分子生物學常用儀器介紹-精品課件

1、研究生實驗技能培訓分子生物學實驗常用儀器介紹實驗中心 Biometra梯度PCR儀工作原理多次重復“變性解鏈退火合成延伸”的循環(huán) 主要用途用于DNA的擴增梯度PCR儀特別適用于最適反應條件的摸索，在一次PCR反應中可檢驗多至12個反應溫度，從而輕松得出最適反應溫度。Mullis開車的時候, 瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對面開來的車象是DNA聚合酶，面對面地合成著DNA， PCR儀的應用領域基因、DNA片段的克隆人工基因構(gòu)建DNA序列測定基因定點突變基因型（突變）檢測，SNP分析，遺傳背景分析生物物種鑒定，系統(tǒng)進化研究基因表達量研究（real-time PCR） / 基因表達譜

2、研究（ DNA chip, SAGE）醫(yī)學領域疾病基因檢測 / 遺傳病的產(chǎn)前診斷致病病原體的檢測 腫瘤治療中癌基因的檢測 會推廣到大部分疾病治療前的檢測 DNA指紋、個體識別、親子關系鑒別、法醫(yī)物證 其他: 動、植物檢疫（轉(zhuǎn)基因動植物檢測） PCR具有極高的靈敏度樣品正對照負對照標準分子量 污染是PCR實驗的常見問題。只要實驗室里曾經(jīng)擴增過某個片段，就有可能以后的實驗中發(fā)生污染。因此，做實驗的時候絕對不要忘了負對照。用紫外燈破壞污染物也是一個辦法PCR儀器的變遷三個水浴鍋， 用手移動 （Mullis等人當時用的）電加熱塊 自來水冷卻 （PE，1988）電加熱塊 內(nèi)置循環(huán)液冷卻 （PE，1989

3、）三個加熱塊 機械手 （Stratagene，1994）半導體制冷和加熱 （MJ, PE, BioMetra, Eppendrof）溫度梯度, 熒光檢測 (如 Roche的Lightcycler)風加熱Lab-on-chip式的PCR儀(所謂的芯片PCR)中國的狀況1991年出現(xiàn)三個水浴鍋+機械手的原始PCR儀（華美，復日等）現(xiàn)在以半導體（Peltier板）制冷式為主（杭州博日,上海天呈, 廈門安普利等）PCR儀的種類總體來說可以分為兩大類： PCR擴增儀和實時熒光定量PCR儀 普通的PCR擴增儀又衍生出帶梯度PCR功能的梯度PCR儀、和帶原位擴增功能的原位PCR儀等。 2019年由ABI公司

4、首先推出將擴增和檢測融為一體的實時熒光定量PCR儀，此后很多公司如Eppendorf、ROCHE、Corbett、MJ等等都先后推出不同款式的定量PCR儀， PCR儀的主要參數(shù)溫度控制要精確度 升降溫的速度 更快的升降溫速度，可以縮短反應進行的時間，而且縮短了可能的非特異性結(jié)合、反應的時間，能提高PCR反應特異性。 ABI早就有升降溫速度高達5C eppendorf也推出了升降溫速度可達到6/秒和4.5/秒 現(xiàn)在的PCR儀如ABI，Eppendorf的一般具有兩種溫控模式，即模塊溫控模式（Block-control）和反應管溫控模式）（tube-control）。 模塊溫控模式適用于長時間的靜

5、態(tài)孵育（如連接、酶切、去磷酸化等）。 試管溫控更為準確 梯度PCR儀 “摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題在反應過程中每個孔的溫度控制條件可以在指定范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出最適合的反應條件。 原位PCR擴增 在PCR儀上增加原位PCR模塊就可以在玻片上進行原位PCR擴增， 多槽式高通量PCR儀 隨著基因組高通量研究的需求的提高 MJ有一種一拖四，就是1個主機帶4個擴增槽，每個槽可以獨立控溫，一次可以作96x4個樣品的PCR，不過一旦出現(xiàn)問題4個都不能用了。ABI則在原來的9700的基礎上推出了雙384孔的基座，一次完成384x2個樣品，使得

6、9700的功能又擴展到高通量領域而無需購買新的機器，可惜兩個384槽不能獨立控溫。eppendorf則有一個控制面板，可以控制5個獨立的PCR儀，每臺機器可以聯(lián)合，而且互不影響，但是比較浪費空間。儀器的功能性和人性化設計熱蓋現(xiàn)在的PCR儀一般均配備熱蓋，熱蓋溫度設為105，使樣品管頂部的溫度達到105左右，蒸發(fā)的反應液就不會產(chǎn)生凝集在管蓋上而改變反應體積，這樣用戶就無需再向反應管內(nèi)加石蠟油，直接減少后繼反應的麻煩。 過松 過緊 樣品基座PCR反應多在0.2或者0.5的管子中進行，多數(shù)PCR儀也配備了不同的可更換樣品槽適配不同的樣品管。 eppendorf有一個有趣的設計，一個槽內(nèi)帶有0.2和0

