天然功能性食品添加劑

1、天然功能性食品添加劑一一酪蛋白磷酸肽的研究進(jìn)展摘要：酪蛋白磷酸肽(CPPs)是含有成簇的磷酸絲氨酸的生物活性肽，現(xiàn)已證 明，CPPs具有重要生理功能。本文就CPPs的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、制備工藝、檢 測(cè)方法、生理功能及應(yīng)用進(jìn)行了系統(tǒng)的概述。關(guān)鍵詞：酪蛋白磷酸肽；結(jié)構(gòu)；制備；生理功能；應(yīng)用引言酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphope Ptides，CPPs)是以牛奶酪蛋白為原料， 經(jīng)過(guò)單一或復(fù)合蛋白酶的水解，再對(duì)水解產(chǎn)物分離純化后得到的含有磷酸絲氨酸 簇的天然生理活性肽1。CPPs能促進(jìn)機(jī)體腸粘膜對(duì)鈣、鐵、鋅和硒，尤其是鈣 的吸收和利用，被譽(yù)為“礦物質(zhì)載體”。CPPs是目前唯一促進(jìn)鈣吸收的活性

2、肽， 同時(shí)在提高機(jī)體免疫力、改善繁殖性能等方面也有重要作用。日本、德國(guó)等國(guó)家 已把CPPs定為功能性食品，與CPPs相關(guān)的研究越來(lái)越受到我國(guó)科學(xué)家和食品工 作者的廣泛關(guān)注。CPPs的結(jié)構(gòu)牛乳酪蛋白的主要成分為a s1、a s2、p和k -酪蛋白，除k 一酪蛋白外， a和p 一酪蛋白都具有成簇存在的磷酸絲氨酸殘基(Ser P)。酪蛋白經(jīng)體外酶 水解后，產(chǎn)生CPPs，CPPs的核心部位是由3個(gè)磷酸絲氨酸殘基組成的一個(gè)一 Ser(P) 一殘基簇，后面緊接著2個(gè)一 Glu 一殘基，即一 serP 一 SerP 一 SerP 一 Glu 一 Glu 一，現(xiàn)已證明這個(gè)結(jié)構(gòu)是發(fā)揮其生物活性必不可少的。Hir

3、oshil等1974年用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，酪蛋白可在動(dòng)物體內(nèi)形成CPPs，并確 定其結(jié)構(gòu)為 serP 一 serP-SerP 一 Glu 一 Ile 一 Pro 一 Asn。1996 年 Nieholasf 習(xí)等用胰蛋白酶水解酪蛋白，得到包含有一 SerP 一 SerP 一 SerP-Glu 一 Glu 一 序列的CPPs，從而得知了 CPPs實(shí)際上是一類(lèi)含有磷酸絲氨酸和谷氨酸的短肽， 其產(chǎn)品分子量不均一 2。CPPs的理化性質(zhì)2.1溶解性CPPs產(chǎn)品具有良好的溶解性，其pH值為2.010.0，其溶解性除 在pH值4.0約為90%外，其他均高于90%，且溶解性隨pH值的增高而增大。 2.2起泡性C

4、PPs產(chǎn)品較酪蛋白具有更好的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。2.3乳化力CPPs產(chǎn)品乳化力較好。但與酪蛋白相比有所下降。同時(shí)，CPPs產(chǎn) 品的乳化性和乳化穩(wěn)定性與酪蛋白相比，分別下降了 2.89%和1.45倍。2.4熱穩(wěn)定性 在CPPs產(chǎn)品加工時(shí)可以進(jìn)行有效的殺菌處理，在100 C 30 min條件下殺菌不會(huì)使產(chǎn)品外觀改變。CPPs作為鈣、鐵吸收促進(jìn)劑，Ca2+的存在 不會(huì)影響產(chǎn)品的色澤3。CPPs的制備工藝在Hannu等】4的一項(xiàng)研究中總結(jié)了制備生物活性肽(包括CPPs)的途徑 主要有以下3種：一是在體內(nèi)通過(guò)消化酶的水解，二是用有蛋白水解性的微生 物發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵乳類(lèi)，三是利用蛋白酶的水解。除了以上幾種

5、酶水解的方法外， 重組DNA技術(shù)也可以用來(lái)制得人類(lèi)所需要的肽段或其前體，某研究者于1999 年成功地從Escherichia colt中表達(dá)重組了人類(lèi)的a S1-酪蛋白，并分離純化 了它。傳統(tǒng)的工業(yè)生產(chǎn)CPPs 一般以酪蛋白或牛奶為原料，用蛋白酶水解，使 CPPs游離，用離子交換法或酶法脫除苦味成分，制備低純度產(chǎn)品。高純度產(chǎn)品 可采用膜分離、離子交換法、反向高效液相色譜法等手段進(jìn)行精制。近年來(lái)發(fā)展 起一種制備CPPs的方法是微生物發(fā)酵法，即直接利用微生物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生 的蛋白酶（復(fù)合）降解蛋白質(zhì)，可達(dá)到較高的水解度，從而相對(duì)地降低酶法生產(chǎn) 活性肽的成本5。目前一般采用具專(zhuān)一性蛋白酶如胰蛋白酶，

