人源抗腫瘤壞死因子噬菌體抗體的基因結(jié)構(gòu)分析

1、人源抗腫瘤壞死因子_ 噬菌體抗體的基因結(jié)構(gòu)分析a人源抗月中瘤壞死因子0噬菌體抗體的基因結(jié)構(gòu)分析袁 斌 何 君 俞曉峰 王 慧 劉懷田 周育森 黃 策() 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所北京 100071a摘要 從混合的噬菌體抗體庫中篩選到了抗人TNF的人源單克隆抗體，并對(duì)篩選到的抗體基因a進(jìn)行了序列測(cè)定和分析。結(jié)果表明,篩選到的4個(gè)特異性抗TNF噬菌體抗體克隆的重鏈基因序列 相同 , 該重鏈基因長(zhǎng)681 bp , 編碼 227 個(gè)氨基酸殘基屬于人免疫球蛋白第 ? 家族 , 其中 1,119 位氨() ( ) 基酸殘基為重鏈可變區(qū)VH,120,227 位為重鏈恒定區(qū) 1 CH1 。 4 個(gè)噬菌

2、體抗體克隆的輕鏈均缺失 , 因此實(shí)際上篩選到的是單重鏈抗體 。對(duì)重鏈基因編碼的重鏈蛋白的特性進(jìn)行了分析。關(guān)鍵詞 腫瘤壞死因子; 噬菌體顯示; 單克隆抗體; 重鏈 ; 測(cè)序a The gene sequencing and analysis of anti 0TNFhuman monoclonal antibodiesYuan Bin , He J un , Yu Xiaofeng , Wang Hui , Liu Huaitian , ZhouYushen , Huang Ce( )Institute of Microbiology and Epidemiology , Academy of

3、MilitaryMedical Sciences , Beijing 100071a Abstract Human anti OTNFmonoclonal antibodies were selected from pooled human antibody combinatorial libraries using phage display technology , and their genes were sequenced and analyzed. The results showeda that the genes encoding heavy chains of the four

4、anti OTNFantibodies were the same , which comprised 681 nu2 cleotidesand encoded a protein of 217 amino acids , belonging to human IgG ? genefamily , wherein 10119() amino acids constituted the V region of the heavy chain VHand1200 227 amino acids constituted the C1 re2( ) gion of the heavy chain CH

5、1. All of the four antibodies lacked the light chain , showing that they were all the same mono heavy chain antibody. The characteristics of heavy chain protein encoded by the heavy chain gene were also analyzed.Key words tumor necrosis factor ; phage display ; monoclonalantibody ; heavy chain ; seq

6、uencing1 抗體庫技術(shù)自 1989 年問世以來, 發(fā)展很快 ,HIV 、 HAV 、 HBV 噬菌體抗體庫由王海濤教授贈(zèng)送。它與傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)相比，具有制作周期短、操作 菌株XL10Blue、質(zhì)粒 p TNF 、 pComb3、 pBluescript 簡(jiǎn)便 、成本低等優(yōu)點(diǎn) , 特別是該技術(shù)可以不經(jīng)免疫而 及輔助噬菌體VCSM13均為本實(shí)驗(yàn)室保存。直接制備人源抗體，這對(duì)于制備針對(duì)于人自身抗原1 . 2 主要試劑a( a)組分如月中瘤壞死因子 OTNF來說 , 具有其他抗體各種限制性內(nèi)切酶均購自 Promega 公司 , 兔抗 制備方法不可比擬的優(yōu)勢(shì)。我們利用這種技術(shù)從混a合的噬菌體抗體