7、.5兩種不同樣品孔，不需更換基座就可以分別使用兩種不同的反應管 ABI的9700就可以更換不同的樣品槽 軟件新的PCR儀都比較注重程序編寫的簡易性。大屏幕，顯示實時信息，倒計時，記憶存儲多個程序、自動斷電保護等都有助于實驗室中的復雜環(huán)境使用。 Biophotometer生物分光光度計技術(shù)參數(shù) 光學系統(tǒng)：吸收單光束分光光度計，配有基準光束 光源：氙燈 波長：氙230 nm; 260 nm; 280 nm; 320 nm; 562 nm; 595 nm 光譜帶寬：5 nm：230 nm320 nm，7 nm：562 nm 595 nm 光度計測定范圍：0000 到 3000 ABiophotome

8、ter 生物分光光度計使用常見問答答：DNA 的在Biophotometer 上能測定的最高濃度并沒有一個絕對的值，這是因為這個濃度跟使用的比色皿光程和樣品的稀釋比例有關的。Biophotometer 測定的最大吸光度是3.0。當測定的DNA 樣品吸光度大于2.5時，建議采用2 mm 的比色皿光程替代10 mm。10 mm光程下測定的A260=2.5 時，相當于125 g/ml 濃度的雙鏈DNA，1.25 g/ml 的1:10 稀釋。如果是在2 mm 光程6.25 g/ml 的1:10 稀釋。答：Biophotometer 在260 nm 下能夠測定的最小吸光度是0.05，這個吸光度值相當于濃

9、度為2.5 g/ml 的雙鏈DNA 的吸光度（約125 ng 雙鏈DNA 溶解在50 l 溶液中），請確保核酸樣品的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因為樣品中的雜質(zhì)和顆粒這些不純物的干擾通常會對光有一定吸收，其值0.1。答：Biophotometer 在260 nm 下能夠測定的最小吸光度是0.05，這個吸光度值相當于濃度為2 g/ml 的RNA的吸光度（約100 ng 雙鏈DNA 溶解在50 l 溶液中），請確保核酸樣品的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因為樣品中的雜質(zhì)和顆粒這些不純物的干擾通常會對光有一定吸收，其值0.1。請注意，這個值跟儀器無關，核酸的吸光度必需大于0.1

10、，其值才有效和可靠，因為樣品中的雜質(zhì)和顆粒這些不純物的干擾通常會對光有一定吸收，其值3.0A，請檢查1 比色皿是否被完全壓入比色皿槽內(nèi)，出現(xiàn)加號有可能是比色皿的基座擋住了光線的通路。2 您使用的比色皿的中心高度是否在8.5 mm ？3 比色皿中是否加入了足夠量的空白對照溶液？答：A230 產(chǎn)生負值主要是由于在很低DNA 濃度的溶液中的一些其他成分的干擾所導致的。在下一個測定中，需要降低樣品的稀釋度，A230 的負值會被校正。同時需要注意的是A260 的讀數(shù)也必需大于0.1 才能保證可靠的結(jié)果。答：Bradford 方法中使用的試劑在和塑料長期接觸后會使塑料發(fā)生損傷，這種試劑不可以在塑料比色皿中

11、放置超過5 分鐘，測定值的波動是由于試劑與塑料表面發(fā)生反應后，導致吸光度發(fā)生變化而產(chǎn)生的，在使用這個方法時，建議使用玻璃比色皿。核酸與蛋白的電泳分析瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中可用于科研及檢測分析電泳槽水平平板垂直平板垂直電泳系統(tǒng)凝膠濃度選擇瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍電泳緩沖液 常用三種緩沖液 Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）TBE與TPE：緩沖容量高，DNA分離效果

12、好，但TPE在DNA片段回收時含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀TAE：緩沖容量低，但價格較便宜，因而推薦選用TAE。緩沖液中的 EDTA 可螯合二價陽離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴增產(chǎn)物降解核酸電泳的指示劑指示劑：溴酚蘭二甲苯青溴酚蘭：在堿性液體中呈紫蘭色二甲苯青：水溶液呈蘭色電泳時，其遷移速率與雙鏈線性DNA大致相當載樣緩沖液指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液作用：增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預測核酸電泳的速度和位置使樣品呈色，使加樣操作更方便核酸電泳的染色劑最常用的染色劑溴化乙錠銀染色蛋白電泳的染色劑最

13、常用的染色劑考馬斯亮藍G 考馬斯亮藍 R 溴化乙錠（ethidium bromide，EB）是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光可在凝膠電泳液中加入終濃度為0.5ug/ml的EB，有時亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色1015min瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般5ng溴化乙錠太多，凝膠染色過深，核酸電泳帶看不清時，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀察銀染色：銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂

