生物競賽-生物化學39蛋白質的生物合成及其在細胞內的降解-頂級課件《生物化學原理(第二版)(三)(79張)》

1、第三十九章 蛋白質的生物合成及其在細胞內的降解提綱參與翻譯的主要生物大分子翻譯的一般特征翻譯的詳細機制細菌的蛋白質合成真核生物的細胞質翻譯系統(tǒng)細胞器翻譯系統(tǒng)古菌的翻譯系統(tǒng)mRNA的質量控制翻譯的抑制劑蛋白質在細胞內的降解核糖體的主要功能定位A部位氨酰tRNA結合部位，也稱為受體部位；P部位肽酰tRNA結合部位；E部位空載tRNA臨時結合的部位；肽酰轉移酶活性部位催化肽鍵形成的部位；mRNA結合部位；多肽鏈離開通道正在延伸的多肽鏈離開核糖體的通道；一些可溶性蛋白質因子（起始因子、延伸因子和終止因子）的結合部位。核糖體的分類與組成 核糖體的三維結構模型和主要的功能部位原核細胞核糖體的各種功能部位細

2、菌核糖體的各種功能部位真核細胞多聚核糖體的結構細菌多順反子mRNA和真核生物單順反子mRNA的翻譯 tRNA的結構與功能二級結構與三級結構同工受體tRNA-攜帶同種氨基酸的不同tRNA個性- “第二套遺傳密碼”某些特殊的tRNAs起始tRNA: tRNAf Met 和 tRNAiMet校正tRNAtmRNA常見的tRNA的個性（大腸桿菌）tRNA個性丙氨酸絲氨酸纈氨酸谷氨酰胺苯丙氨酸異亮氨酸蛋氨酸受體莖中的G3:U70堿基對受體莖中G1:C72、G2:C71、A3:U70堿基對,D莖中的C11:G24堿基對反密碼子反密碼子,特別是其中的U反密碼子,D環(huán)中的G20, 3端的A73U35反密碼子一

3、種人工合成的保留有G3:U70的微螺旋仍能攜帶Ala氨酰-tRNA合成酶（aaRS）兩步反應機制：ATP + 氨基酸 (AA) - AA-AMP + PPi tRNA + AMP-AA - AA-tRNA + AMP 分類第一類 aaRS 第二類II aaRS校對機制- 在裝載氨基酸水平的質量控制aaRS是對氨基酸“身份”進行檢查唯一的場所 核糖體不在乎哪一種氨基酸與tRNA相連 實載的tRNA被修飾后仍然能起作用 裝載前和裝載后編輯 雙篩機制兩類氨酰-tRNA合成酶的催化機理兩類aaRS第一是單體酶，含有一個平行-折疊核心和由兩段同源的氨基酸一致序列HIGH和KMSKS組成的Rossman折

4、疊，該結構模體參與ATP的結合和酶的催化。此類 aaRS識別的tRNA個性通常包括反密碼子環(huán)內的核苷酸殘基和受體莖，一般在受體莖小溝一側與tRNA結合，緊握反密碼子環(huán)，將tRNA接受氨基酸的一端置于活性中心，最后總是先將氨基酸轉移到tRNA 3端腺苷酸的2-OH上，然后再通過轉酯反應轉移到3-OH 。由此類酶催化的氨基酸有Arg、Cys、Gln、Glu、Ile、Leu、Met、Trp、Tyr和Val。第二類通常為寡聚酶，具有另外的保守序列，由它們形成三種首尾相連的同源結構基序，其中第一種參與二聚體的形成，另一種是 “簽名”模體，由7段反平行的折疊、3段相鄰的-螺旋和一種不多見的負責結合核苷酸的

5、折疊組成，由它和第三種結構基序一起組成了酶活性中心的核心部分。這些酶結合tRNA分子的另一面（受體莖大溝一側），識別的個性不包括反密碼子環(huán)，最后總是將氨基酸轉移到tRNA3-端腺苷酸的3-OH上（苯丙氨酰-tRNA除外）。由此類酶催化的氨基酸有Ala、Asn、Gly、Asp、His、Lys、Phe、Pro、Ser和Thr。aaRS的校對機制裝載前編輯有時aaRS激活錯誤的氨基酸 正確的tRNA與酶的結合誘導aa-AMP的水解，而不是裝載 aa-AMP被轉移到酶的編輯中心而水解裝載后編輯有時 aaRS 激活錯誤的氨基酸，并將其轉移到tRNA上錯誤的aa-tRNA在被釋放之前被轉移到酶的編輯中心水

