染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)-PPT課件

1、第一節(jié) 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)一、位置效應(yīng) 位置效應(yīng)（position effect）是指一個(gè)基因由于在基因組的位置發(fā)生改變，而發(fā)生的表達(dá)上的變化。位置效應(yīng)在果蠅中得到了詳盡的研究。野生型w基因使果蠅的復(fù)眼呈紅色。有一個(gè)果蠅品系，由于染色體倒位使w基因座靠近著絲粒處的異染色質(zhì)。在這一新的位置，基因是否表達(dá)因細(xì)胞而異，取決于復(fù)眼早期發(fā)育時(shí)異染色質(zhì)的對(duì)基因表達(dá)的抑制效應(yīng)擴(kuò)展到多遠(yuǎn)。不表達(dá)w基因的細(xì)胞分裂后產(chǎn)生的子代細(xì)胞仍不表達(dá)w基因，產(chǎn)生白眼細(xì)胞克?。欢磉_(dá)w基因的細(xì)胞分裂后產(chǎn)生的子代細(xì)胞都表達(dá)w基因，產(chǎn)生紅眼細(xì)胞克隆。所以，該品系的果蠅的復(fù)眼表現(xiàn)為紅白相嵌，又稱為位置效應(yīng)花斑（position e

2、ffect variegation）。 在正常情況下，轉(zhuǎn)錄因子與w基因的調(diào)控區(qū)結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的起始。然而，在新的位置，緊密包裝的異染色質(zhì)可以阻止轉(zhuǎn)錄因子的靠近。在復(fù)眼發(fā)育的早期異染色質(zhì)擴(kuò)展的范圍會(huì)在不同的細(xì)胞中發(fā)生某種變化，隨后會(huì)被子細(xì)胞穩(wěn)定遺傳。二、活性染色質(zhì)的特征 與非表達(dá)區(qū)域中核小體結(jié)構(gòu)緊密、間隔規(guī)則相比，其核小體組裝較為伸展或不規(guī)則。這樣的一種結(jié)構(gòu)有利于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，以及RNA聚合酶沿模板的滑動(dòng)。在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)以及某些特殊的區(qū)域，核小體的構(gòu)象變化更為明顯，DNase I和微球菌核酸酶等非特異性內(nèi)切酶可用于檢測(cè)這種變化。 DNase I可降解染色質(zhì)DNA可接近的區(qū)域，但是被組裝成核小體的

3、染色質(zhì)DNA則受到保護(hù)，不會(huì)被核酸酶降解。 三、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié) 在原核細(xì)胞中，RNA聚合酶和調(diào)節(jié)蛋白可以自由地接近DNA。由組蛋白和基因組DNA兩部分組成的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)限制了轉(zhuǎn)錄因子對(duì)DNA的接近與結(jié)合，實(shí)際上起著阻遏轉(zhuǎn)錄的作用?；蜣D(zhuǎn)錄需要染色質(zhì)發(fā)生一系列重要的變化，如染色質(zhì)去凝集，核小體變成開放式的疏松結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄因子等更容易接近并結(jié)合核小體DNA。有兩種方式可以顯著改變DNA的易接近性：組蛋白的乙?；秃诵◇w重塑。組蛋白的去乙?；瑒t可以使染色質(zhì)凝集，引起基因沉默。1、組蛋白N端尾的修飾對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及基因轉(zhuǎn)錄的影響 每種核心組蛋白包括一個(gè)80個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的保守的區(qū)域稱為組蛋白折疊域（

4、histone fold domain）和一個(gè)突出于核小體核心之外、由20個(gè)氨基酸殘基組成的N端尾。N端尾的相互作用對(duì)核小體的聚集和染色質(zhì)折疊非常重要，也是組蛋白的主要修飾部位。核小體N端尾的修飾作用包括位點(diǎn)特異的磷酸化、乙?；图谆Ｒ阴；亲钤绨l(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的組蛋白修飾方式，在這里我們也是主要介紹組蛋白的乙?；瘜?duì)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的影響。異染色質(zhì)中的組蛋白一般不被乙?；?，而具有轉(zhuǎn)錄活性的染色質(zhì)常常是高度乙?；?，這些清楚地表明這種類型的修飾與DNA的包裝相關(guān)。 經(jīng)過多年的努力，終于在2019年分離出催化向組蛋白添加乙?；拿?，即組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyl tran

5、sferase, HAT）。許多組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶是以往鑒定過的激活蛋白或輔激活蛋白（coactivator）。輔激活蛋白在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中主要是起橋梁作用，使結(jié)合在DNA上游的轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)合在核心啟動(dòng)子上的轉(zhuǎn)錄機(jī)器發(fā)生聯(lián)系。 組蛋白乙?；癁橐豢赡孢^程，乙?；腿ヒ阴；膭?dòng)態(tài)平衡控制著染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)。組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylase, HDAC）可去除組蛋白上的乙?；?，抑制基因表達(dá)。 2、核小體重塑 核小體重塑涉及在基因組一個(gè)較短的區(qū)域中核小體位置的改變或者結(jié)構(gòu)的改變，是一個(gè)能量依賴的過程，由核小體重塑復(fù)合體（chromatin remodeling complex