6、胃蛋白酶-胰蛋白酶，凝乳酶- 胰蛋白酶，堿性蛋白酶等水解酪蛋白制取CPP。CPP的分離方法有鈣-乙醇沉淀 法、膜分離法、離子交換法等。常用的方法為鈣-乙醇沉淀法,工藝流程見(jiàn)圖16:4 CPPs的檢測(cè)方法目前，CPPs的檢測(cè)通常采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC法）或高效液 相毛細(xì)管區(qū)帶電泳法（HPEC）進(jìn)行分離，并結(jié)合末端氨基酸分析技術(shù)以確定各種 磷酸肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)。Le-mieux 7將分子篩色譜與反相HPLC聯(lián)用，成功分離 并鑒定多種種CPPs。通過(guò)鉬藍(lán)比色法等可測(cè)定CPPs中磷酸基團(tuán)的含量。Miquel 等8采用RP- HPLC- ESI- MS /MS第1次成功地分離出12種CPPs

7、。我國(guó)分離技術(shù)較為落后，龐廣昌等9對(duì)直接定磷法，SDS-聚丙烯酰胺凝 膠電泳（SDS）法，聚丙烯酰胺等電聚焦電泳（IFE）法進(jìn)行比較，這3種 方法均可對(duì)CPPs進(jìn)行定量測(cè)定，分別適用于產(chǎn)量測(cè)定、組分測(cè)定和較精確測(cè)定。 2002年周杏琴等10用反相C18液相制備色譜柱，經(jīng)過(guò)2次不同梯度的洗脫， 得到了 4種不同組分的CPPs。這些方法都需要昂貴的儀器和藥品，且要求較高 的操作技術(shù)，因此，CPPs檢測(cè)方法的簡(jiǎn)化仍需要進(jìn)一步研究。5 CPPs的生理功能及作用機(jī)理5.1促進(jìn)腸道對(duì)礦物元素的吸收和利用早在20世紀(jì)40年代Mellander等首次從酪蛋白的胰蛋白酶水解產(chǎn)物分離 到磷酸肽，并證明這些肽的鈣鹽

8、在生理pH值下具有非常好的溶解性，無(wú)論正常 嬰兒還是佝僂病患兒，對(duì)CPPs形式的鈣比對(duì)自然條件下的鈣都能更好地利用。 研究發(fā)現(xiàn)CPPs可增加鈣的生物利用率，在缺乏維生素D情況下，患有佝僂病小 孩服用酪蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化的產(chǎn)物可強(qiáng)化骨骼鈣化5。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，CPPs 可在中性或偏堿性條件下阻止鈣的沉淀，從而促進(jìn)鈣在小腸中吸收。CPPs雖可抑制磷酸鈣形成沉淀，卻不能使已形成磷酸鈣溶解，CPPs的結(jié)構(gòu)， 特別是其分子內(nèi)親水和疏水氨基酸的排布決定了它在磷酸鈣品體增長(zhǎng)中是一個(gè) 重要的調(diào)節(jié)因子。此外CPPs還可促進(jìn)鐵、錳、鋅、硒等吸收11。CPPs促進(jìn)礦物質(zhì)吸收的機(jī)制是：CPPs帶有較多負(fù)電荷，既可以抵抗

9、消化道 中各種酶的水解，又可以通過(guò)Ser-P與Ca、Fe等離子螫合形成可溶物，從而 有效地防止溶解的金屬離子在小腸中性或偏堿環(huán)境中與PO 3 -結(jié)合形成磷酸鹽 沉淀。同時(shí)，CPPs還可以有效地增加礦物質(zhì)在體內(nèi)的滯留時(shí)間，最終由于礦物 質(zhì)離子濃度的提高而促進(jìn)礦物質(zhì)的被動(dòng)吸收12。5.2防齲齒，促進(jìn)牙齒、骨骼中鈣的沉積和鈣化一般認(rèn)為，酪蛋白磷酸肽促進(jìn)鈣沉積和骨骼、牙齒鈣化的原因是它在提高 鈣吸收、利用的同時(shí)，減少了破骨細(xì)胞的作用，抑制了骨的再吸收13。牙釉質(zhì)表層的脫礦和再礦化是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程。研究表明，酪蛋白磷酸 肽具有明顯的抗蛀牙功能，可用于防止和治療牙結(jié)石。酪蛋白磷酸肽在溶液中能 與鈣磷結(jié)

