2015版中國(guó)藥典-藥品微生物檢查-PPT課件

1、藥品微生物檢查 本課件是結(jié)合中國(guó)藥典 2010年版與2015年版通則微生物內(nèi)容第三次公示稿(2014-09-28發(fā)布)進(jìn)行講解。網(wǎng)址：/cms/newscenter/publicity/000978.html2015年版微生物學(xué)檢驗(yàn)中的重大修訂及意義1、實(shí)驗(yàn)環(huán)境的重大修訂無(wú)菌檢查環(huán)境潔凈度規(guī)定微生物限度檢查環(huán)境潔凈度規(guī)定2、培養(yǎng)系統(tǒng)的重大修訂無(wú)菌檢查中培養(yǎng)基的修訂微生物計(jì)數(shù)法中培養(yǎng)基的修訂控制菌檢查法中控制菌的修訂抑菌效力測(cè)定法中培養(yǎng)基的修訂3、對(duì)一、二、三部微生物學(xué)附錄的整合、修訂2015年版微生物學(xué)檢驗(yàn)中的重大修訂及意義 與USP35版、EP7.0版、JP16版比較，2015年版中國(guó)藥典微

2、生物學(xué)檢驗(yàn)體系規(guī)劃收載的項(xiàng)目和內(nèi)容已基本趨向一致，將使我國(guó)藥典的微生物學(xué)檢驗(yàn)成為一個(gè)比較完備的標(biāo)準(zhǔn)體系，其意義在于：1、全面與國(guó)際藥典標(biāo)準(zhǔn)接軌；2、從對(duì)終產(chǎn)品的檢驗(yàn)向過程控制轉(zhuǎn)變。 藥品微生物檢查1、無(wú)菌檢查法2、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法非無(wú)菌藥品的微生物限度一、無(wú)菌檢查法總則：環(huán)境、設(shè)備、人員培養(yǎng)基：品種、制備、滅菌、貯存、適用性檢查稀釋液、沖洗液：品種、制備、滅菌方法適用性試驗(yàn)：直接接種法、薄膜過濾法供試品的無(wú)菌檢查：供試品的處理、對(duì)照試驗(yàn)、直接接種法、薄膜過濾法、培養(yǎng)及觀察結(jié)果判斷1.總則1）對(duì)象：無(wú)菌檢查法系用

3、于檢查藥典要求無(wú)菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無(wú)菌的一種方法。若供試品符合無(wú)菌檢查法的規(guī)定,僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。一、無(wú)菌檢查法1.總則2）環(huán)境：應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，試驗(yàn)環(huán)境必須達(dá)到無(wú)菌檢查的要求，（ 9203 藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則:環(huán)境潔凈度B 級(jí)背景下的局部A 級(jí)潔凈度的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行） 【 10版：應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行】，其全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。A 級(jí)和 B 級(jí)區(qū)域的空氣供給應(yīng)通過終端高

4、效空氣過濾器（HEPA） 。 一、無(wú)菌檢查法1.總則2）環(huán)境：?jiǎn)蜗蛄骺諝鈪^(qū)、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法（GB/T16292、16293、16294-2010 ）現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度確認(rèn)。隔離系統(tǒng)應(yīng)定期按相關(guān)的要求（【15版9206 無(wú)菌檢查用隔離系統(tǒng)驗(yàn)證指導(dǎo)原則 】）進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無(wú)菌檢查的要求。日常檢驗(yàn)還需對(duì)試驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。一、無(wú)菌檢查法1.總則3）人員：【10版：無(wú)菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識(shí)，并經(jīng)過無(wú)菌技術(shù)的培訓(xùn)?！?5版刪除。一、無(wú)菌檢查法2.培養(yǎng)基一、無(wú)菌檢查法內(nèi)容2010版2015版培養(yǎng)系統(tǒng)硫乙醇酸鹽流體