6、解 雙篩機制難以建立完美的活性中心 活性中心和編輯中心層層把關，排除錯誤的氨基酸使用雙篩機制的實例-IleRS一篩：酶活性中心優(yōu)先結合正確的同源氨基酸，體積比同源氨基酸大的因為無法進入活性中心首先被排除；二篩：酶的編輯中心對錯誤的非同源氨基酸進行編輯，大小合適小的誤載的氨酰-AMP 或氨酰-tRNA在校對中心被水解“出局”。以 IleRS為例，如果Val進入它的活性中心，并發(fā)生了第一步反應，生成Val-AMP，但Val-AMP 會被送入編輯中心進行編輯，水解誤載的Val。由于aaRS具有內在的校對機制，因此在細胞內形成誤載的氨酰-tRNA的可能性非常低。氨酰-tRNA合成酶的雙篩機制輔助蛋白因

7、子蛋白質合成的每一步都需要一些特殊的可溶性的蛋白質因子的參與，包括起始因子（IF）、延伸因子（EF）、釋放因子（RF）和核糖體循環(huán)因子（RRF），它們分別參與肽鏈合成的起始、延伸、肽鏈釋放和核糖體循環(huán)。其中的某些蛋白質因子為小G蛋白。 細菌參與翻譯的起始因子、延伸因子和終止因子的結構與功能 真核生物參與翻譯的起始因子、延伸因子和終止因子的結構與功能 蛋白質生物合成的一般特征mRNA、tRNA和核糖體起相同的作用翻譯的極性：閱讀mRNA的方向都是從5端3端，多肽鏈生長的方向總是從N-端C-端。三聯體密碼 正確的氨基酸的參入取決于mRNA上的密碼子與tRNA上的反密碼子之間的相互作用，與tRNA所

8、攜帶的氨基酸無關 密碼子與反密碼子的相互識別遵守擺動規(guī)則在核糖體上同源tRNA的識別是誘導契合的過程 兔網質紅細胞3H-Leu在不同的時段完成標記純化全長的多肽降低溫度以降低翻譯的速率證明多肽鏈生長的方向總是從N-端C-端的實驗使用胰蛋白酶消化，分離肽段，用放射性對肽端位置作圖在保溫60分鐘后分離出的珠蛋白幾乎所有的Leu殘基都是帶放射性的。而在保溫僅幾分鐘后分離到的珠蛋白，其帶放射性的Leu則集中在肽鏈的C-端 實驗 (1962)：證明正確的氨基酸的參入與tRNA所攜帶的氨基酸無關 tRNACys-ACA反密碼子 (識別編碼Cys的UGU 密碼子)無細胞抽取物,氨基酸,aaRS Cys-tR

9、NACys-ACA蛋白質含有CysRNA模板UGUGUGUGUG.使用金屬鎳催化劑，去除巰基Ala-tRNACys-ACARNA模板UGUGUGUGUG.蛋白質含有Ala遺傳密碼的破譯 Marshall Nirenberg和Heinrich Matthaei 建立了大腸桿菌無細胞翻譯系統(tǒng)無細胞抽取物核糖體各種tRNA氨基酸aaRSATP, GTP+ mRNA = 蛋白質他們使用多聚核苷酸磷酸化酶得到同聚物破譯第一個遺傳密碼 在1961年，Matthaei發(fā)現，當將Poly U加到大腸桿菌無細胞翻譯系統(tǒng)中以后，一種僅由苯丙氨酸組成的多肽即多聚苯丙氨酸被合成了，這就意味著他們成功破譯出第一個密碼子