6、）催化完成。重塑復(fù)合體利用ATP水解釋放的能量，介導(dǎo)二種主要的反應(yīng)：（1）組蛋白八聚體沿DNA滑動(dòng)；（2）在不改變位置的情況下使核小體變成一種較為松散的結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和染色質(zhì)重塑復(fù)合體的結(jié)合順序因啟動(dòng)子的不同而不同。激活一個(gè)真核生物基因的大致過程如下：（1）某種轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合。（2）一種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。（3）HAT乙?；Y(jié)合位點(diǎn)附近的組蛋白，使核小體之間的聯(lián)系變得松散。（4）染色質(zhì)重塑復(fù)合體催化核小體滑動(dòng)或者在不改變核小體位置的情況下，使核小體的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，暴露出DNA結(jié)合位點(diǎn)。（5）新的轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合。（6）RNA聚合酶與DNA結(jié)合。（7）轉(zhuǎn)錄

7、起始需要來自于特異性轉(zhuǎn)錄因子經(jīng)中介復(fù)合體傳遞來的正調(diào)控信號(hào)。四、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的區(qū)間性 絕緣子（insulator）序列首先在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，以后又在多種真核生物的基因組中被鑒定出來。1985年，Udvadry等在果蠅的基因組中檢測(cè)出了兩個(gè)絕緣子序列，scs和scs（Specialized Chromatin Structure）。scs和scs分別位于果蠅多線染色體S7A7條帶熱激蛋白基因座的兩側(cè)，長度分別是350 bp和200 bp。當(dāng)受到熱激時(shí)，hsp70基因高水平轉(zhuǎn)錄，在多線染色體上形成一個(gè)膨泡。scs和scs就位于膨泡的兩端，是膨泡的邊界元件。在scs和scs的外側(cè)是異染色質(zhì)區(qū)域，所以絕緣

8、子能夠抵擋異染色質(zhì)對(duì)熱激蛋白基因座位的影響，使該座位在結(jié)構(gòu)和功能上都是一個(gè)獨(dú)立的區(qū)域。絕緣子是一組在真核生物基因組中建立獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)的調(diào)控元件，它具有兩種性質(zhì)。第一，當(dāng)絕緣子位于增強(qiáng)子或者沉默子與啟動(dòng)子之間時(shí)可以阻斷增強(qiáng)子對(duì)啟動(dòng)子的作用。第二，絕緣子可以使其界定的基因的表達(dá)不受位置效應(yīng)的影響。在轉(zhuǎn)基因時(shí)，目的基因整合到染色體上的不同位置，因位置效應(yīng)作用基因的表達(dá)水平差異很大。但是，如果在目的基因的兩側(cè)連接上絕緣子，目的基因往往不受染色體位置效應(yīng)的影響。2、基質(zhì)附著區(qū)（matrix attachment region， MAR）無論是在原核細(xì)胞還是在真核細(xì)胞中，基因組DNA形成巨大的環(huán)狀結(jié)構(gòu)

9、，環(huán)的基部附著在染色體骨架上。在細(xì)菌中環(huán)的長度大概是40 kb，而真核生物的DNA環(huán)要長一些，大約60 kb。 在間期，核基質(zhì)是由絲狀蛋白構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，附著于核膜的內(nèi)表面。DNA借著于基質(zhì)附著區(qū)（matrix attachment region，MAR）與基質(zhì)蛋白結(jié)合。因?yàn)镸AR也被用于附著染色體支架，因此也稱為支架附著區(qū)（scaffold attachment region, SAR）。這些MAR/SAR位點(diǎn)長度為2001000 bp，富含AT（占70），但是沒有明顯的一致序列。具有幾個(gè)連續(xù)腺嘌呤的DNA序列有發(fā)生彎曲的趨勢(shì)。與MAR位點(diǎn)結(jié)合的核蛋白識(shí)別彎曲的DNA，而不是特定的序列。在靠

10、近MAR位點(diǎn)的地方經(jīng)常有拓?fù)洚悩?gòu)酶II的識(shí)別位點(diǎn)，意味著每一個(gè)巨大的環(huán)狀DNA的超螺旋程度受到獨(dú)立的調(diào)控。增強(qiáng)子以及其他調(diào)控元件也經(jīng)?？拷麺AR位點(diǎn)。在某些情況下，染色質(zhì)重塑也是從MAR位點(diǎn)開始的，并且影響整個(gè)染色質(zhì)環(huán)。3、基因座控制位點(diǎn)人類的珠蛋白基因簇長約60 Kb，含有5個(gè)功能基因，它們的排列順序是5 GA3。其中在胚胎早期表達(dá)，G和A在胎兒時(shí)期表達(dá)，和在成體中表達(dá)。每個(gè)珠蛋白基因都有自己的一套調(diào)控系統(tǒng)，但它們的表達(dá)還要受到基因簇上游12 Kb的基因座控制位點(diǎn)（locus control region, LCR）的控制。LCR最初是在研究地中海貧血病的過程中被發(fā)現(xiàn)的，地中海貧血是一種由或