5、培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)基0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中和或滅活用培養(yǎng)基 0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基2.培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基主要用于厭氧菌的培養(yǎng)，也可用于需氣菌培養(yǎng)。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基適用于真菌和需氣菌的培養(yǎng)。1）培養(yǎng)基的制備及培養(yǎng)條件配制后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在225、避光的環(huán)境若保存于非密閉容器中，一般在3周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般可在一年內(nèi)使用。 一、無(wú)菌檢查法2.培養(yǎng)基2）培養(yǎng)基適用性檢查無(wú)菌檢查用

6、的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基等應(yīng)符合培養(yǎng)基的無(wú)菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無(wú)菌檢查前或與供試品的無(wú)菌檢查同時(shí)進(jìn)行。 一、無(wú)菌檢查法2.培養(yǎng)基2）培養(yǎng)基適用性檢查無(wú)菌性檢查:每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于 5 支（瓶） ，置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng) 14天，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。靈敏度檢查 菌種試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。菌液：濃度100cfu/ml接種：2管+菌液，1管空白結(jié)果判斷：+菌液-生長(zhǎng)良好 空白-無(wú)菌生長(zhǎng)一、無(wú)菌檢查法培養(yǎng)基靈敏度檢查金黃色葡萄球菌胰酪大豆胨液

7、體（瓊脂）培養(yǎng)基【10版：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 】3035 18h24h 銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 白色念珠菌沙氏葡萄糖液體（瓊脂）培養(yǎng)基 【10版：改良馬?。ō傊┡囵B(yǎng)基 】2025【10版：23-28 】24h48h黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基或用適宜方法制成孢子懸液 【10版：改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基 】5d7d菌液制備: 取菌種新鮮培養(yǎng)物接種至相應(yīng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)。上述培養(yǎng)物用pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100 cfu的菌懸液。 一、無(wú)菌檢查法培養(yǎng)基接種:取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基

8、7支，每管裝量為9ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支,分別接種相應(yīng)菌液。逐日觀察結(jié)果。 一、無(wú)菌檢查法金黃色葡萄球菌各2支硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基3035 3d銅綠假單胞菌生孢梭菌空白1支枯草芽孢桿菌各2支胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基【10版：改良馬丁培養(yǎng)基】2025 5d白色念珠菌黑曲霉空白1支 結(jié)果判定:空白對(duì)照管應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，若加菌的培養(yǎng)基管均生長(zhǎng)良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。培養(yǎng)基靈敏度檢查4.方法適用性試驗(yàn)（方法驗(yàn)證試驗(yàn)）當(dāng)進(jìn)行產(chǎn)品無(wú)菌檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無(wú)菌檢查。若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。 驗(yàn)證時(shí)，按“供

9、試品的無(wú)菌檢查”的規(guī)定及下列要求進(jìn)行操作。對(duì)每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。方法適用性試驗(yàn)也可與供試品的無(wú)菌檢查同時(shí)進(jìn)行 。一、無(wú)菌檢查法5.供試品的無(wú)菌檢查無(wú)菌檢查法包括薄膜過濾法直接接種法只要供試品性質(zhì)允許，應(yīng)采用薄膜過濾法。供試品無(wú)菌檢查所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法相同。無(wú)菌試驗(yàn)過程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應(yīng)證明其有效性，且對(duì)微生物無(wú)毒性。一、無(wú)菌檢查法陽(yáng)性對(duì)照 應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽(yáng)性對(duì)照菌：無(wú)抑菌作用及抗革蘭陽(yáng)性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對(duì)照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對(duì)照菌；抗真菌

10、的供試品，以白色念珠菌為對(duì)照菌。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的菌液制備同方法適用性試驗(yàn)，加菌量小于100CFU，供試品用量同供試品無(wú)菌檢查時(shí)每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽(yáng)性對(duì)照管培養(yǎng)4872 小時(shí)應(yīng)生長(zhǎng)良好。陰性對(duì)照供試品無(wú)菌檢查時(shí)，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。 一、無(wú)菌檢查法5.供試品的無(wú)菌檢查1. 薄膜過濾法薄膜過濾法應(yīng)采用封閉式薄膜過濾器?！?0版刪除：可用一般薄膜過濾器】。無(wú)菌檢查用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45m。直徑約為50mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)?！?0版刪除：抗生素供試品應(yīng)選擇低吸附的濾器及濾膜。 濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。