7、庫中直接篩選到了抗 TNF的人源a M13 IgGOHRP由毛春 生博士贈(zèng)送。重組人TNF按2 抗體 , 并對(duì)抗體的重鏈和輕鏈基因進(jìn)行了克隆和測(cè) 文獻(xiàn)從 p TNF 菌株中提 取和純化。 序 。 1 . 3 混合噬菌體抗體庫的制備分別取HIV、HAV、HBV噬菌體抗體庫保存液各以101 ,分別按文獻(xiàn)3的方法制備噬菌體抗體。用( PBS 緩 沖 液 50 mmol/ L 磷 酸 緩 沖 液 , p H 7 . 2、 1 % 1 材料和方法) BSA 、 150 mmol/ L NaCl 將 3 種噬菌體抗體庫適量稀12釋為10cpu ,并等量混合,凍存于070 ?。1 .1噬菌體抗體庫、菌株及質(zhì)

8、粒)al .4 噬菌體抗體的篩選及鑒定，說明它們是人重組TNF的特異性抗體。文發(fā)表民以純化的人重組TNF為固相抗原按文獻(xiàn)3的2.2 重鏈輕鏈基因的序列測(cè)定a方法用混合的噬菌體抗體庫進(jìn)行 5輪篩選，篩選到 選取4個(gè)特異性抗TNF噬菌體抗體克隆，分別 的陽性克隆按文獻(xiàn)4的方法進(jìn)行鑒定?？寺∑渲劓満洼p鏈基因 , 并進(jìn)行兩端測(cè)序 , 結(jié)果發(fā)現(xiàn) ,4 個(gè)克隆的重鏈基因序列完全一致, 將兩端序列 1 . 5 噬菌體抗體克隆質(zhì)粒 DNA 的提取與純化用經(jīng)過鑒定的噬菌體感染 XL10Blue后鋪板，過測(cè)定的結(jié)果合并后得到圖1的基因序列 。 4 個(gè)克隆 夜培養(yǎng)后挑取單菌 落 接 種 于 含 50 mg/ L 羧

9、 芐 青霉 的輕鏈基因序列不一致, 序列分析表明這4 個(gè)基因( ) 素 、 10 mg/ L 四 環(huán) 素 的 LB 培 養(yǎng) 基 中 培 養(yǎng) 過 夜 , 用 均不能編碼完整的多肽鏈測(cè)序結(jié)果略, 因此 , 這 4 Promega A7100 試劑盒提取和純化質(zhì)粒 。 個(gè)噬菌體抗體克隆的輕鏈實(shí)際上是缺失。2 . 3 重鏈基因結(jié)構(gòu)分析 1 . 6 重鏈 、輕鏈基因的克隆將提 取 和 純 化 的 質(zhì) 粒 分 別 用 Spe I/ Xho I 和 對(duì)圖 1 的重鏈基因序列進(jìn)行分析表明 , 重鏈基 S al I/ Xba I 雙酶切 , 用低熔點(diǎn)膠法回收約 660bp 大 因長(zhǎng) 度 為 681 bp , 編

10、 碼 227 個(gè) 氨 基 酸 殘 基 , 經(jīng) 與 小的 DNA 片 段 , 并 與 用 相 同 酶 切 的 pBluescript KS GeneBank的已知序列對(duì)照分析,它與已知的幾種人+ （?連接,轉(zhuǎn)化XL10 Blue后,在含XOgal、IPTG的LB IgG ? 家族的重鏈基因恒定區(qū)同源性高達(dá)98 % 檢索） 平板上挑取白色轉(zhuǎn)化子, 并用 PCR 和酶切方法鑒定結(jié)果略 , 因此我們獲得的抗體重鏈基因片段屬于IgG 第 ? 家族 。對(duì)照已知的抗體序列 , 我們發(fā)現(xiàn)該插入了重鏈和輕鏈基因片段的轉(zhuǎn)化子。1 . 7 重鏈和輕鏈基因序列的測(cè)定重鏈基因的第 1,119 位的氨基酸殘基為抗體重鏈將