11、珠蛋白缺陷導(dǎo)致的血液病。許多地中海貧血是由珠蛋白基因編碼區(qū)突變?cè)斐傻模且灿幸恍┑刂泻Ｘ氀怯捎谥榈鞍谆虼厣嫌?2 Kb的區(qū)域發(fā)生大范圍缺失，導(dǎo)致了整個(gè)基因簇沉默。因此，LCR具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的功能。人類珠蛋白基因LCR的增強(qiáng)子活性已由實(shí)驗(yàn)證明。將連接或不連接LCR的人類珠蛋白基因分別轉(zhuǎn)化小鼠細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，如果缺少LCR，珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平通常不到內(nèi)源小鼠珠蛋白基因的1。若是連接上LCR，外源珠蛋白基因的表達(dá)水平與小鼠自身的珠蛋白基因的表達(dá)水平相當(dāng)。人類珠蛋白基因的LCR含有5個(gè)DNase I超敏感位點(diǎn)（如圖），LCR的增強(qiáng)子活性存在于HS2，3，和4，與HS1，和5無關(guān)。HS5是一種絕緣子

12、，HS1的功能尚未闡明。HS2為一個(gè)典型的增強(qiáng)子，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分析中，可以檢測(cè)到HS2的活性。然而，HS3和HS4只有整合到染色質(zhì)中時(shí)，才能檢測(cè)到其增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的活性。另外，有一種地中海貧血病，HS1上游大約35 Kb的發(fā)生了缺失，珠蛋白基因位點(diǎn)保持完整，然而珠蛋白基因不表達(dá)，原因是缺失導(dǎo)致了整個(gè)基因座產(chǎn)生一種致密的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。所以，珠蛋白基因LCR的另一種功能可能是介導(dǎo)松弛型染色質(zhì)的形成。LCR誘導(dǎo)基因座的染色質(zhì)形成并維持開放的結(jié)構(gòu)是它們不同于增強(qiáng)子的地方。3. 沉默子在釀酒酵母中，HML和HMR位點(diǎn)，以及接近端粒的染色質(zhì)區(qū)域，形成一種抑制性染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，因此在轉(zhuǎn)錄上是沉默的。HM位點(diǎn)上的沉默效應(yīng)是

13、由位點(diǎn)兩側(cè)、短的被稱為沉默子的特異序列起始的。HML的沉默子分別是HML-E和HML-I；HMR的沉默子分別是HMRE和HMRI。沉默子中含有Abflp，Rap1p，和復(fù)制起始位點(diǎn)識(shí)別復(fù)合體（origin recognition complex for DNA replication, ORC）的結(jié)合位點(diǎn)。沉默子結(jié)合蛋白通過募集Sir沉默復(fù)合體起始沉默過程。 第二節(jié) DNA甲基化與基因組沉默DNA甲基化是指在DNA甲基化酶（DNA methyltransferase）的作用下，以S腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到DNA分子的胞嘧啶堿基上形成5甲基胞嘧啶的過程。胞嘧啶的甲基化作用不是隨機(jī)的。

14、在脊椎動(dòng)物基因組中胞嘧啶甲基化僅限于5CG3二核苷酸，植物中僅限于5CG3二核苷酸和5CNG3三核苷酸。在哺乳動(dòng)物的基因組中CpG通常被甲基化，因而在整個(gè)基因組中含量相對(duì)較少，這是由于5甲基胞嘧啶可以自發(fā)脫氨生成胸腺嘧啶，而這種錯(cuò)誤又往往得不到修復(fù)，所以甲基化的CpG突變成了TpG。脊椎動(dòng)物基因組中僅有不到1/4的CpG位點(diǎn)得以保留。在基因組中，CpG二核苷酸并非隨機(jī)分布，基因組的某些區(qū)域其CpG二核苷酸的水平比平均值高1020倍，這些CpG富集區(qū)被定義為GpC島。脊椎動(dòng)物基因許多基因的上游都有CpG島，尤其是在各種組織中都有表達(dá)的管家基因的啟動(dòng)子。DNA甲基化可以引起基因沉默?；虺聊侵敢?/p>

15、相對(duì)非特異性的方式關(guān)閉基因的表達(dá)，它可以影響一個(gè)基因、一個(gè)基因簇、染色體的一個(gè)區(qū)段甚至整條染色體。把甲基化的或未甲基化的基因引入細(xì)胞，檢測(cè)它們的表達(dá)水平，結(jié)果顯示甲基化的DNA不表達(dá)。在檢測(cè)染色體DNA的甲基化模式時(shí)，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化水平與相鄰基因的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。例如，脊椎動(dòng)物管家基因啟動(dòng)子中的CpG在各種組織都保持非甲基化狀態(tài)，而組織特異性的基因僅在其表達(dá)的組織中才是去甲基化的。細(xì)胞在有絲分裂時(shí)可以通過維持甲基化酶使子代細(xì)胞的基因組保持與親本基因組相同的甲基化模式。因此，規(guī)定哪些基因可以表達(dá)的信息也遺傳到子細(xì)胞中。甲基化的生物學(xué)效應(yīng)是由各種mCpG結(jié)合蛋白（methyl-CpG-bind