11、】使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。一、無(wú)菌檢查法5.供試品的無(wú)菌檢查1. 薄膜過濾法水溶性供試液過濾前應(yīng)先將少量的沖洗液過濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml，且總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。略：不同供試品的過濾方法。增加：具有導(dǎo)管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）供試品一項(xiàng)一、無(wú)菌檢查法5.供試品的無(wú)菌檢查2. 直接接種法直接接種法適用于無(wú)法用薄膜過濾法進(jìn)行無(wú)菌檢查的供試品，即取規(guī)定量供試品分

12、別等量接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。除生物制品外，一般樣品無(wú)菌檢查時(shí)兩種培養(yǎng)基接種的支/瓶數(shù)相等；生物制品無(wú)菌檢查時(shí)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基接種的支/瓶數(shù)為2：1。除另有規(guī)定外，每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時(shí)，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。供試品檢查時(shí)，培養(yǎng)基的用量和高度同方法適用性試驗(yàn)。 一、無(wú)菌檢查法5.供試品的無(wú)菌檢查培養(yǎng)及觀察將上述接種供試品后的培養(yǎng)基容器分別按各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天；接種生物制品供試品的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的容器應(yīng)分成兩

13、等份，一份置3035培養(yǎng)，一份置2025培養(yǎng)。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長(zhǎng)。如在加入供試品后或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14 天后，不能從外觀上判斷有無(wú)微生物生長(zhǎng)，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。 一、無(wú)菌檢查法5.供試品的無(wú)菌檢查結(jié)果判斷陽(yáng)性對(duì)照管應(yīng)生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照管不得有菌生長(zhǎng)。否則，試驗(yàn)無(wú)效。若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，即生長(zhǎng)的微生物非供試品所含

14、。一、無(wú)菌檢查法5.供試品的無(wú)菌檢查結(jié)果判斷當(dāng)符合下列至少一個(gè)條件時(shí)方可判試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效：（1）無(wú)菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無(wú)菌檢查法的要求。（2）回顧無(wú)菌試驗(yàn)過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。（3）供試品管中生長(zhǎng)的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無(wú)菌試驗(yàn)中所使用的物品和（或）無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無(wú)效，應(yīng)重試。重試時(shí)，重新取同量供試品，依法檢查，若無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī)定。 一、無(wú)菌檢查法5.供試品的無(wú)菌檢查一、無(wú)菌檢查法一、無(wú)菌檢查法一、無(wú)菌檢查法一、無(wú)菌檢查法微生物限度檢查法中國(guó)藥典2015年版修訂后將分為三個(gè)附錄：1、非無(wú)

15、菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法2、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法3、非無(wú)菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn) 二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.1 總則：環(huán)境、要求1.2 計(jì)數(shù)方法：平皿法、薄膜過濾法、最可能數(shù)法（MPN法）1.3 計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)：菌種及菌液制備、培養(yǎng)基適用性檢查、計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)、1.4 供試品檢查：檢驗(yàn)量、供試品檢查1.5 結(jié)果判斷1.6 稀釋液、沖洗液及培養(yǎng)基二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：-微生物計(jì)數(shù)法微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氧條件下生長(zhǎng)的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。當(dāng)本法用于檢查非無(wú)菌制劑及其原、輔料等是否符合規(guī)定的微生

16、物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外，本法不適用于活菌制劑的檢查。本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動(dòng)檢測(cè)方法，但必須證明替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.1 總則：1.1 總則：環(huán)境：微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)環(huán)境應(yīng)符合微生物限度檢查的要求。(在不低于GMP 現(xiàn)行版要求的D 級(jí)潔凈環(huán)境、局部潔凈度不低于B 級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行)【10版：在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)】。檢驗(yàn)全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)

17、定期進(jìn)行監(jiān)測(cè)。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.1 總則：如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時(shí), 若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)其有效性及對(duì)微生物無(wú)毒性。供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無(wú)毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查平皿法薄膜過濾法最可能數(shù)法（Most-Probable-NumberMethod，簡(jiǎn)稱MPN 法）。MPN 法用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)精確度較差，但對(duì)于某些微生物污染量很小的供試品，MPN 法可能是更適合的方法。供試品檢查時(shí), 應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇計(jì)數(shù)方法，所選的方法必須具備檢測(cè)充足樣品量的能

