(duì)環(huán)境極其敏感，包括 pH 、溶解氧、溫度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需嚴(yán)格監(jiān)控。 動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，因此培養(yǎng)

16、時(shí)間較長(zhǎng)。 對(duì)環(huán)境的影響又比微生物為大，因此常用空氣、氧、二氧化碳和氮的混合氣體進(jìn)行供氧和調(diào)節(jié)pH。 培養(yǎng)條件TemperaturepHDissolved gasNutrients培養(yǎng)基20世紀(jì)40年代以后，從事動(dòng)物組織培養(yǎng)的各國(guó)科學(xué)家把研究的重點(diǎn)集中在培養(yǎng)基的改造上。1951年， Earle等人開(kāi)發(fā)了供動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基。 MediaThe choice of media is cell type specific and often empirical - no all purpose medium.Should provide: nutrients, buffering capac

17、ity, isotonic, and be sterile天然培養(yǎng)基動(dòng)物血清、組織提取液、雞胚胎提取液等優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高缺點(diǎn)：成分復(fù)雜、來(lái)源有限、成本較高?。ㄌィ┡Ｑ宓鞍踪|(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素、多種生長(zhǎng)因子等成分。合成培養(yǎng)基Earle 于1951年首次使用。優(yōu)點(diǎn)：成分已知、易控制缺點(diǎn)：無(wú)法替代一些未知成分解決途徑合成培養(yǎng)基中添加小牛血 清，彼此互補(bǔ)無(wú)血清培養(yǎng)基血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)：含有豐富的利于細(xì)胞生長(zhǎng)的成分血清培養(yǎng)基缺點(diǎn)：對(duì)后期產(chǎn)物的分離、提純及檢測(cè)造成干擾。來(lái)源有限、成本較高無(wú)血清培養(yǎng)基：試圖全部替代血清成分，尤其是生長(zhǎng)因子（例如胰島素）、激素（例如生長(zhǎng)激素）等。 培養(yǎng)過(guò)程圖解細(xì)胞系生長(zhǎng)過(guò)

18、程的3個(gè)主要階段 （一）原代（初代）培養(yǎng)期 指從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代培養(yǎng)這個(gè)階段，一般持續(xù)1-4周。在這個(gè)階段，細(xì)胞比較活躍，有細(xì)胞分裂，但不旺盛。組織和細(xì)胞剛離體，生物學(xué)特性變化不大，具有二倍體遺傳特性，最接近和反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性，很適合做藥物測(cè)試，細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。（二）傳代期 原代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便稱(chēng)為細(xì)胞系，在全生命期中該階段的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。一般情況下，當(dāng)傳代10-50次后，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以致完全停止。 （三）衰退期 該階段細(xì)胞仍然生存，但是增殖很慢或不增殖。細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后開(kāi)始衰退凋亡。 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程生長(zhǎng)曲線Kinetics of growth phase

19、Logarithmic scale!Cells reach confluence (cover all available surface)每代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線：潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停止期（平臺(tái)期） 每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程分為以下幾個(gè)時(shí)期游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停止期（平臺(tái)期）游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱(chēng)懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10分鐘一4小時(shí)貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時(shí)貼壁。 底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等 血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物

20、上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）潛伏期: 此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為624小時(shí)。 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂 機(jī)制：接觸抑制、密度依賴(lài)性小結(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)無(wú)血清培養(yǎng)基在實(shí)驗(yàn)研究中的特殊意義細(xì)胞類(lèi)型及生長(zhǎng)特點(diǎn)細(xì)胞系生長(zhǎng)階段和各階段特點(diǎn)細(xì)胞系生長(zhǎng)曲線及各期特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)2常用的培養(yǎng)方法懸滴培養(yǎng)Hangingdrop cultivation培養(yǎng)瓶培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)Rotate tube cultivation克隆培養(yǎng)