16、ing proteins, MeCP）介導(dǎo)的。MeCP與啟動(dòng)子區(qū)甲基化的CpG島結(jié)合，募集一些蛋白質(zhì)，形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，阻止轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄。除了直接作用于轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體外，MeCP還可以作為組蛋白去乙?；瘡?fù)合體的組分發(fā)揮作用。MeCP2就是Sin3去乙?；笍?fù)合體的組分。MeCP2識(shí)別并結(jié)合基因上游的甲基化CpG島。復(fù)合體中的HDAC使組蛋白去掉乙?；谑撬沙诘腄NA重新被包裝成緊密的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，使相鄰基因沉默。4、DNA甲基化與基因組印記 在一個(gè)二倍體細(xì)胞中，常染色體基因有兩個(gè)拷貝，一個(gè)來自父本，一個(gè)來自母本。多數(shù)情況下，兩個(gè)基因在功能上是等價(jià)，它們?cè)诒磉_(dá)水平上具

17、有可比性。但在少數(shù)情況下，二倍體細(xì)胞核中同源染色體上的一對(duì)等位基因中只有一個(gè)可以表達(dá)，另一個(gè)因甲基化而沉默，這種現(xiàn)象就是基因印記，就如同基因被打上了親代的印記。對(duì)一些印記基因來說，來源于父本的等位基因不表達(dá)，來源于母本的基因表達(dá)。對(duì)另一些印記基因來說，情況剛好相反。 “印記”首先被用來描述一種遺傳事件。In Pseudococcids or mealybugs (Homoptera, Coccoidea)雌性和雄性都是由受精卵發(fā)育來的。在雌體中，所有的染色體都保持常染色質(zhì)狀態(tài)，是有功能的。然而，將發(fā)育成雄性個(gè)體的胚胎在第六次卵裂以后，有一組染色體轉(zhuǎn)變?yōu)楫惾旧|(zhì)，并且，以后在大多數(shù)組織中一直保持

18、這種狀態(tài)。因此，雄性個(gè)體在功能上是一個(gè)單倍體。在昆蟲中，印記被用來描述雄性個(gè)體中一個(gè)親本基因組的失活，涉及到性別決定。 在人類和小鼠中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了100個(gè)印記基因。研究得比較透徹的兩個(gè)例子是人類的Igf2基因（insulin-like growth facotr-2）和H19基因。Igf2編碼胰島素生長因子2，參與細(xì)胞間信號(hào)傳遞，它和H19位于人類第11號(hào)染色體上相互鄰近的位置。在細(xì)胞內(nèi)，位于父本來源的同源染色體上的Igf2基因是活化的，位于母本來源的Igf2基因被關(guān)閉。H19基因的情況剛好相反：來自母方的拷貝處于工作狀態(tài)，來自父方的拷貝則處于關(guān)閉狀態(tài)?；蚪M印記與基因組甲基化模式有關(guān)。圖顯示了

19、只有父本染色體上Igf2基因和母本染色體上的H19基因被活化的原因。在H19基因下游有一增強(qiáng)子序列，位于Igf2基因和H19基因之間有一絕緣子序列。增強(qiáng)子序列不能激活母本染色體上的Igf2基因，原因是絕緣子序列被一種叫做CTCF的蛋白質(zhì)結(jié)合。CTCF阻斷轉(zhuǎn)錄激活蛋白在增強(qiáng)子序列處激活I(lǐng)gf2基因。在父本染色體上，絕緣子和H19啟動(dòng)子均被甲基化。在這種狀態(tài)下，轉(zhuǎn)錄機(jī)器不能與H19結(jié)合，而CTCF也不能與絕緣子結(jié)合。所以，增強(qiáng)子能夠激活I(lǐng)gf2基因。在父本染色體上，通過MeCP2結(jié)合甲基化的絕緣子，H19基因被進(jìn)一步抑制。 5、X染色體失活 雌性哺乳動(dòng)物有兩條X染色體，而雄性只有一條。如果雌性的兩

20、條X染色體都有活性，那么雌性個(gè)體中由X染色體上的基因編碼的蛋白的合成速率可能是雄性個(gè)體的兩倍。為了避免這種不利事件的發(fā)生，雌性個(gè)體的一條X染色體處于失活狀態(tài)。X染色體失活發(fā)生在胚胎發(fā)育的早期。在雌性哺乳動(dòng)物的間期細(xì)胞核中可見的被稱為巴氏小體（Barr body）的結(jié)構(gòu)就是失活的、完全由異染色質(zhì)構(gòu)成的X染色體。 哺乳動(dòng)物X染色體的失活與X染色體上的Xist基因是否甲基化有關(guān)。起初，兩條X染色體都轉(zhuǎn)錄Xist RNA。在胚胎發(fā)育過程中，活性X染色體上的Xist基因因甲基化而失活。并且，這種甲基化模式一旦被建立在每次細(xì)胞分裂中就被保持下來。因此，X染色體失活是可以遺傳的，在子代細(xì)胞中保持活性X染色體