18、力，以保證所獲得的試驗(yàn)結(jié)果能夠判斷供試品是否符合規(guī)定。所選方法的適用性須經(jīng)確認(rèn)。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.2計(jì)數(shù)方法：供試品微生物計(jì)數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。 供試品的微生物計(jì)數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)【10版：方法驗(yàn)證】， 以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。 若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)， 計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新進(jìn)行適用性試驗(yàn)。 二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.3 計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計(jì) 數(shù)方法適用性試驗(yàn)1.3.1菌液制備及使用1.3.2計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查1.3.3計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.3 計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計(jì)

19、數(shù)方法適用性試驗(yàn)1.3.1菌液制備及使用菌種試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.3 計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計(jì) 數(shù)方法適用性試驗(yàn)菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2 小時(shí)內(nèi)使用；若保存在28，可在24小時(shí)內(nèi)使用。穩(wěn)定的黑曲霉孢子懸液可保存在28，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。 1.3.1菌液制備及使用二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查試驗(yàn)菌株試驗(yàn)菌液的制備金黃色葡萄球菌CMCC(B) 26 003)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基【10版：營(yíng)養(yǎng)肉湯或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)

20、基】3035，1824小時(shí)銅綠假單胞菌CMCC（B)10 104枯草芽孢桿菌CMCC(B) 63 501白色念珠菌CMCC(F) 98 001沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，2025，23天 【10版：改良馬?。ō傊┡囵B(yǎng)基，2328 ，2448h】黑曲霉CMCC(F) 98 003沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 ，2025，57天 ，或直接獲得豐富孢子【10版：改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基，2328 ，57天】1.3.2計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查【10版】二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查細(xì)菌計(jì)數(shù)金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基3035 不超過3天銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)

21、白色念珠菌玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基2025 不超過5天黑曲霉每一試驗(yàn)菌株平行制備2 管或2 個(gè)平皿；接種量50100cfu ；同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。結(jié)果判定：若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70 %，且菌落形態(tài)大小與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致，判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。 1.3.2計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查【15版】二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)金黃色葡萄球菌胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基3035 不超過3天銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基3035 不超過5天黑曲霉霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)白色念珠菌沙氏葡萄

22、糖瓊脂培養(yǎng)基2025 不超過5天黑曲霉每一試驗(yàn)菌株平行制備2 管或2 個(gè)平皿；接種量不大于100cfu ；同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。結(jié)果判定：被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5-2 范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.3.3計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)供試液制備接種和稀釋抗菌活性的去除與滅活供試品中微生物的回收平皿法薄膜過濾法最可能數(shù)法（MPN 法）結(jié)果判斷1.4.1檢驗(yàn)量檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g、ml 或cm ）。除另有規(guī)定外,一般

23、供試品的檢驗(yàn)量為10g 或10ml；膜劑為100cm ；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。檢驗(yàn)時(shí),應(yīng)從2 個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品,大蜜丸還不得少于4 丸,膜劑還不得少于4 片。一般應(yīng)隨機(jī)抽取供試品，取規(guī)定容器數(shù)，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗(yàn)。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.4 供試品檢查按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測(cè)定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)。陰性對(duì)照試驗(yàn)以稀釋劑代替供試液進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。如果陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查

24、。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.4.2供試品檢查供試液制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性,采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時(shí),應(yīng)均勻加熱,且溫度不應(yīng)超過 45。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基,不得超過 1小時(shí)。 常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經(jīng)確認(rèn)均不適用，應(yīng)建立其他適宜的方法。 二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.4.2供試品檢查供試液制備 水溶性供試品 取供試品，用 pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成 1:10 供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液 pH 值至 68。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步

25、10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。 二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.4.2供試品檢查二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.4.2供試品檢查供試液制備 水不溶性非油脂類供試品 取供試品， 用 pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或 pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制備成 1:10 供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加入表面活性劑如 0.1%的聚山梨酯 80，使供試品分散均勻。若需要，調(diào)節(jié)供試液 pH值至 68。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步 10倍系列稀釋。 二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.4.2供試品檢查供試液制備油脂類供試品 取供試品，加入