14、糖凝膠染色靈敏度比EB高200倍，但銀染色后，DNA不宜回收BIO-PROFIL凝膠成像分析系統(tǒng)主要用途瓊脂糖電泳，聚丙烯酰胺電泳，DNA、RNA和蛋白質(zhì)1D2D電泳凝膠，Southern Northern和Western印跡膜；點雜交膜；薄層層析板、TCL放射自顯影膠片、菌落等樣品的圖像采集和分析，可對核酸、蛋白質(zhì)的凝膠電泳條帶進行分子量大小及含量分析。基本組成密閉型機箱：一體化全封閉暗箱，設計精巧；最大程度上避免紫外線對人體的傷害。 紫外透射臺：紫外光源波長254/306/365nm，紫外透射面積20 x25cm。 白光板（可選）：透射面積20 x25cm 相機：帶積分功能高清晰黑白攝像頭

15、；高分辨率數(shù)碼相機；高分辨率專業(yè)數(shù)字黑白CCD攝像頭。 鏡頭：電動/自動鏡頭。主要用途（1）圖像獲取圖像獲取容易可以以多種格式存儲獲取粘貼板上的圖像、與其它軟件交換圖像資源圖像復制功能，對所獲取的原始圖像進行剪切、復制主要用途（2）圖像處理彩色圖像轉(zhuǎn)換為黑白灰度圖像圖像的鏡像和旋轉(zhuǎn)圖像反色、即負片效果圖像的對比度亮度調(diào)整圖像的均勻化、平整區(qū)域、背景校正圖像的銳化、柔化、羽化、強化物體邊緣主要用途（3）圖像分析條帶定位：提取圖象中的條帶信息，確定泳道中是否有條帶存在并定位分子量計算：在輸入Mark泳道中各條帶的已知分子量后，由計算機求出指定未知條帶的分子量和bp值（堿基對數(shù)）。密度掃描：對指定泳

16、道進行掃描，繪出掃描曲線，并計算出該泳道中各條帶的密度積分和峰高背景去除：多種去背景的方法，并可對掃描曲線進行去背景后矯正 離心機Avanti J-301高速冷凍離心機主要附件：8*50ml角轉(zhuǎn)（Max 30000rpm） 10*100 ml角轉(zhuǎn)（Max 18000rpm）6*38.5 ml水平轉(zhuǎn)頭（Max 24000rpm）冷凍超速離心機 主要附件：10*2ml角轉(zhuǎn)（Max 130000rpm） 8*8 ml角轉(zhuǎn)（Max 80000rpm）工作原理離心機:利用慣性離心力分離液態(tài)非均相混合物的機械。根據(jù)分離方式可分為：過濾式 分離式沉降式。若被處理的物料為懸浮液就稱為離心沉降；若被處理的物料為

17、乳濁液稱為離心分離。 主要用途主要用于各種生物大分子的分離、純化、濃縮（如對病毒、生物大分子、高聚化合物沉降等）同時還可進行相對分子量的測定等。轉(zhuǎn)子固定角轉(zhuǎn)子水平轉(zhuǎn)子離心力公式：G (xg) = 11.18 (rpm/1000)2 x RR: radius rpm: round per minute離心機的分類分離因數(shù)KC：離心力與重力之比（即U2T /Rg）根據(jù)KC 分為常速 KC 50000 （90000rpm)離心機使用注意事項揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時，應使用帶蓋的離心管，并確保液體不外漏以免腐蝕機腔或造成事故要等到轉(zhuǎn)速為零時才能打開離心機蓋,取出樣品。離心機的正確操作方法離心管的安放：

18、平衡離心速度的設定離心力與離心率離心速度必需根據(jù)離心樣品的平均密度確定For Angle RotorFor Swing Rotor使用后的維護與保養(yǎng)注意腔底的周邊清潔O圈的作用密閉真空，防止樣品飛濺生物安全防護，阻止有害生物樣品外泄增加蓋子與轉(zhuǎn)子體的阻尼，防止蓋子松脫Thermo Forma高溫滅菌二氧化碳培養(yǎng)箱工作原理通過在培養(yǎng)箱箱體內(nèi)模擬形成一個類似細胞/組織在生物體內(nèi)的生長環(huán)境如： 恒定的酸堿度（pH值：7.2-7.4） 穩(wěn)定的溫度（37C） 較高的相對濕度（95%） 穩(wěn)定的CO2水平（5%） 來對細胞/組織進行體外培養(yǎng)的一種裝置。 二氧化碳培養(yǎng)箱的基本的要求一是能夠?qū)囟?、二氧化碳濃度和濕度提供最精確穩(wěn)定的控制二是能夠?qū)ε囵B(yǎng)箱內(nèi)的微生物污染進行有效的防范，并且能夠定期消除污染 溫控系統(tǒng)溫度控制 根據(jù)加熱方式分為氣套式和水套式具備相互獨立三重溫度控制功能的二氧化碳培養(yǎng)箱，即箱內(nèi)溫度控制、超溫報警控制和環(huán)境溫度監(jiān)控。二氧化碳濃度控制紅外傳感器（IR）或熱導傳感器（TCD） 帶有CO2測量系統(tǒng)自動校準功能防污染設計和消毒滅菌系統(tǒng)紫外消毒 HEPA過濾器高溫消毒 高溫干熱和高溫濕熱 高壓消毒鍋相關概念介紹滅菌（sterilization） 是指殺滅一切活的微生物。消毒（disinfe