21、法Cloning culture technique細(xì)胞同步化培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng) 分批式batch，流加式fedbatch，半連續(xù)式semicontinuous，連續(xù)式，灌流式perfusion 三 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng) 取材TrypsinEDTAcollagenase取材部位是否準(zhǔn)確組織是否保持活性材料處理是否恰當(dāng)2 原代培養(yǎng)組織塊培養(yǎng)3 傳代培養(yǎng)消化法一般傳代培養(yǎng)的步驟 (1) 吸出培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液。(2) 加入胰蛋白酶和EDTA混合液蓋滿瓶底。(3) 25分鐘后檢查，如有細(xì)胞間隙變大，細(xì) 胞質(zhì)回縮現(xiàn)象，終止消化。(4) 吸出消化液，加入PBS液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)以 免細(xì)胞流失，洗去殘留的消化液

22、。如果單 用胰蛋白酶，可直接加入培養(yǎng)液。(5) 用吸管輕輕吹打瓶壁，使細(xì)胞脫落制成懸 液，計(jì)數(shù)后記錄其濃度。（6）重新接種培養(yǎng)。四 建立細(xì)胞系過(guò)程腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)與建系過(guò)程以人上皮型食管癌109細(xì)胞系的建立為例介紹一下具體的建系過(guò)程：（1）取材食管癌患者的手術(shù)標(biāo)本（2）原代培養(yǎng)1）食管腫物組織放入含青霉素和鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)液內(nèi)，于4下靜置2小 時(shí)。2） 然后將組織剪切成1-2mm3的小塊。用含 青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液洗 滌后，接種于預(yù)先涂有鼠尾膠原的玻璃培 養(yǎng)瓶中。3） 于37、CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2小時(shí)后，再 補(bǔ)加含20%的小牛血清的RPMI 1640培 養(yǎng)

23、液，繼續(xù)培養(yǎng)。（3）建系過(guò)程組織塊在接種1周后，上皮細(xì)胞從組織塊周?chē)蛲庋杆龠w移和生長(zhǎng)，相互連接成片。2周后，可以見(jiàn)到成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。8周后，上皮細(xì)胞生長(zhǎng)開(kāi)始明顯加快，并向周?chē)由?。用胰蛋白酶消化法和刮脫法等手段除掉成纖維細(xì)胞。這樣處理后的細(xì)胞在傳代三次后，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞呈現(xiàn)上皮狀，核清晰可見(jiàn)核仁。2周后細(xì)胞形成群落。第4代后細(xì)胞開(kāi)始呈單層生長(zhǎng)，命名為ECA109。 ECA109 經(jīng)生物學(xué)特性分析后確定細(xì)胞系建立成功建立細(xì)胞系的要求國(guó)際上對(duì)Certified cell的確定尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)1 組織來(lái)源2 細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)：形態(tài)，特異結(jié)構(gòu)，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，分裂指數(shù)，接種率，特異性如腺細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞3 培

24、養(yǎng)條件和方法細(xì)胞系和細(xì)胞株鑒定鑒定指標(biāo)：純度，細(xì)胞學(xué)特性，穩(wěn)定性，污染情況鑒定方法：細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，繪制生長(zhǎng)曲線，計(jì)算分裂指數(shù)，染色體組型和帶型分析，同工酶酶譜檢測(cè)檔案資料及管理使用：美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫(kù)ATCC,人遺傳突變細(xì)胞庫(kù)HGMR,細(xì)胞衰老細(xì)胞庫(kù)CAR細(xì)胞計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)平均，若壓中線者，只計(jì)算壓左線和上線邊的細(xì)胞。細(xì)胞密度個(gè)/ml平均細(xì)胞數(shù)x103x稀釋倍數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定細(xì)胞活力測(cè)定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。1 細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn) 單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可

25、見(jiàn)的克隆?？寺⌒纬陕视脕?lái)表示細(xì)胞的增殖能力 克隆形成率比克隆形成數(shù)接種細(xì)胞數(shù) 缺點(diǎn)：操作繁瑣 優(yōu)點(diǎn)：精確、可靠2. 臺(tái)盼藍(lán)法活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力 3 四唑鹽（MTT）比色法四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)，原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值 MTT法簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒牲試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。 （1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)