26、無(wú)菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使供試品乳化的無(wú)菌聚山梨酯 80或其他無(wú)抑菌性的無(wú)菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過 40（特殊情況下，最多不超過 45），小心混合，若需要可在水浴中進(jìn)行，然后加入預(yù)熱的稀釋液使成 110供試液，保溫，混合，并在最短時(shí)間內(nèi)形成乳狀液。必要時(shí)，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進(jìn)一步 10倍系列稀釋。 二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.4.2供試品檢查供試液制備需用特殊方法制備供試液的供試品 膜劑供試品腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品氣霧劑、噴霧劑供試品貼膏劑供試品平皿法平皿法包括傾注法和涂布法。除另有規(guī)定外，取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)

27、行供試液制備和菌數(shù)測(cè)定，每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平皿。培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 除另有規(guī)定外，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在3035培養(yǎng)3天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在2025培養(yǎng)5 天， 觀察菌落生長(zhǎng)情況,點(diǎn)計(jì)平板上生長(zhǎng)的所有菌落數(shù)，必要時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7 天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平皿不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)兩個(gè)平皿的菌落數(shù)平均值不小于15，則兩個(gè)平皿的菌落數(shù)不能相差1 倍或以上。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.4.2供試品檢查菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 需氧菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于 300cfu 的稀釋級(jí)、霉菌和酵母菌總數(shù)

28、測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu 的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。取最高的平均菌落數(shù)，計(jì)算1g、1ml 或10 cm 供試品中所含的微生物數(shù)。如各稀釋級(jí)的平皿均無(wú)菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1 時(shí)，以1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。 二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查薄膜過濾法除另有規(guī)定外，按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備。取相當(dāng)于1g、1ml 或10 cm 供試品的供試液，若供試品所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液，照方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法加至適量稀釋液中，立即過濾，沖洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏

29、葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿計(jì)數(shù)法，每張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 以相當(dāng)于 1g、1ml 或10cm2供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無(wú)菌落生長(zhǎng)，以1 報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g、1ml 或10cm2供試品）,或1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查MPN 法取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和供試品接種，所有試驗(yàn)管在3035培養(yǎng)35 天，如果需要確認(rèn)是否有微生物生長(zhǎng)，按方法適應(yīng)性試驗(yàn)確定的方法進(jìn)行。記錄每一稀釋級(jí)微生物生長(zhǎng)的管數(shù)，從表3查對(duì)每1g 或1ml 供試品

30、中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.5結(jié)果判斷需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)（包括真菌菌落數(shù)）；霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)（包括細(xì)菌菌落數(shù)）。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌使霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基）進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定。使用選擇性培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。若采用MPN 法，測(cè)定結(jié)果為需氧菌總數(shù)。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查各品種項(xiàng)下規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)解釋如下：101cfu： 可接受的最大

31、菌數(shù)為20；102cfu： 可接受的最大菌數(shù)為200；103cfu： 可接受的最大菌數(shù)為2000：依此類推。若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1.5結(jié)果判斷2.1 總則：環(huán)境、要求2.2 培養(yǎng)基適用性檢查和控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)：菌種及菌液制備、培養(yǎng)基適用性檢查、控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)、2.3 供試品檢查：陰性對(duì)照試驗(yàn)、陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)、耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌2.4 稀釋液二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物

32、限度檢查2.非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：-控制菌檢查法2.1總則控制菌檢查法系用于在規(guī)定的試驗(yàn)條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物。當(dāng)本法用于檢查非無(wú)菌制劑及其原、輔料是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按下列規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品取樣量和結(jié)果判斷等。本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動(dòng)檢測(cè)方法，但必須證明替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。供試液制備及實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求同“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”（通則1105）。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查如果供試品具有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時(shí), 若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)有效性及對(duì)微生物無(wú)毒性。供試液制備時(shí)如果使用了表