21、是同一條染色體。 是Xist基因的表達(dá)造成攜帶該基因的X染色體失活。該基因被轉(zhuǎn)錄成一條大分子非翻譯RNA。這種Xist RNA包裹著失活的X染色體，然后從Xist基因開始形成異染色質(zhì)，并向兩個(gè)方向延伸，直至整條染色體都受到影響，形成巴氏小體。失活的X染色體除了Xist基因和幾個(gè)異常的位點(diǎn)外，均被甲基化。在失活的X染色體上，Xist基因是唯一保持活性的基因。 Xist誘導(dǎo)X染色體失活的機(jī)制仍未完全揭示。Xist RNA結(jié)合到X染色體上后，募集介導(dǎo)基因沉默和異染色質(zhì)形成的蛋白質(zhì)。失活X染色體還要發(fā)生以下的變化：首先H3的Lys7發(fā)生甲基化，而活性X染色體上H4是Lys4發(fā)生甲基化；其次，組蛋白H4

22、丟失它的大部分乙酰基團(tuán)；隨后，一種H2A組蛋白的變異體macroH2A取代H2A參與核小體的形成，與H2A組蛋白相比，macroH2A具有一個(gè)額外的C末端結(jié)構(gòu)域，并且僅出現(xiàn)在失活的X染色體上；最后，失活X染色體上的CpG島發(fā)生甲基化。X染色體沉默一旦被形成，就不再需要Xist RNA來維持。第三節(jié)：真核生物的特異性轉(zhuǎn)錄因子真核生物蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)不但需要通用轉(zhuǎn)錄因子，也需要特異性轉(zhuǎn)錄因子。特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合于啟動(dòng)子的上游元件，或者結(jié)合于遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的增強(qiáng)子元件，對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。一個(gè)典型的特異性轉(zhuǎn)錄因子具有下面3個(gè)基本特征：1. 應(yīng)答一種特異性信號(hào)，激活一個(gè)或者一組基因。2. 與大多數(shù)蛋

23、白質(zhì)不同，轉(zhuǎn)錄因子能夠進(jìn)入細(xì)胞核，識(shí)別并結(jié)合于DNA分子上特異性序列。3. 直接或間接地與轉(zhuǎn)錄起始裝置發(fā)生作用。一、轉(zhuǎn)錄因子的分離、鑒定 對(duì)于像酵母、果蠅、以及其他在遺傳上容易操作的真核生物，可以利用經(jīng)典的遺傳分析的方法鑒定編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因。然而，對(duì)于不適合進(jìn)行遺傳分析的脊椎動(dòng)物來說，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子是通過生物化學(xué)的方法純化出來的。1、利用生物化學(xué)的方法分離轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄因子能夠與調(diào)控元件特異性結(jié)合，所以一旦分離出基因的調(diào)控元件，就可以利用這一性質(zhì)把轉(zhuǎn)錄因子從細(xì)胞核中分離來。利用調(diào)控元件分離與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，需要人工合成一段DNA序列，該序列含有幾個(gè)拷貝的這種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。這種人工合成

24、的DNA分子被連接到固體支持物上，形成一個(gè)序列專一性親和柱（sequence-specific affinity column）。 部分純化的含有待分離轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞核抽提物以低鹽緩沖液上樣(100 mM KCl)。不與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的蛋白質(zhì)用低鹽緩沖液從柱中洗出。與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合不緊密的蛋白質(zhì)用含有300 mM KCl的緩沖液洗出。高純度的轉(zhuǎn)錄因子用含有1 M KCl的緩沖液洗脫。最后，還要利用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)檢測(cè)所分離的蛋白質(zhì)能否促進(jìn)含有結(jié)合位點(diǎn)的DNA序列轉(zhuǎn)錄的起始。 接下來，我們可以獲得被純化的轉(zhuǎn)錄因子的部分氨基酸序列，并根據(jù)所確定的氨基酸序列從基因文庫中篩選出編碼該轉(zhuǎn)錄因子的基因，或其cDN

25、A。有了編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因，就可以檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞內(nèi)刺激轉(zhuǎn)錄的能力。 如圖所示，一個(gè)質(zhì)粒載體攜帶有編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因；另一個(gè)質(zhì)粒載體攜帶有報(bào)道基因和轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。兩種質(zhì)粒同時(shí)被引入到缺少編碼轉(zhuǎn)錄因子X和報(bào)道基因的受體細(xì)胞。如果在編碼轉(zhuǎn)錄因子X的質(zhì)粒存在時(shí)，報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，說明蛋白質(zhì)是一種活化子；報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄水平下降，說明蛋白質(zhì)是一種抑制子。2、利用遺傳學(xué)的方法鑒定編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因在酵母中，編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因是通過遺傳分析的手段確定的。下面我們以GAL4基因的分離為例加以說明。當(dāng)酵母菌在含有半乳糖的培養(yǎng)基上生長時(shí)，細(xì)胞內(nèi)參與半乳糖代謝的基因的表達(dá)水平要升高1000倍以上。然而