10、即UUU的密碼子。即：nNDPs (NMP)n + nPi破譯其余的遺傳密碼 在1964年，由Nirenberg發(fā)明的核糖體結合技術使得遺傳密碼最終完全得以破譯。該技術是建立在兩個基本的事實上：一是人工合成的三聚核苷酸可以作為模板；二是在無GTP時，三聚核苷酸可以促進同源的氨酰-tRNA結合在核糖體上，而不生成蛋白質。這樣，利用由核糖體和三聚核苷酸及其同源的氨酰-tRNA形成的三元復合物能被硝酸纖維素濾膜吸附的性質，可將結合的氨酰-tRNA與其它沒有結合的氨酰-tRNA分開。通過分析結合在硝酸纖維素濾膜上的氨酰-tRNA上氨基酸的性質和原來的三聚核苷酸序列可以弄清某種氨基酸的密碼子。19AAs

11、 + 14C-Pro + aaRSs核糖體結合技術使用NC濾膜過濾放射性在濾出液濾膜19AAs + 14C-Phe + aaRSs使用NC濾膜過濾放射性留在濾膜上濾膜標準的遺傳密碼表 遺傳密碼的主要性質 簡并與兼職密碼子的選定不是隨機的通用和例外不重疊無標點同一種氨基酸的不同密碼子使用的頻率不盡相同線粒體內遺傳密碼的例外擺動規(guī)則擺動規(guī)則由Crick于1966年提出，用來解釋一種tRNA反密碼子如何能夠識別一種氨基酸的幾個同義密碼子以及某些含有稀有堿基（如次黃嘌呤）的反密碼子是怎樣識別由正常堿基構成的密碼子的現象。該規(guī)則的內容是：密碼子在與反密碼子之間進行堿基配對的時候，前兩對堿基嚴格遵守標準的

12、堿基配對規(guī)則，第三對堿基則具有一定的自由度。但并非任何堿基之間都可以配對，當反密碼子第一位堿基是A或C者，只能識別一種密碼子；第一位堿基是G或U者，則能識別兩種密碼子；第一位堿基是I者，則能識別三種密碼子。擺動規(guī)則的意義在于使得在翻譯的過程中，tRNA和mRNA更容易分離。擺動規(guī)則反密碼子第一個堿基密碼子第三個堿基ACGUIUGC、UA、GA、C、U在核糖體上同源tRNA的識別是誘導契合的過程以細菌為例，在A部位上同源tRNA與mRNA的結合誘導A1492和A1493 從16SrRNA螺旋44的內部環(huán)中被擠出來，同時還造成通用保守的G530從原來的順式構象編成反式構象。在新的構象之中，A149

13、3和A1492分別與密碼子/反密碼子的前兩個堿基對螺旋相互作用，而G530 同時與反密碼子的第二個位置和密碼子的第三個位置相互作用。這些構象誘導變化的結果是密碼子/反密碼子的前兩個堿校對受到核糖體的檢查，以區(qū)分正確的Watson-Crick堿基對和錯配的堿基對，而“搖擺”位置似乎能夠容忍擺動規(guī)則允許的堿基對。大腸桿菌在翻譯的五個階段所必需的主要成分翻譯的詳細機制4步驟反應：氨基酸的活化起始延伸終止和釋放細菌的蛋白質合成 氨基酸的活化fMet-tRNAfMet的形成其他氨酰-tRNA的形成起始階段起始密碼子的識別起始復合物的形成 延伸階段：在起始復合物形成以后，翻譯即進入延伸階段，延伸階段所發(fā)生

14、的主要事件是進位、轉肽和移位且不斷的循環(huán)。多肽鏈合成的終止與釋放起始密碼子的識別細菌翻譯系統(tǒng)起始密碼子的識別主要是依賴于mRNA 5端的SD序列與16S rRNA3端的反SD序列之間的互補配對。SD序列位于起始密碼子上游約7個堿基的區(qū)域，由45個堿基組成，富含嘌呤堿基，它是由John Shine和Lynn Dalgarno在1974年，通過比較多種原核細胞蛋白質mRNA的5端核苷酸序列之后總結出來的。在16S rRNA 3端有一段富含嘧啶堿基的序列，可以和SD序列互補配對，因而被稱為反SD序列。許多實驗證明，正是SD序列與反SD序列的互補關系，才使得位于mRNA 的SD序列下游的第一個AUG用