33、面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無(wú)毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查2.2 培養(yǎng)基適用性檢查和控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)2.2.1菌液制備2.2.2培養(yǎng)基的適用性檢查2.2.2控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查2.2.3控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2 小時(shí)內(nèi)使用；若保存在28，可在24小時(shí)內(nèi)使用。生孢梭菌孢子懸液可替代新鮮的菌懸液，穩(wěn)定的孢子懸液可保存在28，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。 2.2.1菌液制備二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查試驗(yàn)菌株試驗(yàn)菌液的制備金黃色葡萄球菌CMCC(B) 26003)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪

34、大豆胨液體培養(yǎng)基3035，1824小時(shí)銅綠假單胞菌CMCC（B)10 104大腸埃希菌CMCC（B）44 102 乙型副傷寒沙門菌CMCC（B）50 094 白色念珠菌CMCC(F) 98 001沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，2025，23天 生孢梭菌CMCC（B）64 941 梭菌增菌培養(yǎng)基，厭氧條件下3035，2448 小時(shí)或接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中3035，1824 小時(shí) 2.2.2控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查，檢查項(xiàng)目包括促生長(zhǎng)能力抑制能力指示能力各培養(yǎng)基的檢測(cè)項(xiàng)目及所用菌株見表1。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查2.2.2控制菌檢查用培養(yǎng)

35、基的適用性檢查控制菌檢查培養(yǎng)基特性試驗(yàn)菌株耐膽鹽革蘭氏陰性菌【15版：新增】腸道菌增菌液體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力大腸埃希菌銅綠假單胞菌抑制能力金黃色葡萄球菌紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力+指示特性大腸埃希菌大腸埃希菌麥康凱液體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力大腸埃希菌抑制能力金黃色葡萄球菌麥康凱瓊脂培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力+指示特性大腸埃希菌【10版：大腸菌群】乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力大腸埃希菌抑制能力金黃色葡萄球菌乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基 促生長(zhǎng)能力+指示能力 大腸埃希菌 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基 促生長(zhǎng)能力+指示能力 大腸埃希菌 表1控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力、抑制能力及指示特性二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度

36、檢查液體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢查分別接種不大于100cfu 的試驗(yàn)菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長(zhǎng)于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。固體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢查用涂布法分別接種不大于100cfu 【10版：50100cfu】的試驗(yàn)菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長(zhǎng)于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查培養(yǎng)基抑制能力檢查接種不少于100cfu 的試驗(yàn)菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不短于規(guī)

37、定的最長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，試驗(yàn)菌應(yīng)不得生長(zhǎng)。培養(yǎng)基指示特性檢查用涂布法分別接種不大于100cfu 的試驗(yàn)菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長(zhǎng)于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基上試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查2.2.3控制菌檢查方法適用性試驗(yàn) 試驗(yàn)菌根據(jù)各品種項(xiàng)下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)試驗(yàn)菌株，確認(rèn)耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時(shí),采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗(yàn)菌。結(jié)果判斷上述試驗(yàn)若檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查方法進(jìn)行供試品檢查；若未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)消除供試品的抑菌活性

38、，并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。如果經(jīng)過試驗(yàn)確證供試品對(duì)試驗(yàn)菌的抗菌作用無(wú)法消除，可認(rèn)為受抑制的微生物不可能存在于該供試品中，選擇抑菌成份消除相對(duì)徹底的方法進(jìn)行供試品的檢查。 二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查2.3供試品檢查供試品的控制菌檢查應(yīng)按經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行。供試品檢出控制菌或其他致病菌時(shí),按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn),不再?gòu)?fù)試。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)方法同供試品的控制菌檢查,對(duì)照菌的加量應(yīng)不大于100cfu。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。陰性對(duì)照試驗(yàn)以稀釋劑代替供試液照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。如果陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查控制菌檢