10、合成復(fù)合體，即酪蛋白磷酸肽鈣磷復(fù)合體。它是可溶性復(fù)合物，附著在 齲齒損壞處，維持高水平的鈣離子濃度，促使鈣離子進(jìn)入齲損區(qū)，促進(jìn)早期齲損 再礦化，從而有效地防止牙蝕細(xì)菌的侵蝕，達(dá)到抗齲齒的作用14。Cross等15研究證明早期牙釉質(zhì)損傷的修復(fù)是源于酪蛋白磷酸肽(CPP) 與無(wú)定形磷酸鈣(ACP)形成的穩(wěn)定復(fù)合物。CPP形成磷酸鈣運(yùn)載工具，這阻止 了牙釉質(zhì)去礦化并促進(jìn)了再礦化。Yamaguchi等16通過(guò)超聲波脈沖在不破壞情況下測(cè)定牙釉質(zhì)結(jié)構(gòu)的去礦 化和再礦化，得出結(jié)論高濃度CPP - ACP中含有的無(wú)機(jī)成分可增強(qiáng)牙釉質(zhì)的再礦 化。目前，用酪蛋白磷酸肽制成的抗齲齒添加劑是唯一不同于氟化物的添加劑。

11、 5.3促進(jìn)受精能力，提高繁殖性能關(guān)于CPP促進(jìn)受精能力，提高繁殖性能的報(bào)道較少Nagai等(1994)報(bào)道,CPP 能提高精子和卵細(xì)胞的受精率。他們發(fā)現(xiàn)，含CPP培養(yǎng)液中的精子明顯比其他組 具有更高的穿透卵細(xì)胞的能力，進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些精子對(duì)鈣的吸收能力強(qiáng)于 對(duì)照組。此外,CPP還能減少精子的變異程度而使胚胎發(fā)育更加穩(wěn)定。姜毓君等 (2004)研究表明，重組& -CPP二聚體能使家兔精子細(xì)胞內(nèi)的游離Ca2+濃度明顯 升高(P0.01),表明重組& - CPP二聚體和天然CPP 一樣，均可起到促進(jìn)精子細(xì)胞 對(duì)Ca2+吸收的作用；而且與陰性對(duì)照組相比,重組& -CPP二聚體升高精子細(xì)胞內(nèi) 的游

12、離Ca2+濃度的作用較天然蛋白更為明顯(P0.01對(duì)P0.05)。同時(shí)得出，初 步純化的表達(dá)產(chǎn)物與陰性對(duì)照相比，對(duì)家兔精子細(xì)胞表現(xiàn)出差異極顯著的促進(jìn) Ca2+吸收的作用，而精子細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的提高將大大提高精子細(xì)胞的獲能作 用，從而加強(qiáng)精子細(xì)胞穿透卵細(xì)胞的能力，利于精卵細(xì)胞結(jié)合，促進(jìn)受精過(guò)程 17。5.4增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力CPPs結(jié)構(gòu)中起免疫調(diào)節(jié)作用的部位是含有3個(gè)氨基酸殘基的小肽且N端和C 端分別是一個(gè)磷酸絲氨酸殘基，即SerP-X-SerP結(jié)構(gòu)。Ca2+是觸發(fā)淋巴細(xì)胞增殖 反應(yīng)的第一信號(hào)，Ca2+載體A23187對(duì)淋巴細(xì)胞增殖具有絲裂原作用。CPPs通過(guò) SerP Ca2+形成復(fù)合物阻

13、止磷酸鈣沉淀的產(chǎn)生從而促進(jìn)Ca2+的吸收，達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物 免疫機(jī)能的作用18。CPPs還通過(guò)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞因子的水平來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)物免疫功能。5.5細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用Cpps促腫瘤細(xì)胞凋亡的作用已經(jīng)在人腸上皮腺瘤細(xì)胞HT- 29細(xì)胞、Caco2 細(xì)胞、白血病細(xì)胞HL- 60以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞PC12等細(xì)胞模型中得到證明。 上述腫瘤細(xì)胞可以被0-Cpps觸發(fā)凋亡。Cpps誘導(dǎo)了惡性腫瘤細(xì)胞凋亡卻未對(duì) 非惡性細(xì)胞(如CHO細(xì)胞和脾細(xì)胞)起到同樣的作用，提示其具有潛在的藥理 學(xué)意義。因此，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)肽可能成為潛在的抗癌藥物19。6 CPPs的應(yīng)用CPPs在食品工業(yè)上的應(yīng)用酪蛋白磷酸肽是作為吸收促進(jìn)劑用于開(kāi)發(fā)制