15、作起始密碼子。 SD序列和反SD序列起始復合物的形成起始復合物的形成與起始密碼子的識別緊密聯系在一起，起始階段的總反應式可寫成： 30S + 50S + mRNA + fMet- tRNAfMet +IF1 + IF2 + IF3 + GTP 70SmRNAfMet- tRNAfMet + GDP + Pi + IF1 + IF2 + IF3在形成的三元復合物中，起始密碼子正好處于P部位，而fMet- tRNAfMet通過密碼子與反密碼子的互補作用定位于P部位，A部位是空著的，mRNA像一根細線一樣，通過小亞基上彎曲的通道，將作為模板進行翻譯。無活性的 70S核糖體SD 序列30S 起始復合物

16、70S起始復合物GDP + Pi多肽鏈合成的延伸每添加一個氨基酸需要三步反應進位、轉肽和移位 三步反應循環(huán)多次，循環(huán)的次數取決于mRNA上的密碼子的數目 原核生物和真核生物在延伸循環(huán)上非常相似 快：15-20個氨基酸/秒 精確：每參入10 000氨基酸出現1個錯誤 進位轉肽移位重復多肽鏈合成的延伸進位進位是指正確的氨酰-tRNA進入A部位，它是在EF-TuGTP的幫助下完成的。進位的具體過程是：首先EF-TuGTP和fMet-tRNAfMet以外的氨酰-tRNA形成三元復合物，隨后三元復合物進入A部位；氨酰-tRNA的結合導致小亞基的構象發(fā)生變化，致使16S rRNA上一段高度保守的堿基與密碼

17、子/反密碼子復合物前兩個堿基對上的小溝能夠緊密地發(fā)生作用，有利于確保正確的tRNA的結合。如果上述相互作用沒有能夠穩(wěn)定特定的核糖體構象，進入A部位的錯誤氨酰-tRNA 在肽鍵形成之前被釋放。核糖體上的一個結構域充當EF-Tu的GAP，該功能依賴于密碼子/反密碼子的相互識別而使得進入的氨酰-tRNA相對于大亞基處于一個正確的位置。一旦正確的氨酰-tRNA進入A部位，EF-Tu所具有的GTP酶活性就被激活，與它結合的GTP水解成GDP和Pi。當GTP水解以后，EF-Tu的構象發(fā)生較大的變化，這種構象的變化促進了EF-Tu的釋放。而EF-Tu的釋放引起氨酰-tRNA在核糖體上的重新排布，以便于肽鍵的

18、形成，為進入轉肽反應創(chuàng)造條件。釋放出來的EF-TuGDP在EF-Ts的催化下，由細胞質基質的GTP取代GDP而重新轉變成為有活性的EF-TuGTP。多肽鏈延伸過程中的進位和移位反應轉肽當正確的氨酰-tRNA進入A部位以后，緊接著就發(fā)生轉肽反應，由轉肽酶催化與A部位結合的氨酰-tRNA上的氨基N親核進攻與P部位結合的tRNA上的肽酰基或氨?；纬呻逆I。第一個肽鍵在甲酰甲硫氨酸和第二個氨基酸之間形成。轉肽反應牽涉到由23S rRNA上1個高度保守的腺苷酸參與的酸堿催化。該腺苷酸的周圍并沒有發(fā)現蛋白質。目前已有充分的證據表明，大腸桿菌的肽酰轉移酶由50S亞基上的23S rRNA承擔。轉肽酶活性中心

19、的腺苷酸嘌呤環(huán)的一個N通過抽取氨酰-tRNA的氨基N上的質子而促進轉肽反應。A2451在所有的已知23S rRNA中是絕對保守的，它處于特殊的微環(huán)境中，致使其pKa從7.6下降到4，能夠作為廣義的酸堿催化劑發(fā)揮作用，被抽取的質子在氨酰-tRNA上的酯鍵被切開后，供給P部位上tRNA上的羥基。蛋白質合成過程中的轉肽反應23S rRNA催化的轉肽反應轉肽酶是核酶的主要證據還沒有發(fā)現一種蛋白質單獨或者和其它蛋白質一起催化肽鍵的形成；小亞基的16S rRNA特殊的區(qū)域在A部位和P部位與反密碼子區(qū)域相作用。相反，大亞基的23S rRNA與肽酰-tRNA的CCA末端相作用，從而使之位于轉肽酶合適的位置；紅