39、查過程：使用無(wú)選擇性增菌培養(yǎng)基（胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）培養(yǎng)，使受損的細(xì)菌得到修復(fù)，提高檢出率。增菌培養(yǎng)-選擇性增菌-選擇性瓊脂二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查2.3供試品檢查2.3.1耐膽鹽革蘭陰性菌【10版：大腸菌群】2.3.2大腸埃希菌2.3.3沙門菌2.3.4銅綠假單胞菌2.3.5金黃色葡萄球菌2.3.6梭菌2.3.7白色念珠菌二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查2.3供試品檢查2.3.1耐膽鹽革蘭陰性菌【15版新增】供試液制備和預(yù)培養(yǎng)取供試品，用胰酪大豆胨液體作為稀釋劑照“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法” （通則1105）制成1：10 供試液，混勻，在2025培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)使供試品中的細(xì)

40、菌充分恢復(fù)但不增殖（約2 小時(shí)）。定性試驗(yàn)除另有規(guī)定外，取相當(dāng)于1g 或1mL 供試品的上述預(yù)培養(yǎng)物接種至腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)2448 小時(shí)后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1824 小時(shí)。如果平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查2.3.1耐膽鹽革蘭陰性菌【15版新增】定量試驗(yàn)選擇和分離培養(yǎng) 取相當(dāng)于0.1g、0.01g 和0.001g（或0.1mL、0.01mL 和0.001mL）供試品的預(yù)培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)2448 小時(shí)。上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊

41、脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1824 小時(shí)。結(jié)果判斷若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，則對(duì)應(yīng)培養(yǎng)管為陽(yáng)性，否則為陰性。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果，從表2 查對(duì)1g 或1ml 供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的最大可能數(shù)。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查取供試液10ml（相當(dāng)于供試品lg、lml、10cm)，直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48小時(shí)。取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5ml MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5小時(shí)、24小時(shí)在366nm紫外光下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽(yáng)性；不呈現(xiàn)

42、熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加人數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽(yáng)性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查2.3.1大腸菌群【10版】如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，則應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時(shí)。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長(zhǎng)的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征相符

43、或疑似，應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的鑒定試驗(yàn)，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查2.3.1大腸菌群【10版】2.3.2大腸埃希菌供試液制備和增菌培養(yǎng) 取供試品，照“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法” （通則1105）制成1：10 供試液。取相當(dāng)于1g 或1mL 供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定的）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)1824 小時(shí)。選擇和分離培養(yǎng)取上述預(yù)培養(yǎng)物1mL 接種至100mL 麥康凱液體培養(yǎng)基中，4244培養(yǎng)2448 小時(shí)。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1872 小時(shí)。結(jié)果判斷若麥

44、康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn), 確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查2.3.3沙門菌含藥材原粉化學(xué)藥和中藥制劑及臟器提取物的口服制劑【10版：含動(dòng)物組織及動(dòng)物類原藥材粉的口服制劑】每10g或10ml不得檢出沙門菌供試液制備和增菌培養(yǎng)取10g 或10mL 供試品直接或處理后接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定的）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)1824 小時(shí)。選擇和分離培養(yǎng)取上述預(yù)培養(yǎng)物0.1mL 接種至10mL RV 沙門增菌液體培養(yǎng)基中

45、，3035培養(yǎng)1824 小時(shí)。取少量RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1848 小時(shí)。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)良好，菌落為淡紅色或無(wú)色、透明或半透明、中心有或無(wú)黑色。用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)1824 小時(shí)，或采用其它適宜方法進(jìn)一步鑒定。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查2.3.3沙門菌結(jié)果判斷若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長(zhǎng)，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn), 確證是否為沙門菌。如果平板上

46、沒有菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層未見黃色黑色，判供試品未檢出沙門菌。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查2.3.4銅綠假單胞菌供試液制備和增菌培養(yǎng)取供試品，照“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法” （通則1105）制成1：10 供試液。取相當(dāng)于1g 或1mL 供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定的）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻。3035培養(yǎng)1824 小時(shí)。選擇和分離培養(yǎng)取上述預(yù)培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1872 小時(shí)。取上述平板上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，或采用其它適宜方法進(jìn)一步鑒定。氧化酶試驗(yàn)將潔凈濾紙片置于平皿內(nèi),用無(wú)菌玻棒取上述平板上生長(zhǎng)的菌落涂于濾紙片上，滴加新配制的1二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液，在30 秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性,否則為陰性。二、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查2.3.4銅綠假單胞菌結(jié)果判斷若溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，且氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行