26、，在gal4突變體中，這些基因的表達(dá)并不升高。 采用突變分析技術(shù)，可以鑒定出半乳糖誘導(dǎo)基因的上游激活序列（upstream activation sequence, UAS），它們均含有一個(gè)或多個(gè)拷貝的17 bp序列，該序列被稱為UASGAL。當(dāng)把一個(gè)拷貝的UASGAL插入到TATA盒上游，TATA盒下游連接一個(gè)LacZ報(bào)道基因，在野生型細(xì)胞中報(bào)道基因的表達(dá)受半乳糖的誘導(dǎo)，然而在gal4突變體中LacZ基因不受半乳糖的誘導(dǎo)。這說明UASGAL是受轉(zhuǎn)錄因子Gal4激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。通過互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)分離出GAL4基因。利用重組DNA技術(shù)，在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)GAL4蛋白，發(fā)現(xiàn)Gal4蛋白與UASGA

27、L序列結(jié)合。這樣，當(dāng)細(xì)胞被涂布在含有半乳糖的培養(yǎng)基上時(shí)，Gal4蛋白結(jié)合到UASGAL上，激活鄰近的啟動(dòng)子。二、轉(zhuǎn)錄因子的功能域 一系列的研究表明，Gal4蛋白有兩種不同的功能域：DNA結(jié)合域（DNA-binding domain）與特異性的DNA序列相互作用；激活域（activation domain）與其他的蛋白質(zhì)相互作用從而刺激從鄰近啟動(dòng)子開始的轉(zhuǎn)錄。在這些實(shí)驗(yàn)中，研究人員檢測(cè)了gal4的各種缺失突變對(duì)蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生的影響。實(shí)驗(yàn)所用的受體細(xì)胞缺少GAL4基因，這樣就可以排除內(nèi)源的野生型Gal4蛋白對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。Gal4蛋白N末端一段短的缺失便會(huì)破壞轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合能力。然而，一系

28、列含有不同長度C末端缺失的Gal4蛋白質(zhì)，只要缺失的范圍不越過第72個(gè)氨基酸殘基，仍然會(huì)保持與UASGAL序列專一性結(jié)合的能力。因此，Gal4蛋白N末端的72個(gè)氨基酸殘基組成的結(jié)構(gòu)域具有與UASGAL序列的結(jié)合能力。 C末端缺失大約125或更多個(gè)氨基酸殘基同樣會(huì)徹底消除Gal4激活轉(zhuǎn)錄的能力，但是這些缺失并不影響它們的DNA結(jié)合能力。如果把Gal4的N末端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與長度不同的C末端片段直接融合所形成的截短的蛋白質(zhì)，盡管這些轉(zhuǎn)錄因子失去了大部分的中央?yún)^(qū)，仍保持有激活報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄的能力。因此，Gal4蛋白C末端大約100氨基酸區(qū)段含有激活結(jié)構(gòu)域，當(dāng)把它與N末端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合后，同樣

29、能夠激活報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄。對(duì)酵母的另一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Gcn4也做了相似的分析。Gcn4調(diào)控多種與氨基酸生物合成有關(guān)基因的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子的C末端60個(gè)氨基酸構(gòu)成的序列含有一個(gè)不同的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Gcn4在靠近多肽鏈的中央有一約有20個(gè)氨基酸構(gòu)成的激活結(jié)構(gòu)域。野生型的Gcn4的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和C末端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間是相對(duì)伸展的區(qū)域，對(duì)蛋白酶高度敏感。有關(guān)Gal4和Gcn4含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)進(jìn)一步的證據(jù)來自結(jié)構(gòu)域交換實(shí)驗(yàn)（domain swapping）。把Gal4和Gcn4的激活結(jié)構(gòu)域與大腸桿菌LexA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合。LexA具有一個(gè)N末端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)Ｒ恍缘嘏clexA

30、操縱序列結(jié)合。在這些研究中，把一個(gè)報(bào)道基因引入酵母細(xì)胞，而報(bào)道基因的上游插入了lexA操縱基因。這時(shí)，報(bào)道基因并不表達(dá)。 接下來，把編碼LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列與編碼Gal4和Gcn4激活結(jié)構(gòu)域的序列連接在一起，構(gòu)成一個(gè)融合基因，并把融合基因?qū)氲浇湍讣?xì)胞。在細(xì)胞內(nèi)，融合基因表達(dá)，產(chǎn)生的融合蛋白由來自于一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和來自于另一轉(zhuǎn)錄因子的激活結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。融合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合到LexA操縱基因上，它的激活結(jié)構(gòu)域激活報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄。所以，轉(zhuǎn)錄激活因子中的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域在序列上是彼此隔開的，彼此獨(dú)立地折疊成不同的三維結(jié)構(gòu)，并且可以獨(dú)立地發(fā)揮作用。