26、板；103-104 細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200ul（96孔培養(yǎng)板每孔容積370ul），37、5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間） （2）加入2mgml的MTT液（50ul孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。 （3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150ul孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。 （4）酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值（檢測(cè)波長(zhǎng)570nm），記錄結(jié)果，繪制生長(zhǎng)曲線。操作步驟:細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。液氮罐CryopreservationHow does

27、freezing induce damage? cool too fast formation of ice crystals inside the cell cool too slow hypertonic extracellular solution dehydration transport of water across membrane thermo dynamics of ice formation kinetics of ice growth Thawing rate is also important (thaw rapidly) 最適度以下的最適度以上的慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序： 當(dāng)

28、溫度在-25 以上時(shí)， 12 /min 當(dāng)溫度達(dá)-25 以下時(shí)， 510 /min 當(dāng)溫度達(dá)-100時(shí)，可迅速放入液氮中細(xì)胞凍存器簡(jiǎn)易程序： 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過(guò)線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12 的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。低溫保護(hù)劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。細(xì)胞凍存方法1 預(yù)先配

29、制凍存液： 含20%血清培養(yǎng)基 10% DMSO 2 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入 適量?jī)龃嬉? 用吸管吹打制成細(xì)胞懸液 （1106 5 106細(xì)胞/ml)3 加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷 凍細(xì)胞名稱(chēng)和冷凍日期。4 存活率可達(dá)80一90。DMSO液用培 養(yǎng)液配好，避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害 細(xì)胞。細(xì)胞復(fù)蘇方法（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37 38 水浴中，使其融化（1分鐘左右）。（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍 以上。（3）低速離心10分鐘。（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì) 胞。五 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)1 基本流程2 生物反應(yīng)器系統(tǒng)（1）生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)依據(jù)

30、除了以人工誘變?yōu)槟康牡呐囵B(yǎng)外，用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)原則應(yīng)該是盡量模擬培養(yǎng)物在生物體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境。由于動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的特殊性，如貼壁、脆弱等，與微生物細(xì)胞培養(yǎng)不同，需要特別注意反應(yīng)器結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)以及特殊載體的選擇。（2）分類(lèi)一般有微載體式、中空纖維式、灌注培養(yǎng)式、旋轉(zhuǎn)壁式等幾種新型的反應(yīng)器等。（3） 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的載體實(shí)現(xiàn)規(guī)?；毙杞鉀Q的問(wèn)題 問(wèn)題一 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的載體微載體培養(yǎng)技術(shù)1967年，Van Wezel開(kāi)發(fā)了微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。微載體是直徑60-250m的微珠。多用帶不同基團(tuán)的葡聚糖交聯(lián)成幾種大分子，使其帶有適當(dāng)電荷或介質(zhì)，以利于細(xì)胞的貼壁及生長(zhǎng)。 *貼壁培養(yǎng)的載體材料 與生物反應(yīng)器系統(tǒng)主要有轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、玻璃珠、微載體系統(tǒng)等。后者是一重要技術(shù)，包括微載體、多空載體、微囊 *一種微載體產(chǎn)品及孔狀的顯微結(jié)構(gòu)材料：生物相容性，機(jī)械穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性（4）生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)與工藝問(wèn)題二 系統(tǒng)構(gòu)建問(wèn)題三 傳代技術(shù)問(wèn)題四 培養(yǎng)工藝與微載體結(jié)合的生物反應(yīng)器系統(tǒng)（5）培養(yǎng)工藝連續(xù)灌注培養(yǎng)生長(zhǎng)在載體上的動(dòng)物細(xì)胞收獲細(xì)胞一個(gè)問(wèn)題：怎樣實(shí)現(xiàn)接種傳代培養(yǎng)？球傳球技術(shù)（