20、霉素和氯霉素抑制轉肽酶的活性，但某些23S rRNA序列發(fā)生突變的菌株對這兩種抗生素具有抗性；核糖體的三維結構顯示轉肽酶的活性中心由RNA組成，最近的蛋白質離活性中心有2nm，這樣的距離太遠，不可能參與催化；人工篩選到的核酶能催化肽鍵的形成；碎片反應。23S rRNA催化的轉肽反應移位轉肽反應完成以后，P部位的tRNA成為空載的tRNA，空載的tRNA隨后進入E部位，與此同時，移位反應發(fā)生了，在A部位上形成的肽酰-tRNA同與其結合的mRNA一起移動到P部位，這為肽鏈延伸的下一輪循環(huán)做好了準備。注意在移位反應中，肽酰-tRNA上的反密碼子與密碼子的相互作用已不再是決定氨基酸特異性的因素，但是它

21、對于維持移位反應的準確性以保持正確的可讀框至關重要。移位反應需要EF-G的幫助，EF-G也是一種小G蛋白，其大小、形狀以及電荷分布與和氨酰-tRNA結合的EF-Tu相似。EF-GGTP在A部位附近與核糖體結合，推動移位反應的進行。EF-G-GTP的結合可能將帶有新生肽鏈的tRNA從A部位“推”到P部位，與此同時，空載的tRNA則從P部位轉移到E部位。既然tRNA與mRNA通過密碼子/反密碼子的堿基配對結合在一起，mRNA也就隨之發(fā)生移位。在移位過程中，GTP并不水解，只是在移位完成以后，核糖體再次充當EF-G的GAP，導致EF-G水解與其結合的GTP成為GDP和Pi。一旦GTP被水解，EF-G

22、立刻與核糖體解離。EF-G的解離是下一輪肽鏈的延伸反應所必需的，這是因為EF-G和EF-Tu與核糖體的結合位點部分重疊。在EF-G-GDP從核糖體上釋放出來以后，其分子本身的一個結構域似乎作為自己的GEF以再生出EF-G-GTP。翻譯過程中的分子模擬 EF-Tu和EF-G各自與核糖體結合的相互排斥 多肽鏈合成的終止與釋放隨著肽鏈的不斷延伸，位于mRNA上的終止密碼子最終進入A部位，由于沒有相應的氨酰-tRNA的結合，RF1或RF2便識別并結合上去，RF3又是一種小分子G蛋白，它與GTP形成的復合物RF3GTP促進RF1和RF2的作用。一旦釋放因子結合到A部位，核糖體上的肽酰轉移酶的活性就會發(fā)生

23、改變，它催化肽?；D移給水分子，導致肽酰-tRNA的水解，肽鏈因此被釋放出來。隨后空載的tRNA離開核糖體，釋放因子因為RF3的GTP酶活性將結合的GTP水解而得以釋放。最后，在RRF的幫助下，核糖體與mRNA解離，解離的核糖體進入下一輪翻譯。細菌多肽鏈合成的終止與釋放損傷mRNA的搶救合成細菌mRNA一般很快水解，其半壽期較短，因此，mRNA有很大的可能性丟掉了它的3-端。如果這種情況真的發(fā)生了，后果很可能非常嚴重。不妨設想，假定一個mRNA分子因此丟失了它的終止密碼子（基因突變也可以導致一個mRNA喪失終止密碼子），那么將沒有終止信號促進核糖體的解離。任何與這種有缺陷的mRNA結合的核糖體