31、1、DNA結(jié)合域（1）螺旋轉(zhuǎn)角螺旋結(jié)構(gòu)域（helix-turn-helix domain) 這是第一個(gè)被鑒定的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域具有兩個(gè)螺旋，中間為一短的轉(zhuǎn)角。靠近C端的螺旋為識(shí)別螺旋（recognition helix），其大小正好適合嵌入DNA的大溝，直接閱讀DNA序列。螺旋轉(zhuǎn)角螺旋的第二個(gè)螺旋橫跨大溝與DNA主鏈相聯(lián)系，增強(qiáng)蛋白質(zhì)與DNA之間的結(jié)合能。（2）鋅指（zinc finger）鋅指為蛋白質(zhì)中一段相對(duì)較短的氨基酸序列圍繞著中央鋅離子折疊，形成的一種相對(duì)獨(dú)立的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。鋅指得名于最初為闡明該結(jié)構(gòu)域的外形而繪制的示意圖：環(huán)形肽段圍繞鋅離子形成一手指狀的結(jié)構(gòu)，而鋅離子則

32、是形成和維持這一結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵。現(xiàn)在知道鋅指有著不同的結(jié)構(gòu)形式，也會(huì)出現(xiàn)在并不與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)中。鋅指的共有序列是：Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X3-Leu-X2-His-X3-His。其中X代表任意氨基酸殘基，下標(biāo)為氨基酸殘基的數(shù)目。 （3）堿性亮氨酸拉鏈（leucine zipper）亮氨酸拉鏈最初是比較酵母轉(zhuǎn)錄激活因子Gcn4、哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子C/EBP(CAAT框及SV40增強(qiáng)子核心序列結(jié)合蛋白)以及癌基因產(chǎn)物Fos、Jun和Myc的氨基酸序列時(shí)被發(fā)現(xiàn)的。這些調(diào)節(jié)蛋白的羧基端都存在一段富含亮氨酸的序列，易于形成螺旋。在螺旋中，每7個(gè)氨基酸殘基就會(huì)有一個(gè)亮氨酸殘基，結(jié)果螺旋的

33、某一側(cè)面，每兩圈就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)亮氨酸，重復(fù)的亮氨酸數(shù)目一般為45個(gè)。螺旋中上的親水氨基酸殘基位于另一面。兩個(gè)單體通過螺旋側(cè)面上的亮氨酸殘基之間的疏水作用力相互齒合形成二聚體，所以說亮氨酸拉鏈?zhǔn)嵌刍Y(jié)構(gòu)域。（4）堿性螺旋環(huán)螺旋（helix-loop-helix）螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域包含4050個(gè)氨基酸殘基，形成兩個(gè)螺旋，中間為長短不一的非螺旋區(qū)（環(huán)）。含有螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)通過螺旋一側(cè)的疏水殘基的相互作用形成同源二聚體或異源二聚體。HLH蛋白在靠近HLH基序的地方也有一與DNA結(jié)合的堿性結(jié)構(gòu)域，因此也稱bHLH蛋白。2、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域本身并不具有調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性的功能，其

34、轉(zhuǎn)錄活化功能是由轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域所決定的。已鑒定出3中不同的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。酸性結(jié)構(gòu)域（acidic domain）人們首先從酵母轉(zhuǎn)錄因子GCN4和GAL4中鑒定出了轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)它們富含酸性氨基酸，因此稱為酸性激活結(jié)構(gòu)域。富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域（glutamine-rich domain）富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域是在轉(zhuǎn)錄因子SP1中首次發(fā)現(xiàn)的。SP1有4個(gè)彼此分開的激活結(jié)構(gòu)域，其中兩個(gè)活性最高的結(jié)構(gòu)域含大約25的谷氨酰胺。 富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域（proline-rich domain）脯氨酸結(jié)構(gòu)域包括一段連續(xù)的脯氨酸殘基，能夠激活轉(zhuǎn)錄，例如轉(zhuǎn)錄因子c-jun中有一個(gè)能夠激活轉(zhuǎn)錄連續(xù)的脯氨酸殘基。三、轉(zhuǎn)

35、錄因子的作用方式1、活化子在第章，我們已經(jīng)描述了在體外Pol II從一條裸露的DNA模板起始轉(zhuǎn)錄所需要的條件。但是細(xì)胞內(nèi)高水平、受調(diào)控的轉(zhuǎn)錄還需要基因特異性的活化子（activator）?；罨邮且环N能夠激活基因表達(dá)的DNA結(jié)合蛋白。真核生物的活化子可以通過兩種途徑激活轉(zhuǎn)錄：促進(jìn)轉(zhuǎn)錄機(jī)器在啟動(dòng)子上的裝配；另一種方式是活化子募集核小體的修飾成分來改變基因附近染色質(zhì)的性質(zhì)，以利于聚合酶的結(jié)合。 2、抑制子大多數(shù)真核生物的轉(zhuǎn)錄因子都是促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的活化子。然而，在真核細(xì)胞中也存在著對(duì)轉(zhuǎn)錄有抑制作用的轉(zhuǎn)錄因子，即抑制子。一些抑制子在DNA分子上的結(jié)合位點(diǎn)與活化子的結(jié)合位點(diǎn)存在重疊，也有一些抑制子的結(jié)合位點(diǎn)