11、帶有重鏈輕鏈插入基因的轉(zhuǎn)化子接種于含的可變區(qū) ,120,227 位氨基酸殘基為抗體重鏈的恒50 mg/ L 羧芐青霉素 、 10 mg/ L 四環(huán)素的 LB 培養(yǎng)基 定區(qū) 。我們?cè)跈z索中沒有發(fā)現(xiàn)與該抗體重鏈可變區(qū) 中培養(yǎng)過夜, 用 Promega A7100 試劑盒提取和純化質(zhì)部分有高同源性的已知基因 , 因此該重鏈基因片段粒 。在 Beckman 373A 型 DNA 自動(dòng)測(cè)序儀上從兩端 為新發(fā)現(xiàn)的抗體重鏈基 因。2 . 4 抗體重鏈基因編碼的重鏈蛋白的特性分析進(jìn)行DNA 序列測(cè)定 。我們?cè)谟?jì)算機(jī)上用 ProtParam Tool 預(yù)測(cè)了重鏈基因編碼的蛋白質(zhì)的特性, 結(jié)果表明 , 重鏈基因編

12、碼2 結(jié)果的蛋白含 227 個(gè)氨基酸殘基, 其中帶負(fù)電荷的氨基酸殘基有12個(gè)，帶正電荷的氨基酸殘基有20個(gè)，各2.1陽性克隆的篩選及鑒定氨基酸的含量和占總蛋白的百分比如表 1所示。其 從最后一次淘篩洗脫下 來的噬菌體克隆中隨機(jī)相對(duì)分子質(zhì)量為2395.8 ,理論等電點(diǎn)為9.28。該蛋 選取64個(gè)克隆,制備噬菌體抗體進(jìn)行鑒定，有61個(gè)a白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和大腸桿菌中的理論半衰 克隆能與TNF結(jié)合，通過其他多種方法確定其中7a （期分別為5.5h 、3min和2min 。個(gè)克隆對(duì)TNF具有高親和性和特異 性結(jié)合能力另不*EirB cAST f.j-JH !1i!ln w1 .勺4=itUI.w.

13、 t L11.T. flrX- 4Xi亡 5TV：T父 trF* &.1青*用H-l對(duì).4wui5 J ：4KJ 1rAE 1 ra口 例一hF 叫工，kKd-7W 14 R4rr iJ*k !3* B4J h-修 fi一1Tn b - .,1j=PAn.4 七r1;- JT f *riFi ip 否EJ*h./*!V；1 1Uill0.rIf IFBli -I1 *ri!sl*：.x z而 TiT rTK. IfUAh： 3.ri L我h ,ir?f gx- Jljn：J? tWA；.*qmtf-.8r：1felt.IS -；事： 口1J!17 1中L*M*i-SiJ.聞宜9A T*- 粉i

14、vT Ci*F.r 邛TItE工ri Aruu.-jT：卜 -：鼻iTH*1*LF w.J /liinI1i1! 1罵.LLjn2t* ity; mr 1f77E VW i T4ir! T*w七 b認(rèn)二次 AIF KT心E小,rtF2 . *1*e 1A小V(工La iV鉗 界:MiIIV_ jlJ *=助胃一 %-igN帛 爐7TE V1Vl.鼻Jsr&FL;? JiQ ;Q*T ,那n*F1期.一 h h51HIzK心， rT再日.1J-i.7.ji ii門 -iT t :rxVK山 KPJiF rW ji,*V tT*si1圖1重鏈測(cè)序結(jié)果及分析人源噬菌體抗體，經(jīng)過基因序列測(cè)定表明，該抗