24、當翻譯到斷裂的末端，將裹足不前，難以解離。E. coli和其它細菌已發(fā)展了一套專門的機制處理這些無終止密碼子的有缺陷的mRNA，這種機制為反式翻譯。反式翻譯不同于一般的順式翻譯，它將兩個mRNA翻譯成一條融合的肽鏈，其中有一個mRNA分子無終止密碼子，另一個mRNA分子是tmRNA。 tmRNA(10Sa RNA)的結構使用tmRNA 的反式翻譯真核生物的細胞質翻譯系統(tǒng)與細菌翻譯系統(tǒng)的差別核糖體的沉降系數為80S，比原核系統(tǒng)大；mRNA模板的結構差別很大，通常是單順反子，有帽子和尾巴，但沒有SD序列；轉錄和翻譯在時空上分離，分別發(fā)生在細胞核和細胞質，兩者不存在偶聯關系；起始tRNA不進行甲?；?/p>

25、，也不能進行甲酰化；只能使用AUG為起始密碼子，而且識別起始密碼子的機制也完全不同；起始階段不僅消耗GTP，還消耗ATP；起始因子的種類和結構更為復雜；肽鏈延伸的速度低于細菌，大概是每秒鐘參入2個氨基酸；只有2種釋放因子；對抑制劑的敏感性不同。真核生物的細胞質翻譯系統(tǒng)翻譯的詳細機制 氨基酸的活化此階段的反應與細菌翻譯系統(tǒng)沒有什么差別，所不同的是起始氨酰-tRNA并不進行甲酰化。起始與細菌差別較大延伸與細菌非常相似eEF-1 代替 EF-Tu和EF-TseEF-2 代替 EF-G終止與釋放與細菌相似，但沒有RRF真核生物的翻譯的起始 mRNA的準備和檢查 Met-tRNAiMet與核糖體40S小

26、亞基的結合 43S預起始復合物與mRNA復合物結合通過掃描發(fā)現起始密碼子 60S 亞基的結合與起始因子的釋放 mRNA的準備和檢查由于真核系統(tǒng)的mRNA要經歷復雜的后加工，所以翻譯系統(tǒng)首先需要對mRNA進行檢查，以確保只有加工完好的mRNA才能被用作模板。參與這一步反應的起始因子為eIF4系列，其中eIF4E為帽子結合蛋白，專門與mRNA的5端的帽子結合，eIF4G是一種接頭分子，既能與eIF4E結合，又能與結合在3端尾巴上的PABP結合，還能結合eIF3，使mRNA的5和3端在空間上相互靠近成環(huán)。mRNA的環(huán)化能很好地解釋poly A尾巴為什么能提高翻譯的效率：一旦核糖體完成翻譯通過poly

27、A成環(huán)的mRNA，新釋放的核糖體亞基所處的位置恰到好處，非常適合在同一個mRNA分子上重新啟動翻譯。在哺乳動物中，PABP結合到一種可以與eIF4A結合的mRNA結合蛋白PAIP-1上，加強mRNA的5端和3端相互作用，有助于核糖體識別并結合到mRNA的5端。一些翻譯調控因子可以直接結合到mRNA的3-UTR，與其它翻譯起始因子或者40S核糖體亞基相互作用，干擾mRNA 5-端和3端的相互作用，阻止或者減緩mRNA的翻譯。真核生物mRNA成環(huán)模型“掃描模型”40S小亞基首先識別帽子結構，然后沿著mRNA“遷移”，這個過程中核糖體可以解開穩(wěn)定性小于126 kJ的二級結構，但是穩(wěn)定性更高的發(fā)夾結構則可以阻止核糖體的遷移。當核糖體遷移到起始密碼子AUG的地方就停止遷移，通常以遇到的第一個AUG為起始密碼子，但是AUG本身并不足以阻止遷移，AUG必須在一個適當的環(huán)境中才能被有效識別，其中最重要的是-4位和+1位的堿基，在序列NNNPuNNAUGG中的起始密碼子可以被有效識別，在AUG之前第3位的嘌呤，以及緊跟著AUG的G，都可以影響翻譯效率達10倍以上。如果引導序列比較長，在第一個40S亞基離開起始位點之前，另一個40S亞基可以識別mRNA的5-端，從而在引導序列到起始密碼子之間結合多個核糖體亞