36、轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)重疊。因此，當(dāng)它們與DNA結(jié)合時(shí)就會(huì)阻止與轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合。然而，在很多情況下真核生物的抑制子并非是通過直接干擾活化子或者轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合來發(fā)揮作用的。與活化子一樣，抑制子可以通過招募核小體修飾酶或者與轉(zhuǎn)錄機(jī)器直接作用抑制轉(zhuǎn)錄。抑制子和活化子招募不同的核小體修飾酶。例如，抑制子招募的組蛋白去乙?；溉コM蛋白N端的乙?；鶃硪种妻D(zhuǎn)錄。下面我們通過一個(gè)具體的例子來說明抑制子是如何抑制轉(zhuǎn)錄的。同E.coli一樣，酵母細(xì)胞只有在葡萄糖不存在時(shí)才能合成代謝半乳糖所需要的酶。那么，葡萄糖是如何影響Gal基因的表達(dá)的呢？如圖，GAL1為一參與乳糖代謝的基因，在GAL1和

37、UASG之間有一抑制子Mig1的結(jié)合位點(diǎn)。在葡萄糖存在時(shí)，Mig1通過募集Tup1抑制復(fù)合體抑制GAL1基因的表達(dá)。Tup1抑制復(fù)合體也能被多種抑制轉(zhuǎn)錄的酵母DNA結(jié)合蛋白所募集。在哺乳動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了Tup1抑制復(fù)合體的對(duì)應(yīng)物。有兩種假說來解釋Tup1的抑制作用：其一，Tup1募集組蛋白去乙?；福灌徑暮诵◇w脫乙?；?；其二，Tup1在啟動(dòng)子部位與轉(zhuǎn)錄機(jī)器直接作用抑制轉(zhuǎn)錄。第四節(jié) 轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié) 真核生物基因的轉(zhuǎn)錄受活化子和阻遏蛋白的調(diào)控。在多細(xì)胞有機(jī)體中，一個(gè)基因的表達(dá)模式在很大程度是由轉(zhuǎn)錄因子和基因調(diào)控序列相互作用決定的。因此轉(zhuǎn)錄因子的作用就必須受到控制。 一、激素對(duì)轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)

38、節(jié)1、脂溶性激素對(duì)轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié) 某些轉(zhuǎn)錄因子的活性受到激素的調(diào)節(jié)。激素是由特定的細(xì)胞分泌，通過血液循環(huán)作用于有機(jī)體不同部位的靶細(xì)胞。有一類激素為脂溶性小分子，它們可以穿過細(xì)胞膜和核膜，與細(xì)胞內(nèi)的受體結(jié)合。脂溶性激素，包括各種類固醇激素(steroid hormones)、類視黃醇（retinoid）和甲狀腺素（thyroid hormones）等。這些分子在分子結(jié)構(gòu)上差別很大，但它們的作用機(jī)制相似。在細(xì)胞內(nèi)這些信號(hào)分子與它們的受體結(jié)合后，激活受體。被激活的受體作為轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。糖皮質(zhì)激素受體是第一個(gè)被純化，并被證明具有DNA結(jié)合能力的類固醇激素受體。糖皮質(zhì)激素受體

39、的純化使人們能夠克隆編碼受體的cDNA和基因組DNA。緊接著，又有多種脂溶性激素受體的基因被克隆，其中包括雌激素、孕酮、甲狀腺素和維生素D受體的基因。 在沒有糖皮質(zhì)激素存在的情況下，受體與抑制蛋白結(jié)合，游離在細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)糖皮質(zhì)激素穿過細(xì)胞膜，在細(xì)胞質(zhì)中與受體結(jié)合后，導(dǎo)致受體與抑制蛋白分離，然后受體二聚化，并進(jìn)入細(xì)胞核。受體上的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與激素應(yīng)答元件結(jié)合，激活目標(biāo)基因。 與糖皮質(zhì)激素受體不同，類固醇激素受體的其他成員在細(xì)胞核中與抑制蛋白結(jié)合。與激素專一性地結(jié)合后，受體釋放出抑制蛋白。二、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子活性的控制 盡管脂溶性激素能夠穿過細(xì)胞膜直接與細(xì)胞或者細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，然而多

40、肽類和蛋白質(zhì)類激素卻不能穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，而是首先與細(xì)胞表面專一性的受體結(jié)合，將信號(hào)傳入細(xì)胞。這些激素受體是跨膜蛋白，胞外區(qū)有激素的結(jié)合位點(diǎn)。激素的結(jié)合導(dǎo)致受體構(gòu)象的變化，引發(fā)胞內(nèi)的生化事件，并且最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的活化和基因表達(dá)的變化。我們首先以干擾素（interferon）和白細(xì)胞介素（interleukins）等細(xì)胞因子來說明胞外信號(hào)是如何引起基因組應(yīng)答的。干擾素和白細(xì)胞介素等許多細(xì)胞因子都是胞外的信號(hào)多肽。它們與其表面受體結(jié)合導(dǎo)致一種轉(zhuǎn)錄因子STAT（signal transducer and activator of transcription）的活化，使其靠近C末端的一個(gè)酪氨酸殘基磷酸化。如果細(xì)胞表面受體是酪氨酸激酶家族的成員，則它能直接激活STAT。如果它