15、體的3討論重鏈基因與已報(bào)道的人免疫球蛋白重鏈基因序列同a TNF是人體的一種正常成分，如何獲取針對(duì)它 源性高達(dá)98 %，并且其可變區(qū)框架區(qū)和恒定區(qū)與多的高親和性單克隆抗體一直是難題 。噬菌體抗體庫個(gè)已報(bào)道的人免疫球蛋白第 ?家族的框架區(qū)和恒定 技術(shù)的出現(xiàn)為解決這一難題提供了新的途徑 。我們 區(qū)相同。因此，我們篩選到的噬菌體抗體片段屬于a從混合的噬菌體抗體庫中直接篩選到了抗TNF的 人免疫球蛋白第？家族，這說明該基因編碼的確實(shí)是一種人源單克隆抗體, 有廣泛的臨床應(yīng)用前景。 , 克隆選擇的壓力很強(qiáng) ,混合抗體庫中可能還有 篩選a基因測(cè)序結(jié)果表明我們篩選到的4株抗體重鏈 其它能與TNF結(jié)合的抗體克隆

16、 , 但親和性較低, 因6 的 DNA 序列相同 , 均為 681 bp , 編碼 227 個(gè)氨基酸殘而在克隆選擇中也被淘汰 。由過去的報(bào)道也可看() 基 , 其中 1,119 殘基位氨基酸為重鏈可變區(qū)VH, 出 , 在進(jìn)行較少輪次的篩選時(shí), 可以獲得較多的克隆( ) 種類 , 但如果加強(qiáng)克隆選擇的壓力 , 或增加選擇的次120,227 位為重鏈恒定區(qū) 1 CH1 。但在進(jìn)行輕鏈測(cè)序時(shí) , 發(fā)現(xiàn)這 4 株噬菌體抗體的輕鏈序列不僅各 數(shù) , 所獲得的克隆就會(huì)減少 。對(duì)于前兩個(gè)問題 , 解決 不相同 , 而且都不能表達(dá)一條完整的蛋白 。這說明的方法是盡量提高抗體庫的庫容量, 例如使用未成 我們篩選

17、到的噬菌體抗體的輕鏈?zhǔn)侨笔У?, 它們實(shí) 熟的淋巴細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和克隆 。我們使用混合的抗 際上是一種單重鏈抗體 。這說明了兩個(gè)方面的問 體庫也是這個(gè)目的 。對(duì)于第三個(gè)問題如果我們想題 , 一是單獨(dú)的重鏈片段就足以與抗原結(jié)合, 這與 獲得多個(gè)抗體克隆進(jìn)行研究, 可以通過降低選擇壓Ward 等人 報(bào) 道 的 結(jié) 果 一 致 , 以 此 重 鏈 基 因 為 基 力 , 例如減少篩選次數(shù)的方法來解決, 但這樣獲得的 礎(chǔ) , 我們可以方便地構(gòu)建編碼雙特異性 TOC o 1-5 h z 蛋白的基因 , 噬菌體抗體可能結(jié)合活性較低。提供更有價(jià)值的蛋白產(chǎn)物。另外, 在抗原抗體結(jié)合反應(yīng)中 , 重鏈可變區(qū)起主導(dǎo)作

18、用 , 輕鏈可變區(qū)為輔參考文獻(xiàn)助因素 , 因此我們可以篩選的重鏈為基礎(chǔ), 重新構(gòu)建 1 Huse WD , Sastry L ,Iverson SA et al . Generation of large combinatorial 相應(yīng)的輕鏈二級(jí)庫,進(jìn)而篩選到具有更高親和性的 library of the immunoglobulin repertoire inphage lambda . Science , 抗體 。我們進(jìn)行的這幾方面工作結(jié)果即將發(fā)表。 ()1989 , 246 10: 1275 沈倍奮 , 黎燕 , 趙恩峰等 . 腫瘤壞死因子基因克隆表達(dá)及其抗瘤 我們從混合的抗體庫中只篩選到一個(gè)重鏈基2 () 活性的研究. 中國免疫學(xué)雜志 ,1993 ,9 1:22 因 , 這可能有三個(gè)方面原因 。首先是混合抗體庫的 CarlosF , Burton DF. Monoclonal Antibodies from Combinatorial Li2 3容量不夠大 , 不能完全保證模擬體內(nèi)所有抗體 , 因而 braries Course on Cold SpringHarbor Laboratory. 1993 劉懷田 , 王海濤