14、造鈣、鐵功能食品的關(guān)鍵性原 料，也是迄今為止唯一成功應(yīng)用于功能性食品的生理活性肽。目前，在國(guó)外市場(chǎng) 上已有含酪蛋白磷酸肽的許多適用于兒童老人、孕婦等不同人群的各種保健食 品，諸如糖果、飲料、餅干、奶酪制品、甜點(diǎn)、畜肉制品、各種乳制品等。酪蛋 白磷酸肽在日本、澳大利亞、東南亞、歐洲等國(guó)家和地區(qū)已廣泛應(yīng)用于鈣強(qiáng)化乳 制品、果汁飲料、蛋白飲料和速溶飲品、運(yùn)動(dòng)食品、糖果 營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑，以及 防齲齒的口香糖中20。Cpps在藥物中的應(yīng)用由于CPPs是從天然蛋白中提取的多肽，具有致敏性小、無(wú)細(xì)胞毒性、安 全可靠的優(yōu)點(diǎn)，因此充分運(yùn)用這些特點(diǎn)，可用于對(duì)佝僂病,牙科病和骨質(zhì)疏松癥 等疾病的治療；制成抗蛀牙牙膏，

15、漱口液或含片等，還制成可促進(jìn)動(dòng)物體外受精 和細(xì)胞融合的生化制劑等21。CPPs在動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用CPPs在動(dòng)物生產(chǎn)上主要是作為一種功能性的飼料添加劑使用。添加到日糧 中促進(jìn)動(dòng)物對(duì)礦物質(zhì)離子的吸收利用。Ashida等人(1996)試驗(yàn)表明，在低鈣 日糧中添加0.5%-1.0%的CPPs可提高蛋雞的蛋殼強(qiáng)度，降低破蛋率，增強(qiáng)機(jī) 體的體質(zhì)，減少腿病的發(fā)生。在種豬日糧中添加CPPs能顯著提高卵細(xì)胞的受精 率，提高種畜繁殖性能。對(duì)懷孕母畜及種用家畜，還可防止其他常量微量礦物元 素的缺乏。在仔豬日糧中添加CPPs可促進(jìn)鐵的吸收，防止?fàn)I養(yǎng)性缺鐵貧血，并 能顯著提高仔豬血清中特異性IgA、IgM、IgG的含量

16、，從而增強(qiáng)仔豬的免疫力 22。7結(jié)束語(yǔ)隨著生活水平的不斷提高，人類(lèi)鈣營(yíng)養(yǎng)素不足的問(wèn)題日益受到廣泛的關(guān)注。 目前，國(guó)外已將CPPs應(yīng)用于兒童咖喱飯、飲料、口香糖等食品和保健品中。 對(duì)兒童缺鈣、老年人骨質(zhì)疏松、不育癥的治療和牙齒保健方面的研究和應(yīng)用也在進(jìn)行之中。還有人研究了酪蛋白、脫脂乳蛋白和CPPs的致敏反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)CPPs的致敏性很小，表明它能夠適用于對(duì)牛奶過(guò)敏的體質(zhì)。由于我國(guó)民眾膳食組成以植物性食物為主，其中含有大量的影響鈣、鐵、 鋅吸收因子，如植酸、草酸、纖維素等，沒(méi)有大量消費(fèi)乳制品的習(xí)慣，缺鈣尤 為嚴(yán)重。目前，我國(guó)從兒童到中老年人各年齡組的人群，普遍存在缺鈣問(wèn)題。 CPPs不僅可促進(jìn)鈣的吸

17、收，對(duì)鐵、鋅的吸收利用也有良好的促進(jìn)效果，且 CPPs來(lái)源于牛乳蛋白質(zhì)，具有不良反應(yīng)小、安全可靠的優(yōu)點(diǎn)，即使超量服用也 不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生任何毒副作用，這更使得CPPs在營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化食品和保健食品中 的應(yīng)用備受矚目。因此開(kāi)發(fā)添加CPPs的營(yíng)養(yǎng)食品和保健品，能真正達(dá)到有效補(bǔ) 充人體缺乏的礦物質(zhì)的目的，滿足人們的營(yíng)養(yǎng)需求23。參考文獻(xiàn)段俊紅，王之盛，周安國(guó).酪蛋白磷酸肽(CPP)與鈣、鐵營(yíng)養(yǎng)研究進(jìn)展 J.飼料工業(yè)，2007, 28(6):37-40.張黎明，袁永俊，徐夢(mèng)虬.酪蛋白磷酸肽的研究進(jìn)展J.生命科學(xué)儀 器，2009, 7(1):38-41.劉文，陳有亮.酪蛋白磷酸肽的功能及其制備J.科技通報(bào)，20

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